Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы . 8
1.1 Физиология нормального заживления кожи . 8
1.2 Способы лечения ран и их эффективность. 12
1.3 Применение матриксов в лечении ран . 17
1.3.1 Синтетические полимеры 19
1.3.2 Полисахаридные матриксы 22
1.3.3 Гели и матриксы с фибрином 23
1.3.4 Коллагеновые матриксы и их комбинация с клетками . 24
Глава 2. Материалы и методы 30
2.1 Характеристика клинических наблюдений . 30
2.2 Методы обследования и лечения пациентов . 33
2.3 Экспериментальное исследование 39
2.3.1 Модель обширного раневого дефекта 40
2.3.2 Характеристика экспериментальных групп 42
Глава 3. Экспериментальное обоснование применения биологических матриксов для лечения травматических ран у мышей . 45
3.1 Оценка влияния раневых покрытий на течение раневого процесса у мышей в фазе воспаления 47
3.2 Оценка влияния раневых покрытий на течение раневого процесса у мышей в фазе пролиферации 52
3.3 Оценка влияния раневых покрытий на течение раневого процесса у мышей на этапе эпителизации . 58
3.4 Сравнительный анализ использования различных раневых покрытий в экспериментальной модели раневого дефекта у мышей 62
Глава 4. Применение дермального матрикса в лечении больных с травматическими дефектами мягких тканей 66
4.1 Способ применения дермального матрикса 66
4.2 Результаты применения дермального матрикса у больных с травматическими дефектами мягких тканей и их обсуждение 71
Глава 5. Применение биологических матриксов в комбинации с аллогенными клетками в лечении больных с травматическими дефектами мягких тканей 74
5.1 Способ применения повязок на основе коллагена I типа с аллофибробластами в лечении больных с травматическими дефектами мягких тканей 75
5.2 Способ применения комбинации ММСК и дермального матрикса в лечении больных с травматическими дефектами мягких тканей 78
5.3 Результаты применения комбинированных раневых покрытий в лечении больных с травматическими дефектами мягких тканей и их обсуждение 83
Заключение . 86
Выводы 95
Практические рекомендации . 96
Список принятых сокращений 97
Список используемой литературы
- Синтетические полимеры
- Методы обследования и лечения пациентов
- Оценка влияния раневых покрытий на течение раневого процесса у мышей на этапе эпителизации
- Способ применения комбинации ММСК и дермального матрикса в лечении больных с травматическими дефектами мягких тканей
Синтетические полимеры
Повреждения кожи и подлежащих мягких тканей – распространенная проблема во всем мире. Только в США ежегодно такие раны возникают у 11 миллионов людей, причем около 300 000 обращаются за стационарной помощью [71, 147]. Показатели травматизма в РФ в 2007 г. составили 88,6 промилле, в 2008 г. – 88,2, в 2009 г. – 86,6; при этом частота открытых ран в 2009 г. составила 18,4 % [5].
Заживление травматических повреждений мягких тканей представляет собой хорошо организованный процесс, приводящий к прогнозируемому заживлению полученного дефекта. Основную роль в восстановлении целостности тканей играют тромбоциты, кератиноциты, клетки иммунной системы, фибробласты, эндотелиоциты [88, 148, 177].
В литературе описаны различные классификации течения раневого процесса. Классификация, разработанная в отделении ран и раневой инфекции Института хирургии им. А. В. Вишневского РАМН, выделяет фазу воспаления (период сосудистых изменений и очищения раны), фазу регенерации (образование и созревание грануляционной ткани) и фазу реорганизации рубца и эпителизации [22].
По классификации Института гистологии Падуанского университета заживление проходит стадии воспаления, репарации и ремоделирования (морфофункциональное восстановление утраченных тканей).
Г. И. Назаренко (2002) предложил классификацию, которая включает в себя стадию воспаления (альтерация, экссудация и вторичная деструкция), репарации (образование грануляций и их организация), ремоделирования (эпителизация рубца и его реорганизация). Процесс заживления раны можно условно разделить на четыре этапа: фазы коагуляции, воспаления, образования грануляционной ткани (пролиферативная фаза), а также фазу ремоделирования, или образования рубца [26]. В своей работе мы пользовались классификацией Института хирургии им. А. В. Вишневского. Несмотря на точное подразделение течения раневого процесса на фазы, необходимо помнить, что фазы перекрываются по времени, а не следуют одна за другой.
Фаза коагуляции/воспаления
Непосредственно после травмы тромбоциты начинают адгезировать к стенке поврежденного сосуда и запускают гемостатическую реакцию с активацией каскада свертывания крови, что предотвращает избыточное кровотечение и обеспечивает временную защиту поврежденной области. Накопленные исследовательские данные демонстрируют, что тромбоциты способны высвобождать более десятка различных факторов роста и цитокинов [183]. Ключевыми компонентами реакции выброса являются тромбоцитарный фактор роста (Platelet-derived growth factor PDGF) и трансформирующий ростовой фактор 1 и 2 (Transforming growth factor TGF-1 и TGF-2), которые привлекают в область раны клетки воспаления – лейкоциты, нейтрофилы и макрофаги [12, 39, 15, 110].
Лейкоциты и фагоциты высвобождают активные формы кислорода, обладающие противомикробным действием, и протеазы, которые очищают рану от бактерий и погибших клеток. Разрешение воспалительной фазы сопровождается апоптозом воспалительных клеток, происходящим в течение нескольких дней после травмы. Механизм разрешения воспалительной фазы в настоящее время изучен слабо. Однако результаты проведенных на сегодняшний день исследований указывают на роль в данном процессе противовоспалительных цитокинов [83, 104].
В клинической практике на фазу воспаления указывает активная экссудация из области раны, отек и гиперемия окружающих рану мягких тканей. При гистологическом исследовании на этом этапе можно наблюдать выраженную клеточную инфильтрацию, а также лейкостаз и полнокровие сосудов в подлежащих тканях.
Фаза пролиферации – образование грануляционной ткани
По мере стихания воспалительного процесса начинается фаза пролиферативного заживления. На этой стадии раневого процесса ростовые факторы, высвобожденные лейкоцитами и тромбоцитами, оказывают выраженное действие на эндотелиоциты, стимулируя ангиогенез, а также на фибробласты и кератиноциты, вызывая пролиферацию и миграцию. Для нормального течения процесса заживления необходима инициация и поддержание процессов ангиогенеза.
Ангиогенез в рамках раневого процесса начинается непосредственно после повреждения, когда наступает местная гипоксия в результате нарушения целостности кровеносных сосудов. Это приводит к образованию проангиогенных факторов. Центральными медиаторами индукции вызванного травмой ангиогенеза являются сосудистый эндотелиальный фактор роста (Vascular endothelial growth factor VEGF), фактор роста фибробластов 2 (Fibroblast growth factor FGF-2) и PDGF, которые на начальном этапе высвобождаются из тромбоцитов, а затем из клеток, представленных в тканях в области раны [8, 154, 49]. В ответ на выброс ростовых факторов эндотелиальные клетки разрушают базальную мембрану и мигрируют в область повреждения, пролиферируют и образуют межклеточные контакты с последующим формированием кровеносных сосудов [148, 89]. Продемонстрирована необходимость эндотелиальных клеток-предшественников (ЭКП) для реваскуляризации в области раны [107, 90, 116]. В норме ЭКП представлены в костном мозге и высвобождаются в кровоток в ответ на повреждение. В дальнейшем ЭКП внедряются в новообразованное микроциркуляторное русло. Мобилизацию ЭКП вызывают оксид азота, VEGF и матриксные металлопротеиназы [90]. Встраивание в новообразованные сосуды и возможная дифференцировка ЭКП находятся под контролем стромального фактора 1, а также инсулиноподобного фактора роста (insulin-like growth factors IGF) [84]. Несмотря на то что в значительной степени механизмы дифференцировки ЭКП не изучены, в настоящее время ясно, что они необходимы для нормального заживления раны и ангиогенеза.
В клинической практике с уменьшением признаков воспаления на дне раны начинают появляться островки грануляционной ткани, которые представлены новообразованными сосудами. Как правило, дно раны заполняется грануляционной тканью от краев дна раны к центру, и поверх грануляций начинается рост краевого эпителиального пласта. При гистологическом исследовании на этой фазе можно наблюдать множество вертикально ориентированных сосудов. В межклеточном пространстве преобладают фибробласты.
Методы обследования и лечения пациентов
Один из наиболее современных и продвинутых продуктов Apligraf разработан на основе инновационной работы по созданию клеточного эквивалента кожи с использованием коллагена [117, 169, 163]. Кратко процесс создания данного препарата можно представить как распределение фибробластов дермы в суспензии коллагена I типа крупного рогатого скота, что приводит к перераспределению структуры и повышению плотности коллагеновых фибрилл с формированием эквивалента дермальной сетки в течение 4–6 дней [25]. На поверхность дермального слоя помещают культуру кератиноцитов, подвергающихся воздействию воздушно-жидкой среды для ускорения созревания и кератинизации эпидермального слоя [70]. Таким образом, Apligraf содержит ключевые структуры и компоненты, свойственные человеческой коже.
В течение 14 дней наблюдается васкуляризация и прочная интеграция материала Apligraf. Продемонстрировано ускорение заживления ран при хронических язвах нижних конечностей вследствие венозной недостаточности и сахарного диабета [69, 136, 64, 173, 67, 163]. Другой двуслойный, содержащий клеточный компонент препарат, представленный на рынке, Orcel (Ortec International), состоит из пористой коллагеновой губки, с одной стороны покрытой коллагеновым гелем. Культуру фибробластов дермы выращивают на пористой части коллагенового матрикса, а кератиноциты располагают на покрытой гелем стороне, предотвращая их врастание в губку [75]. В ходе сравнительного исследования продемонстрировано ускорение заживления и уменьшение формирования рубцовой ткани при использовании Orcel [165]. В то же время данные по клиническому применению препарата сильно ограничены.
К наиболее распространенным формам выпуска коллагеновых повязок или матриксов для восстановления кожных покровов относятся гидрогель, губка и сетка [21]. Впервые коллагеновый гель был использован для оценки влияния клеточных сил на сокращение коллагена и последующее закрытие раны [171]. Работа с культурами клеток и клинические условия потребовали использования более плотных форм коллагена, таких, как сетки или губки с более высокой вязкостью и прочностью. Коллагеновые сетки, образовавшиеся в растворе коллагена, заселенном фибробластами, использовались для попытки создания слоя, подобного дерме, in vivo. Однако при трансплантации отмечалось сокращение коллагена почти на 20 %, что приводило к снижению эффективности покрытия области раны [61, 98]. Дегидратированные коллагеновые губки обычно производят путем высушивания коллагенового геля [105]. Коллагеновая губка представляет собой более твердый и прочный продукт, чем коллагеновый гель, позволяет обеспечить эффективную регенерацию кожи, что привело к разработке различных вариантов раневых покрытий на основе коллагеновой губки [174, 131, 165].
В то же время матриксы на основе коллагена обладают низкой биостабильностью и недостаточными механическими свойствами [171, 100, 106]. С целью улучшения механических свойств коллагеновой губки используют различные модификации с созданием перекрестных сшивок или комбинаций с другими природными или синтетическими полимерами, например хитозаном, полипролактоном, глюкозаминогликаном и др., для создания мостиков между волокнами или внутри волокон коллагена [42, 56]. В результате этого достигается улучшение механических свойств коллагенового матрикса, что предотвращает его сокращение в период выращивания культуры клеток и заживления раны, а также улучшает биостабильность и прочность при клиническом применении. Помимо улучшения механических свойств, интеграция компонентов ВКМ в коллагеновую матрицу, таких, как фибронектин, эластин, глюкозаминогликаны, играет важную роль в создании микроокружения и направленного роста клеток для ускорения заживления [73, 72, 139]. Фибронектин имеет особенно большое значение в прикреплении кератиноцитов и реэпителизации [73]. Глюкозаминогликаны представляют собой многофункциональные стимуляторы заживления, а также препятствуют контракции раны. По результатам исследований добавление хитозана в коллаген в качестве аналога глюкозаминогликанов препятствует разрушению коллагена и повышает механическую прочность, также приводя к ускорению заживления [125].
Y. K. Seo с соавт. в 2008 году разработали новый, более прочный препарат коллагенового матрикса для создания раневого покрытия. Коллагеновую губку укрепили путем внедрения в нее коллагеновой сетки, созданной благодаря многослойной укладке коллагена [138]. Путем создания перекрестных сшивок удалось добиться создания многослойной коллагеновой сетки. Проведенные исследования продемонстрировали повышенную прочность на растяжение по сравнению с традиционной коллагеновой губкой, а также более высокую скорость и плотность адгезии клеток к поверхности на фоне значительной клеточной инфильтрации через поры материала.
Оценка влияния раневых покрытий на течение раневого процесса у мышей на этапе эпителизации
Для подтверждения положительного влияния биологических матриксов на процессы регенерации выполнено экспериментальное исследование на мышах. В эксперименте поставлены следующие задачи: 1. изучить степень иммуногенности ДМ; 2. оценить влияние ДМ на процесс регенерации; 3. оценить влияние комбинации ДМ и прогениторных клеток на процесс регенерации; 4. изучить эффективность комбинации ДМ как с аллогенными, так и с аутологичными клетками.
Для решения первой задачи эксперимента создано две контрольных группы. В группе с отрицательным контролем в качестве раневого покрытия использовали аутологичную кожу (группа 2). В группе с положительным контролем использовали лиофилизированную кожу человека (группа 3). Ксенокожа является ксеногенным материалом. В этой группе ожидали показательную картину отторжения трансплантата.
С целью оценки иммуногенности ДМ, а также его влияния на процесс регенерации матрикс использовали в качестве раневого покрытия в 4-й группе. Поскольку ДМ изготавливается из кожи человека, он также является ксеногенным материалом. Однако его преимущество перед лиофилизированной кожей заключается в том, что из него удалены клетки, которые являются носителями антигенов. Поэтому при использовании ДМ в качестве раневого покрытия мы не ожидали реакции отторжения.
Для решения 3 и 4-й задач эксперимента использовали комбинацию ДМ с прогениторными клетками. Для подтверждения эффективности комбинации использовали как аутологичные клетки, источником которых служила собственная измельченная кожа, так и аллогенные клетки.
Для подтверждения возможности использования утильных тканей в качестве источника аутологичных прогениторных клеток проведено выделение и культивирование клеток из лоскута кожи, удаленного во время первичной хирургической обработки рвано-ушибленной раны плеча. После иссечения поврежденные ткани помещали в среду для культивирования клеток ДМЕМ с добавлением гентамицина (10 : 1) и сохраняли до трипсинизации 11,5 часов при температуре +40 С. В стерильном боксе фрагмент лоскута извлекали из транспортной среды, помещали в чашку Петри диаметром 90 мм и фрагментировали ножницами на кусочки 1–3 мм3. Измельченный материал трижды промывали физиологическим раствором, затем сливали промывную жидкость и добавляли 10 мл 0,25 % раствора трипсина, подогретого до 37 С. Чашку Петри с кусочками ткани и трипсином помещали в термостат с температурой 37 С на 30 минут.
После инкубации смесь пипетировали для выделения из кусочков ткани отдельных клеток и небольших конгломератов. Действие трипсина ингибировали добавлением эмбриональной сыворотки фирмы Gibco. Полученную смесь переносили в центрифужные пробирки и центрифугировали 10 минут при скорости 1000 об./мин.
Супернатант удаляли, а осадок ресуспендировали в питательной среде для культур клеток ДМЕМ с глютамином с добавлением 10 % эмбриональной сыворотки, гентамицина (40 мкг/мл) и инсулина (5 мкг/мл). В течение одной минуты давали осесть крупным кусочкам ткани, и после этого надосадочную жидкость распределили на 2 чашки Петри диаметром 40 мм, в одной из которых находилась повязка на основе коллагена I типа человека.
При осмотре капли клеточной суспензии, полученной в результате трипсинизации и окрашенной витальным красителем, обнаруживали скопления различных по морфологии живых клеток.
Спустя 8 суток после посадки первичной клеточной взвеси много округлых клеток разного размера прикрепилось ко дну чашки Петри, а часть из них – к находящимся во взвеси коллагеновым волокнам. Отмечали клетки, находящиеся в метаболически активном состоянии. Из мелких округлых клеток начали образовываться единичные фибробласты – вытянутые клетки веретеновидной формы. Наблюдали митотически делящиеся клетки. Через 9 суток после посадки первичной клеточной взвеси сформировался неплотный монослой клеток. Фибробласты образовывали «ячейки» сети, в которой располагались группы кератиноцитов. Через 11 суток после посадки первичной клеточной взвеси из крупных конгломератов клеток, прикрепившихся ко дну чашки Петри, образовалась монослойная, смешанная по составу культура, состоящая из фибробластов и кератиноцитов. Клетки продуцировали коллаген.
Таким образом, из утильных тканей, иссеченных при первичной хирургической обработке раны, можно получить жизнеспособные клетки, образующие при культивировании органоспецифические колонии. Получение жизнеспособных клеток подтверждает возможность использования утильных тканей в качестве источника аутологичных прогениторных клеток кожи. В первой группе для изучения характерной картины раневого процесса без влияния биологических раневых покрытий на процесс регенерации мы использовали влажную повязку.
Способ применения комбинации ММСК и дермального матрикса в лечении больных с травматическими дефектами мягких тканей
Несмотря на то что анализ результатов лечения пациентов с применением ДМ в качестве временного раневого покрытия уже выявил сокращение сроков подготовки раны к АДП, мы сочли целесообразным использовать комбинацию ДМ и стимулирующего компонента, поскольку результаты экспериментального исследования выявили перспективность комбинации ДМ с различными источниками ММСК. При использовании этой комбинации данные эксперимента показали значительное ускорение эпителизации раневой поверхности.
Получение аутологичных ММСК из костного мозга занимает от 14 до 21 суток. Для получения утильной кожи показания ограничены. По данным причинам в клинической практике мы применяли комбинацию ДМ с аллогенными клетками.
Для оценки эффективности применения комбинированных раневых покрытий провели сравнительный анализ результатов лечения пациентов второй подгруппы (10 пациентов), в лечении которых применяли повязку на основе коллагена I типа человека с аллофибробластами, и пациентов третьей подгруппы (7 пациентов), в лечении которых применяли комбинацию ММСК и ДМ. Способ применения повязок на основе коллагена I типа с аллофибробластами в лечении больных с травматическими дефектами мягких тканей
Повязку на основе коллагена I типа применяли на первые сутки после ПХО у всех пациентов второй подгруппы. Технику использования можно разделить на несколько этапов. 1 этап – подготовка раны. Предварительно выполняли санацию раны по вышеописанной методике (см. стр. 66–67). 2 этап – наложение повязки. После обработки раны повязку на основе коллагена I типа извлекали из чашки Петри и укладывали на дно раны таким образом, чтоб повязка укрывала всю раневую поверхность (см. рис. 34а). 3 этап – ведение раны. Поскольку повязка на основе коллагена представляет собой тонкую пленку с клеточным слоем, она не обладает механической прочностью. При снятии фиксирующего бинта повязка удаляется со дна раны вместе с бинтом. Во время перевязок оценивали наличие признаков воспаления, степень заполнения дна раны грануляционной тканью, рост краевого эпителиального пласта. Проводили санацию раны, после чего вновь накладывали повязку на основе коллагена. Смену повязок производили ежедневно. На курс лечения требовалось от 13 до 20 повязок на основе коллагена. После заполнения дна раны грануляционной тканью выполняли АДП.
Клинический пример
Пациентка Т. 55 лет, ИБ № 11249-11. Диагноз: рвано-укушенная рана левого предплечья. При поступлении был произведен туалет раны в условиях операционной. Площадь раны составила 150 см2, или 0,9 % п. т. Начат курс вакцинопрофилактики бешенства, проведена профилактика столбняка АС 1,0, ПСС 3000 МЕ. Пациентка была госпитализирована в отделение неотложной травматологии опорно-двигательного аппарата. На рис. 33 представлен вид раны при поступлении. Рисунок 33. Укушенная рана тыльной поверхности левого предплечья
В отделении пациентка получала антибактериальную терапию (Цефатоксим 1,0 в/м № 5). Проведено 10 сеансов УФО на перевязках и 10 сеансов ГБО. Ведение раны проводили вышеописанным способом с ежедневной сменой коллагеновых повязок (рис. 34а, б, в). В посевах из раны на 7-е сутки выявлен рост смешанной микрофлоры с преобладанием St.aureus. На 25-е сутки рана была подготовлена к АДП (рис. 34г). На момент выполнения АДП площадь раны сократилась до 130 см2, или 0,8 % п. т.
Данный клинический пример иллюстрирует недостатки повязок на основе коллагена I типа с аллофибробластами. Они не обладают достаточной механической прочностью и требуют ежедневной смены, что не способствует предохранению растущей грануляционной ткани и увеличивает опасность вторичного инфицирования. Несмотря на стимулирующее воздействие аллофибробластов, АДП свободным расщепленным лоскутом выполнили лишь на 26-е сутки с момента травмы.
5.2 Способ применения комбинации ММСК и дермального матрикса в лечении больных с травматическими дефектами мягких тканей
Особенность метода при использовании ММСК в качестве стимулирующего фактора заключалась в том, что их комбинация с ДМ выполнялась непосредственно в ране. Всем пациентам трансплантация ММСК выполнялась однократно на первые сутки с момента ПХО. Первым этапом выполняли подготовку раны в условиях перевязочной по вышеописанной методике. 2 этап – введение ММСК. После обработки раны производили трансплантацию аллогенных ММСК в виде суспензии, с концентрацией ММСК 1 млн/мл, из расчета 1 мл суспензии на 5 см2 площади раны. Трансплантация выполняли в дно раны и окружающие мягкие ткани при помощи инъекций на глубину 0,1–0,3 см с частотой 3 инъекции на 1 см2. 3 этап – наложение ДМ. Для создания путей оттока раневого отделяемого размороженный ДМ в стерильном лотке перфорировали по всей поверхности скальпелем с частотой одна перфорация в 5 мм на 1 см2. На подготовленную рану укладывали смоделированный по форме раны ДМ таким образом, чтобы края матрикса незначительно выступали за её края. Допускалось использование нескольких лоскутов матрикса. После наложения матрикс фиксировали стерильной марлевой повязкой.
4 этап – ведение раны после трансплантации ММСК и наложения матрикса. Первую перевязку после трансплантации и наложения матрикса выполняли через одни сутки. Во время перевязки оценивали наличие признаков воспаления, фиксацию ДМ к дну раны. После взятия мазка из раны на посев ДМ обрабатывали йодопироном или другим антисептиком. В дальнейшем перевязки выполняли один раз в 48 часов. На последующих перевязках оценивали наличие грануляционной ткани в перфорациях и рост краевого эпителиального пласта под ДМ. Сам матрикс со временем превращался в струп, который легко удалялся со дна раны.
5 этап – удаление матрикса. После того как краевой эпителиальный пласт прорастал под матрикс, приподнимая его края, матрикс удаляли. Как правило, к этому моменту всё дно раны покрывалось яркими мелкозернистыми грануляциями.
Клинический пример Больной К. 37 лет, ИБ № 26090-13. Поступил в приемное отделение НИИ СП им. Н. В. Склифосовского 08.12.13 г. с диагнозом: множественные огнестрельные ранения обоих бедер, инородное тело мягких тканей правого бедра. Касательное огнестрельное ранение левой половины передней брюшной стенки. Огнестрельные ранения нанесены из травматического оружия. На правом бедре рана расположена по передней поверхности диаметром 2,0 см. В верхней трети левого бедра рана расположена по наружной поверхности диаметром 3,0 см. После ПХО раны правого бедра и верхней трети левого бедра были ушиты без натяжения кожи и в дальнейшем зажили первично. Рана в нижней трети левого бедра по наружной поверхности, по-видимому, была нанесена под острым углом, так как представляла собой дефект кожи диаметром 8,0 см с неровными краями и участками явно нежизнеспособных тканей по периферии. Дно раны частично представлено поверхностной фасцией и подкожно-жировой клетчаткой. После хирургической обработки раны сформировался дефект тканей площадью 76 см2, или 0,5 % п. т. (рис. 35).
