Введение к работе
Актуальность исследования
Воспалительные реакции организма играют исключительно важную роль в развитии большого количества патологических состояний и серьезных социально значимых заболеваний, таких как сепсис, атеросклероз, диабет, злокачественные новообразования, ишемические повреждения сердца и нейродегенеративные нарушения функций мозга В связи с этим, понимание молекулярных и клеточных механизмов воспалительной реакции и возможности ее модулирования является одной из фундаментальных проблем современной биологии и медицины
Актуальность данной работы определяется тем, что она посвящена изучению основного клеточного звена воспалительной реакции - макрофагов, и репрограмированию их воспалительных, стрессорных и апоптотических/некротических ответов
Макрофаги играют центральную регуляторную роль в инициации и развитии воспалительных реакций организма Это обусловлено способностью макрофагов воспринимать ничтожно малые количества патогенных бактериальных и вирусных продуктов как сигнал к активации Активированные макрофаги продуцируют свободные кислородные радикалы, оксид азота (NO), цитокины, кемокины и другие медиаторы воспаления Благодаря этому макрофаги обезвреживают патогенные бактерии и запускают каскад иммунных реакций, определяющих специфику врожденного и адаптивного иммунных ответов организма В зависимости от типа и количества действующего инфицирующего фактора, интактные макрофаги альтернативно приобретают специфический функциональный фенотип провоспалительный или анти-воспалительный Провоспалительный функциональный фенотип характеризуется усиленной продукцией провоспалительных цитокинов, таких как интерлейкин-1 (IL-1), IL-12, и фактор некроза опухолей-а (TNF-ct) Антивоспалительный функциональный фенотип характеризуется сниженной продукцией провоспалительных цитокинов и усиленной продукцией NO и анти-воспалительных цитокинов, таких как EL-10 Процесс трансформации функциональный фенотипа макрофагов был обозначен термином «репрограммирование» (Zhang et al, 1993)
В фокусе воспаления макрофаги функционируют в неблагоприятных условиях Для того чтобы противостоять токсическим эффектам, свободных радикалов, бактериальных продуктов (таких как липополисахариды (ЛПС), цитокинов, и гипертермии, сопровождающей воспаление, макрофаги активируют самозащитный стресс-ответ (Knight, 2000, Ishu, et al, 1999) Ключевым компонентом стресс-ответа являются белки теплового шока HSP70 (Bachelet, et al, 1998) Однако длительное время жизни макрофагов и избыточная продукция медиаторов воспаления может инициировать развитие
\^
разных заболеваний Для ограничения избыточного воспалительного ответа в макрофагах активируется апоптоз/некроз В регуляции стресс-ответа (Malyshev et al, 1999) и апоптоз/некроза (Albma et al, 1993) важную роль играет NO
Баланс между защитным стресс-ответом и апоптоз/некрозом определяет время жизни макрофагов и соответственно длительность их секреторной активности На начальных стадиях развития иммунного ответа, популяция макрофагов в организме неоднородна Она может состоять из макрофагов интактного, провоспалительного и антивоспалительного фенотипов Не исключено, что изменение баланса «стресс-ответ - апоптоз/некроз» в провоспалительных и антивоспалительных макрофагах играет важную роль в выборе между провоспалительным или антивоспалительным направлением суммарной активности всей популяции макрофагов, и, следовательно, развитием или предупреждением большого количества заболеваний Однако важный вопрос о специфике баланса «стресс-ответ - апоптоз/некроз» в разных фенотипах макрофагов не изучен
Клеточные ответы макрофагов контролируются NO В макрофагах, NO синтезируется индуцибельной NO-синтазой (iNOS) в цитоплазме и свободно проникает через клеточные мембраны, взаимодействуя на своем пути с различными биологическими структурами как внутриклеточными, так и внеклеточными Соответственно, можно предположить, что NO может проявлять различные эффекты на клеточные ответы в зависимости от того, на какие преимущественно мишени внеклеточные и на поверхности клеток или внутриклеточные он действует Однако и этот важный вопрос NO-зависимой регуляции воспалительной реакции макрофагов и других клеточных ответов также не изучен
Неадекватный воспалительный ответ является главным первоначальным звеном в развитии легочного саркоидоза, ревматоидного артрита и других болезней Воспалительная реакция всей популяции макрофагов зависит от соотношения в ней провоспалительных и антивоспалительных макрофагов В соответствии с этим, оценка фенотипа макрофагов вовлеченных в воспалительный процесс и возможность модулирования секреторной активности всей популяции макрофагов с помощью избирательной гибели конкретного «патогенного» фенотипа могло бы иметь большое научное и клиническое значение Однако эти вопросы до последнего времени также не были изучены
Обозначенные выше открытые вопросы регуляции воспалительной реакции ограничивают наше понимание развития иммунного ответа в целом и возможности коррекции неадекватного воспаления при развитии широкого спектра заболеваний
Цель и задачи исследования
Цель настоящего исследования состояла в изучении стрессорных и апоптотических/некротических ответов разных фенотипов макрофагов, NO-зависимой регуляции этих клеточных ответов и возможности направленного модулирования воспалительной реакции макрофагов у больных людей В рамках этой цели решались следующие основные задачи
Оценить стресс-ответ и апоптоз/некроз, индуцируемый ЛПС в интактном, про- и антивоспалительном фенотипах макрофагов,
Оценить стресс-ответ и апоптоз/некроз, индуцируемый S aureus в разных фенотипах макрофагов,
3 Оценить стресс-ответ и апоптоз/некроз, индуцируемый физическим
фактором (тепловой шок) в интактном, про- и антивоспалительном фенотипах
макрофагов,
Изучить роль внутри- и внеклеточного NO в стресс- и апоптоз/некроз-ответах разных фенотипов макрофагов при действии биологических (ЛПС и S aureus) или физических (тепловой шок) факторов,
Изучить возможности избирательного модулирования стресс-ответа и апоптоз/некроза в разных фенотипах мышиных макрофагов,
Идентифицировать фенотип макрофагов, пациентов с воспалительным заболеванием,
7 Оценить возможность избирательного запуска апоптоз/некроза в
провоспалительных макрофагах пациентов с воспалительным заболеванием, с
целью коррекции секреторной активности всего пула макрофагов
Научная новизна исследования
Впервые показано, что нативные и провоспалительные макрофаги последовательно индуцируют стресс-ответ и апоптоз/некроз в ответ на стимуляцию ЛПС Макрофаги, антивоспалительного фенотипа, напротив, блокируют эти ответы Блокирование стресс-ответа в макрофагах антивоспалительного фенотипа происходит на уровне фактора транскрипции HSF1
Впервые установлено, что в отличие от ЛПС, компонента мембран грамотрицательных бактерий, S aureus, грамположительная бактерия вызывает стресс-ответ и апоптоз/некроз в макрофагах антивоспалительнного, но не провоспалительного фенотипа
Впервые установлено, что в отличие от ЛПС, тепловой шок вызывает стресс-ответ и последующий апоптоз/некроз в макрофагах антивоспалительнного, но не провоспалительного фенотипа
Впервые установлено, что вне- и внутриклеточный пулы NO играют разную роль в регуляции ЛПС-индуцированного стресс-ответа
внутриклеточный NO потенциирует, а внеклеточный угнетает его Эти эффекты NO не зависят от фенотипа макрофагов
Впервые установлено, что вне- и внутриклеточный NO играет дифференциальную роль в регуляции ЛПС-индуцированного апоптоз/некроза в интактном и провоспалительном фенотипах макрофагов внутриклеточный NO играет про-апототическую/некротическую роль, тогда как в антивоспалительном фенотипе - анти-апоптотическую/некротическую Внеклеточный NO защищает макрофаги от ЛПС-индуцированного апоптоз/некроза
Впервые установлено, что вне- и внутриклеточный NO играет разную роль в регуляции индуцированного S aureus стресс-ответа внутриклеточный NO потенцирует стресс-ответ в антивоспалительном фенотипе, а внеклеточный NO ограничивает развитие индуцированного S aureus стресс-ответа
Впервые установлено, что вне- и внутриклеточный NO играет анти-апоптотическую/некротическую роль при действии S aureus на антивоспалительный фенотип макрофагов В нативном и провоспалительном фенотипе, ни внутриклеточный, ни внеклеточный NO не вовлечены в анти-апоптотический/некротический эффект этих фенотипов макрофагов при действии 5 aureus
Впервые установлено, что вне- и внутриклеточный пулы NO играют разную роль в регуляции индуцированного тепловым шоком стресс-ответа Внутриклеточный NO потенцирует стресс-ответ в антивоспалительном фенотипе макрофагов, а внеклеточный NO не оказывает влияния
Впервые установлено, что вне- и внутриклеточный NO обладает анти-апоптотическим/некротическим действием при развитии индуцированного тепловым шоком апоптоз/некроза в антивоспалительном фенотипе макрофагов В нативном и провоспалительном фенотипе, внеклеточный NO также играет анти-апоптотическую/некротическую роль и подавляет развитие индуцированного тепловым шоком апоптоз/некроза В нативном и провоспалительном фенотипе макрофагов, внутриклеточный NO не вовлечен в анти-апоптотический/некротический эффект этих фенотипов при действии теплового шока
Впервые показано, что ш vitro с помощью избирательного элиминирования провоспалительных макрофагов можно менять характер секреторной активности всей популяции макрофагов, выделенных от больных с легочным саркоидозом
Теоретическое значение работы
1) открытие генерализованного феномена репрограмирования
стрессорного и апоптотического/некротического клеточных ответов
макрофагов при смене фенотипа их секреторной активности,
определение специфической роли внеклеточного и внутриклеточного N0 в регуляции клеточных ответов активированных макрофагов разных фенотипов, и
построение концепции о роли макрофагов в формировании иммунного ответа, в котором регуляторная роль макрофагов во врожденном и адаптивном иммунитете обеспечивается пластичностью макрофагальных клеточных ответов, проявление которых зависит от фенотипа макрофагов, от природы патогенного фактора и от концентрации внеклеточного и внутриклеточного NO
Практическое значение работы
Результаты работы открывают перспективы разработки новой стратегии коррекции неадекватного воспалительного процесса с целью терапии широкого спектра заболеваний Существо новой стратегии состоит в том, чтобы обеспечивать необходимый характер секреторной активности макрофагов (антивоспалительный или провоспалительный) с помощью селективного удаления из популяции in vitro «патогенетического» фенотипа, про- или антивоспалительного
Положения, выносимые на защиту
1 ЛПС-зависимое репрограммирование фенотипа макрофагов
обеспечивает специфическую перестройку механизмов, не только
воспалительного, но и стресс- и апоптоз/некроз-ответов Благодаря такой
перестройке обеспечивается пластичность макрофагов в модуляции своих
ответов, проявление которых зависит как от фенотипа макрофагов, так и от
природы активирующего фактора
Эффекты NO в регуляции клеточных ответов макрофагов зависят от их фенотипа, от modus operandi (внутри- или внеклеточного) и от природы действующего на макрофаги фактора
Избирательное элиминирование того или иного фенотипа макрофагов может быть одним из способов регуляции секреторной активности всей популяции макрофагов
Апробация работы Основные результаты проведенных исследований были представлены на 4 международной конференции «Hypoxia in medicine" (Geneva, Switzerland, 2001), на Всероссийском симпозиуме Физиологического общества (Казань, Россия, 2001), на Конференции в Cold Spring Harbor Laboratory «Molecular chaperones and the heat shock response» (Нью Йорк, США, 2002), на Российском конгрессе «Реактивные формы кислорода, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, Россия, 2005), на Международном Конгрессе по адаптационной медицине (Москва, 2006), на межлабораторных конференциях, на семинаре факультета фундаментальной медицины МГУ и на семинаре на кафедре патофизиологии лечебного факультета московского государственного медико-стоматологического университета Апробация работы проходила на заседании ученого совета ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунопатологии Росздрава
Личный вклад автора Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследовании, проведении экспериментов, анализе и обобщении полученных результатов В работах, выполненных в соавторстве, вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования от постановки задач, их экспериментально-теоретической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и докладах
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 200 страницах и состоит из введения, обзора литературы, результатов, их обсуждения и выводов Список литературы содержит 308 источников. Диссертация иллюстрирована 10 таблицами и 28 рисунками
