Содержание к диссертации
Список условных сокращений 4
Введение 6
I. Обзор литературы 12
1. Эндотоксиновый шок 15
1.1 Этиология и патогенез 15
1 ^Характеристика клеточного воспалительного ответа 17
-
Праймирование и активация фагоцитов 19
-
Образование активных форм кислорода фагоцитами 21
-
Цитокиновый каскад 22 1.3Элиминация эндотоксина 24
2. Структурные и функциональные элементы эндотоксина 25
2.10-антиген 25
2.2Кор 26
2.3Линид А 27
3. Белки, участвующие в переносе эндотоксина на его истинный рецептор
3.1 Белок, связывающий LPS (LBP) 28
3.2CD14 30
4. Роль рецепторов семейства TLR в проведении сигнала эндотоксина 31
4.ІТОІ1 32
4.2TLR2 и TLR4 35
4.3 Другие представители семейства TLR 36
4.4Краткая характеристика Toll-like белков 37
4.5Пути внутриклеточной сигнализации TLR 38
-
Доминирующие сигнальные пути TLR 38
-
Роль протеинкиназы С в проведении сигнала эндотоксина 42
5. Генный полиморфизм TLR4 у человека и мыши 43
II. Материалы и методы исследования 51
-
Образование радикалов кислорода фагоцитами мыши и человека при стимуляции эндотоксином in vivo и in vitro 51
-
Экспрессия мРНК сигнального рецептора эндотоксина TLR4 в фагоцитах мыши и человека при воздействии LPS 56
III. Результаты 61
1. Изучение функциональной активности фагоцитов на примере образования
активных форм кислорода при воздействии эндотоксина 62
-
Образование АФК фагоцитами крови при введении эндотоксина in vivo 63
-
Образование ЛФК перитонеальньши фагоцитами, стимулированными in vivo зимозаном 65
-
Образование АФК моиоиуклеарными клетками и моноцитами при стимуляции эндотоксином in vitro 71
-
Выявление содержания различных изоформ протеинкиназы С в моноцитах крови человека с помощью стандартных агентов 79
2. Изучение полиморфизма альтернативного сплайсинга TLR4 82
-
Выявление основных форм мРНК тТ1г4 и HTLR4 82
-
Определение способности праймеров специфически выявлять контакт между различными экзонами HTLR4 85
-
Экспрессия вариантов сплайсинга гена тТ\г4 86
-
Особенности экспрессии вариантов сплайсинга гена KTLR4 87
IV. Обсуждение результатов 90
Выводы 97
Список литературы 99
СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ
АФК - активные формы кислорода
ДАГ - диацилглицерин
ДВС - диссеминированное внутри сосудистое свертывание
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ЖКТ-желудочно-кишечный тракт
к.о. - килооснований
ЛВП - липопротеины высокой плотности
Мм - молярная масса
мРНК - матричная РНК (рибонуклеиновая кислота)
ҐПДР - полимеразная цепная реакция
СПИД - синдром приобретенного иммунодефицита
ССВО - синдром системного воспалительного ответа
УФ - ультрафиолет
цАМФ - циклический аденозинмонофосфат
ЭДТА - этилендиаминтетроацетат
bp (base pair) - пар оснований
BPI (bactericidal/permeability-increasing protein) - белок, усиливающий
бактерицидность/проницаемость
CD 14 (claster designation) - групповая метка
ECSIT (evolutionarily conserved signaling intemiediate in Toll pathways) ~
эволюционно консервативный сигнальный интермедиат в путях белка Toll
ERK. (extracellular-signal-regulated kinase) - киназа, регулируемая
внеклеточным сигналом
fMLP (formyl-met-ley-phe) - пептид формил-метионил-лейцил-фенилаланин
hTLR4 (human TLR4) - ген TLR4 человека
IL-1 (і - интерлейкин-1Р
INF-y - интерферон-у
iNOS (inducible NO-syntase) - индуцибельная NO-синтаза
IRAK (IL-I receptor accessory protein kinase) - протеинкиназа, связанная с
рецептором интерлейкина-1
JNK - Jun N-терминальная киназа
LBP (lipopolysaccharide-binding protein) - белок, связывающий LPS
LC (lucigenin) - люцигенин
LM (luminol) - люминол
LPS (Iipopolysaccharide) - липополисахарид, эндотоксин
МАРК (mitogen-activated protein kinase) - протеипкиназа, активированная
митогеном
MIF (migration inhibitory factor) - фактор, ингибирующий миграцию
тТ1г4 (mouse Tlr4) — ген Т1Ы мыши
NADPH (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate H) - восстановленная
форма никотинамидадениндинуклеотид фосфата
NF-кВ (nuclear factor - кВ) - ядерный фактор кВ
NIK (NF-кВ induced kinase) - киназа, индуцирующая NF-кВ
PAF (platelet activation factor) - фактор активации тромбоцитов
PI 3-киназа (phosphatidylinositol 3-кіпазе)-фосфатидилинозитол 3 киназа
РКС (protein kinase С) - протеинкиназа С
РМА (phorbol-12-miristatc-13-acelate) - форбол-12-миристат-13-ацетат
PRR (pathogen recognition receptors) - рецепторы, распознающие патогены
TAK-1 (TGFp-associated kinase 1)- киназа 1, связанная с TGFp
TGF-p (transforming growth factor P) -трансформирующий фактор роста p
TLR4 (Toll-like receptor 4) - Toll-подобный рецептор 4
TNF-ct (tumor necrosis factor a) - фактор некроза опухоли a
TRAF6 (TNF-receptor-associated factor) - фактор, связанный с рецептором
Zym (zymosan) - зимозан
Введение к работе
На сегодняшний день проводится большое количество исследований, посвященных бактериальному сепсису и связанному с ним септическому шоку. Это обусловлено высоким уровнем заболеваемости и летальности при данном патофизиологическом синдроме. Септический шок является ведущей причиной смертности в отделениях интенсивной терапии, причем около 50% летальных случаев обусловлено септическим шоком грам отрицательного происхождения (182, 105). В США ежегодно летальность при сепсисе составляет около 40% от числа заболевших, количество которых приближается к 750,000 человек (24). По данным Евросоюза, тяжелый сепсис и септический шок обусловливает до 146,000 смертей в год. Статистические данные свидетельствуют о том, что септический шок занимает 13 место в списке наиболее частых причин смерти (180).
Высокий уровень смертности и развитие тяжелых осложнений при септическом шоке связаны с отсутствием специфической терапии. В случае, если септический шок вызван грамотрицательными микроорганизмами, он возникает вследствие активации эндотоксинами патологических процессов, приводящих к рефрактерной гипотензии и полиорганной недостаточности, которые характеризуют синдром эндотоксинового шока. Применение бактерицидных антибиотиков при этом неадекватно: разрушение клеточной стенки грамотрицательных бактерий способствует высвобождению еще больших количеств эндотоксина (139, 5), играющего главную патогенетическую роль в этом синдроме. Моноклонарные антитела к эндотоксину или провоспалительным цитокинам (TNF-a и др.) признаны слабоэффективными в лечении грамотрицательного сепсиса (142). Наиболее часто применяется симптоматическая терапия, однако восполнение жидкости или препараты адреналина, применяемые на стадии развития необратимых симптомов септического шока, не купируют системную гипотонию, что связано с потерей чувствительности клеток к воздействию вазоактивных агентов (180, 118). В связи с вышесказанным, на сегодняшний день проблема терапии септического шока остается неразрешенной и требует поиска адекватных молекулярных мишеней воздействия.
В настоящее время широко изучается молекулярный патогенез эндотоксинового шока, тем не менее, многие его компоненты еще недостаточно исследованы вследствие сложности сигнальных каскадов эндотоксина и большого количества участвующих в них молекул. В частности, отсутствует исчерпывающая информация в вопросах взаимодействия LPS с клетками-мишенями, его внутриклеточных сигнальных каскадов и механизмов клеточной защиты организма.
Поскольку мишенями эндотоксина являются в основном клетки врожденного иммунитета (фагоциты), характер их функционального ответа во многом определяет развитие патофизиологических изменений в организме при сепсисе. Основной функцией фагоцитов является распознавание и удаление из организма чужеродных агентов. Поэтому активация этих клеток эндотоксином сопровождается усилением образования токсичных радикалов кислорода и провоспалительных цитокинов. Преимущественная выработка провоспалительных медиаторов относительно противовоспалительных может, в конечном счете, приводить к развитию синдрома системного воспалительного ответа, предшествующего септическому шоку (143). Такая неадекватная реакция фагоцитов может наблюдаться в случае, если клетки находятся в состоянии предактивации (праймирования), т.е. способны к выраженной активации при воздействии стимулирующим агентом (141). Механизм праймирования ответственных клеток неясен, и его роль в развитии осложнений сепсиса недостаточно изучена, среди российских публикаций эти данные практически отсутствуют.
Открытие в конце 90-х годов клеточного рецептора эндотоксина TLR4 (Toll-like receptor 4) значительно продвинуло исследователей в понимании взаимодействия эндотоксина с клетками и проведения его токсического сигнала. До этого было известно, что эндотоксин в крови взаимодействует с белком, связывающим LPS, LBP, и этот комплекс переносится на белок CD 14, заякоренный на поверхности клеток-мишеней LPS (158). Было установлено участие CD 14 в сигнализации эндотоксина, но отсутствие у этого белка трансмембранного домена не позволяло назвать его рецептором эндотоксина. Позднее было доказано, что TLR4 является обязательным условием сигнализации эндотоксина, его активация запускает сложную систему взаимодействия сигнальных молекул, что приводит к проявлению токсических эффектов эндотоксина (53).
Обнаружено, что белок TLR4 полиморфен и его разновидности обладают различной чувствительностью к эндотоксину (53, 150), что может обусловливать разную патофизиологическую реакцию у пациентов со сходным анамнезом и, соответственно, различные способы ее коррекции. Некоторыми авторами была показана экспрессия различных форм мРНК гена TLR4, образующихся в результате альтернативного сплайсинга во время транскрипции (96, 150). Последовательность мРНК, кодирующая белок TLR4, который выполняет функцию сигнального рецептора LPS, в настоящее время не установлена. Роль экспрессии других вариантов мРНК TLR4 в клетках-мишенях в ответ на воздействие эндотоксина также неизвестна. В связи с вышесказанным, была сформулирована цель настоящего исследования.
Цель исследования.
Изучить некоторые особенности функционального ответа клеток врожденного иммунитета мыши и человека на воздействие эндотоксина в опытах in vivo и in vitro.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи: 1. Изучить биологическую активность различных доз эндотоксинов при воздействии in vivo по функциональным ответам фагоцитов мыши.
Оценить функциональную активность моноцитов человека в зависимости от структуры эндотоксинов и условий их воздействия in vitro по образованию радикалов кислорода.
Установить наличие рецептора эндотоксина TLR4 в клетках врожденного иммунитета мыши и человека по экспрессии его мРНК при воздействии эндотоксина.
Выявить возможные полиморфные варианты мРНК TLR4 и исследовать особенности их экспрессии у мыши и человека.
Научная новизна.
В работе проведена оценка и сопоставление функциональных ответов клеток врожденного иммунитета на организмепном, клеточном и генетическом уровнях при воздействии бактериальным эндотоксином.
С помощью стандартных стимулирующих агентов осуществлен поиск некоторых внутриклеточных мишеней воздействия эндотоксина. Показано модулирующее влияние эндотоксина на внутриклеточный фермент протеиеікиназу С, который не является компонентом основного из известных сигнальных путей LPS. Также установлено, что активация клеток эндотоксином иницируется при предварительной стимуляции протеинкиназы С.
Впервые обнаружено 4 варианта альтернативного сплайсинга гена TLR4 в моноцитах человека. Проведена оценка роли различных вариантов мРНК TLR4 человека в условиях воздействия эндотоксином.
На основании полученных результатов предложена и клонирована последовательность мРНК TLR4, кодирующая полноценный белок, который выполняет функцию сигнального рецептора эндотоксина.
Практическая значимость работы.
Проведенные исследования расширяют известные данные о некоторых особенностях влияния эндотоксина на клетки-мишени и подчеркивают первостепенную роль функционального состояния клеток врожденного иммунитета в патогенезе септического шока. Полученные результаты создают предпосылку для использования данных методик в оценке вероятности развития выраженной воспалительной реакции у конкретного человека.
Выявление последовательности мРНК, ответственной за образование функционального белка TLR4, дает возможность для разработки новых методов коррекции сепсиса, вызванного грамотрицательными бактериями, на генетическом уровне.
Основные положения, выносимые на защиту.
Эндотоксин грам отрицательных бактерий сложным образом влияет на активность клеток врожденного иммунитета. При внутрибрюшинном введении он оказывает отложенный во времени (сутки) системный эффект, в то время как при непосредственном воздействии на клетки эндотоксин вызывает праймирование фагоцитов в более краткие сроки (1-4 часа). В обоих случаях для проведения эффекта эндотоксина было необходимо наличие белка плазмы LBP.
Эндотоксин и форболовый эфир оказывают взаимное модулирующее влияние на активацию моноцитов. В качестве общей внутриклеточной мишени их воздействия предложен фермент протеинкиназа С, участвующий в сигнальных путях обоих агентов.
Обнаружено 4 варианта альтернативного сплайсинга гена TLR4 человека и подтверждена экспрессия 2 вариантов альтернативного сплайсинга гена Т1г4 мыши.
4. Предложена последовательность мРНК, кодирующая сигнальный пептид TLR4, которая представлена экзонами 1-3-4. Высказано предположение о регуляторной роли экспрессии мРНК TLR4, содержащей стоп-кодон.
Апробация работы.
Материалы диссертации были представлены на VII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2000), II Российском Конгрессе по патофизиологии (Москва, 2000), Международной конференции «Критические технологии в реаниматологии» (Москва, 2003), Пироговской студенческой научной конференции (Москва, 2003), X Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2003), Научно-практической конференции «Инфекционные и паразитарные болезни в современном обществе. Клинико-лабораторное обеспечение инфектологии» (Москва, 2003), VII Всероссийском Форуме им. акад. В.И. Иоффе с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (2003), Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics (Киев, 2003), Ш конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2004).
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ.
Объем и структура диссертации.
Диссертация изложена на 119 страницах машинописного текста и иллюстрирована 26 рисунками и 2 таблицами. Состоит из введения, 4 глав (Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты, Обсуждение результатов), выводов, списка использованной литературы, включающего 190 источников.
