Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные представления о патогенетических механизмах псевдотуберкулеза (обзор литературы) 14
1.1. Факторы патогенности возбудителя псевдотуберкулеза 14
1.2. Морфологические проявления псевдотуберкулеза 44
1.3. Роль иммуноцитокинов в инфекционном процессе при иерсиниозах 53
Глава 2. Материал и методы исследования 58
2.1. Экспериментальные исследования 58
2.1.1. Штаммы возбудителя, использованные в работе 58
2.1.2. Моделирование псевдотуберкулеза 58
2.1.3. Гистологические исследования 59
2.1.4. Электронно-микроскопическое исследование 59
2.1.5. Получение антигенов Y. pseudotuberculosis и специфических иммуноглобулинов 60
2.1.6. Метод торможения иммуноферментного анализа для определения количества антигена Y pseudotuberculosis 61
2.1.7. Метод непрямой иммунофлюоресценции для обнаружения Y pseudotuberculosis в парафинизированных срезах 62
2.1.8. Получение суперантигена Y. pseudotuberculosis 63
2.1.9. Получение культуры клеток цельной крови доноров 64
2.1.10. Определение уровня цитокинов 64
2.1.11. Определение влияния штаммов Y pseudotuberculosis на цитокинопродуцирующую способность культуры клеток цельной крови доноров 64
2.2. Клинические исследования 66
2.2.1. Характеристика обследованных больных 66
2.2.2. Полимеразная цепная реакция 69
2.3. Методы статистического анализа 73
Глава 3. Экспериментальные исследования закономерностей распространения возбудителя в организме, изменения структуры внутренних органов при инфицировании штаммами Y. pseudotuberculosis с плазмидами 47 MDa и 82:47 MDa 75
3.1. Использование метода непрямой иммунофлюоресценции для изучения распространения Y pseudotuberculosis в организме животных 76
3.2. Распределение антигена К pseudotuberculosis в гомогенатах органов экспериментальных животных 83
3.3. Морфология экспериментального псевдотуберкулеза 85
3.4. Влияние штаммов Y. pseudotuberculosis и Y enterocolitica, липополисахарида и суперантигена YPMa Y. pseudotuberculosis на продукцию иммуноцитокинов культурой клеток цельной крови доноров 108
Глава 4. Закономерности развития псевдотуберкулеза в зависимости от плазмидного спектра возбудителя 120
4.1. Влияние плазмид К pseudotuberculosis на клинические проявления псевдотуберкулеза в условиях вспышечного уровня заболеваемости 120
4.2. Оценка уровня иммуноцитокинов у больных псевдотуберкулезом в динамике заболевания 140
4.3. Анализ клинических проявлений псевдотуберкулеза в условиях спорадического уровня заболеваемости 148
4.4. Оценка эффективности различных методов лабораторной диагностики псевдотуберкулеза 158
Глава 5. Разработка концептуальной схемы патогенетических и саногенетических механизмов при псевдотуберкулезе и обоснование принципов ранней диагностики 175
Заключение 201
Выводы 215
Практические рекомендации: 217
Список литературы 218
- Факторы патогенности возбудителя псевдотуберкулеза
- Использование метода непрямой иммунофлюоресценции для изучения распространения Y pseudotuberculosis в организме животных
- Влияние штаммов Y. pseudotuberculosis и Y enterocolitica, липополисахарида и суперантигена YPMa Y. pseudotuberculosis на продукцию иммуноцитокинов культурой клеток цельной крови доноров
- Влияние плазмид К pseudotuberculosis на клинические проявления псевдотуберкулеза в условиях вспышечного уровня заболеваемости
Введение к работе
Инфекционный процесс представляет собой ограниченное во времени сложное взаимодействие биологических систем микроорганизма и макроорганизма, протекающее в определенных условиях внешней среды. В настоящее время все компоненты инфекционного процесса претерпевают непрерывные и существенные изменения, как за счет широкого распространения врожденных и приобретенных иммунодефицитов, так и из-за приобретения микроорганизмами новых патогенных свойств.
Патогенные микроорганизмы обладают целым набором факторов, препятствующих воздействию на них защитных механизмов хозяина - факторов патогенности. Основной задачей патофизиологии при изучении инфекционного процесса является выяснение механизмов, лежащих в основе бактериальных инфекций, исследование взаимодействия в системе возбудитель-макроорганизм, а также выяснение механизмов бактериальной патогенности с последующим практическим применением полученных знаний для разработки методов диагностики, лечения и профилактики заболевания.
Последние десятилетия ознаменовались значительными успехами в области молекулярной генетики микроорганизмов, что позволило с новых позиций подойти к изучению взаимодействия в системе паразит-хозяин. Особый интерес в этом плане представляют собой представители рода Yersinia. Патогенные представители этого рода являются близкородственными (степень генетического родства между Y. pseudotuberculosis и Y. pestis составляет 80% при 100% гомологии по плазмиде вирулентности), однако клинически заболевания протекают различно. Недавнее открытие у представителей рода Yersinia способности к III типу секреции изменило представление о данных микроорганизмах как об исключительно внутриклеточных патогенах [Anderson D.M., Schneewind О., 1999] . Полученные данные не согласуются с традиционными представлениями о патогенезе псевдотуберкулеза. Интенсивно изучается стратегия выживания данных бактерий в макроорганизме и процессы адаптации, позволяющие Yersinia преодолевать защитные механизмы хозяина. До сих пор остается не ясным влияние биологических свойств возбудителя, в частности его плазмидного спектра, способности к продукции суперантигена и других факторов патогенности, на молекулярные механизмы патогенеза псевдотуберкулеза, а также клинические особенности течения заболевания.
У различных штаммов Y. pseudotuberculosis описано 11 типов плазмид с молекулярной массой от 2 до 82 MDa, наиболее постоянными являются плаз-миды pYV 42-48 и pVM 82 MDa, что позволило Ф.Н. Шубину с соавт. [1989] отнести их к категории основных, а остальные - к дополнительным. В литературе широко освещается вопрос о роли плазмиды pYV 42-48 MDa в патогенности рода Yersinia. В частности, именно с этой плазмидой связывают способность Y. pseudotuberculosis к III типу бактериальной секреции, синтезу эффек-торных белков Yops, определяющих устойчивость к фагоцитозу и осуществляющих запуск апоптоза макрофагов [Cornells G. et al., 1998; Hueck C.et al., 1998]. Роль остальных плазмид остается недостаточно ясной. Особый интерес представляет плазмида с молекулярной массой 82 MDa, обнаруживаемая только у Y. pseudotuberculosis І серовара, который наиболее часто служит причиной заболевания у человека, и не встречающаяся у других представителей рода Yersinia.
В последнее время появились сообщения о способности штаммов Y. pseudotuberculosis, несущих плазмиду pVM 82 MDa, оказывать иммуносуп-рессивное действие [Волков Л.В. и др., 1991; Север И.С. и др., 1991; Север И.С, 1996], однако в доступной литературе нами обнаружены лишь единичные попытки связать наличие данной плазмиды в бактериальной клетке с морфологическими и клиническими особенностями течения псевдотуберкулеза.
Течение инфекционного процесса, степень тяжести и многообразие клинической симптоматики в значительной мере обусловлены иммуногенностью возбудителя. Клиническая картина и особенности течения инфекционных заболеваний напрямую зависят от уровней продукции про- и противовоспалительных цитокинов и их влияния на иммунорегуляторные и эффекторные иммунные механизмы. В настоящее время доказана ведущая роль провоспа-лительных цитокинов и баланса их с антагонистами в выраженности и направленности системной воспалительной реакции [Ковальчук Л.В. и др., 1997; Кетлинский С.А. и др., 1999; Кирдей Е.Г., 2000]. Однако в литературе недостаточно освещены вопросы цитокинопродукции при псевдотуберкулезе.
Недавно у Y. pseudotuberculosis установлена способность синтезировать суперантиген [Yoshino К. et al., 1994; Ito Y. et al., 1995]. Ранее считалось, что бактериальные суперантигены синтезируются только грамположительными кокками, такими как Staphylococcus aureus и Streptococcus pyogenes. В настоящее время с продукцией Y. pseudotuberculosis суперантигена YPMa связывают такие иммунопатологические осложнения псевдотуберкулеза, как реактивный артрит, синдром Рейтера, острый увеит, болезнь Крона, острая почечная недостаточность в результате острого интерстициального нефрита и синдром Кавасаки [Sato К. et al., 1983; Treacher D. et al., 1985; Saari K. et al., 1986; Davenport et al., 1987; Baba K. et al., 1991]. Открытие способности к синтезу суперантигена позволяет пересмотреть механизм появления некоторых патологических симптомов при псевдотуберкулезе.
Исходя из вышесказанного, представляет большое практическое и теоретическое значение изучение роли генетических элементов бактерий Y. pseudotuberculosis, а также их влияние на течение инфекционного процесса и клинические проявления заболевания.
Цель исследования: раскрыть неизвестные ранее патогенетические механизмы формирования псевдотуберкулеза, вызванного штаммами Y. pseudo- tuberculosis с различным плазмидным спектром и на этой основе обосновать принципы ранней клинической и лабораторной диагностики заболевания.
Для достижения поставленной цели последовательно решались следующие задачи:
Изучить закономерности развития морфологических изменений внутренних органов экспериментальных животных при заражении Y. pseudotuberculosis с плазмидами 47 MDa и 82:47 MDa.
Выяснить особенности циркуляции Y. pseudotuberculosis с плазмидами 47 MDa и 82:47 MDa в организме экспериментальных животных.
Установить особенности клинической картины псевдотуберкулеза, вызванного штаммами Y. pseudotuberculosis с плазмидами 47 MDa и 82:47 MDa.
Оценить цитокиновый ответ (IFN-a , IL-1, IL-6, TNF-a) культуры клеток цельной крови человека под воздействием липополисахарида, суперантигена YPMa и различных штаммов Y pseudotuberculosis.
Разработать концептуальную схему включения патогенетических механизмов развития псевдотуберкулеза, вызванного штаммами Y. pseudotuberculosis с плазмидами 47 MDa и 82:47 MDa.
Оценить целесообразность применения полимеразной цепной реакции с целью ранней диагностики псевдотуберкулеза в очагах, обусловленных циркуляцией Y pseudotuberculosis с плазмидами 82:47 MDa.
Основные положения, выносимые на защиту:
Наличие у возбудителя псевдотуберкулеза плазмиды с молекулярной массой 82 MDa определяет большую скорость распространения возбудителя и тяжесть патоморфологических изменений в организме экспериментальных животных.
Для заболевания, обусловленного Y pseudotuberculosis (47 MDa), характерно легкое и среднетяжелое течение, частое развитие экзантемы.
Для патологического процесса, вызванного Y. pseudotuberculosis (82:47 MDa), типично среднетяжелое и тяжелое течение, вовлечение в патологический процесс органов желудочно-кишечного тракта, печени, развитие артралгий.
Под действием штаммов К pseudotuberculosis (82:47 MDa) происходит угнетение продукции провоспалительных иммуноцитокинов (IL-1, IL-6, TNF-a) и IFN-a культурой клеток цельной крови доноров, позднее формирование иммуноморфологических изменений в белой пульпе селезенки экспериментальных животных, замедленное развитие гуморального иммунного ответа у больных, что свидетельствует о сниженной иммуногенности штаммов, несущих плазмиду с молекулярной массой 82 MDa.
Обоснована целесообразность использования полимеразной цепной реакции с целью ранней диагностики псевдотуберкулеза и разработана концептуальная схема включения патогенетических механизмов развития заболевания, вызванного штаммами Y pseudotuberculosis с плазмидами 47 MDa и 82:47 MDa.
Научная новизна:
Получены новые данные о патогенезе псевдотуберкулеза. Проведенные исследования расширили представления о факторах патогенности Y. pseudotuberculosis и формировании иммунологической реактивности под влиянием штаммов возбудителя псевдотуберкулеза с различным плазмидным спектром.
Установлено, что Y. pseudotuberculosis (82:47 MDa) обладает большей скоростью распространения в организме экспериментальных животных и вызывает более тяжелые патоморфологические изменения в кишечнике, печени и селезенке, чем Y. pseudotuberculosis (47 MDa).
Новыми являются данные о том, что заболевание, обусловленное штаммами Y. pseudotuberculosis (82:47 MDa) протекает тяжелее и характеризуется большей частотой вовлечения в патологический процесс органов желудочно-кишечного тракта, печени, селезенки и суставов, чем обусловленное Y pseudotuberculosis (47 MDa).
Впервые выявлен механизм влияния криптической плазмиды pVM 82 MDa на течение инфекционного процесса при псевдотуберкулезе, заключающийся в замедленном развитии иммуноморфологических изменений в белой пульпе селезенки экспериментальных животных, снижении выработки специфических антител против возбудителя заболевания, угнетении продукции иммуно-цитокинов (IFN-a, IL-1, IL-6, TNF-a) культурой клеток цельной крови доноров.
Впервые на модели культуры клеток цельной крови доноров исследован вклад отдельных факторов патогенности возбудителя псевдотуберкулеза (суперантигена YPMa, липополисахаридаГ. pseudotuberculosis) в воздействии на выработку провоспалительных иммуноцитокинов (IL-1, IL-6, TNF-a) и IFN-a. Доказано, что наибольшим потенциалом в воздействии на продукцию иммуноцитокинов обладает суперантиген YPMa Y. pseudotuberculosis.
Показано, что суперантиген YPMa и плазмиды pYV и pVM, действуя через изменение продукции цитокинов, являются существенными факторами патогенности Y. pseudotuberculosis.
На основании проведенного исследования разработана концептуальная схема патогенеза псевдотуберкулеза.
Доказана недостаточная эффективность традиционных методов диагностики псевдотуберкулеза (бактериологический анализ, РНГА) в очагах, обусловленных Y. pseudotuberculosis (82:47 MDa). Обоснована высокая эффективность исследования испражнений больных методом ПЦР с целью ранней диагностики псевдотуберкулеза в очагах, вызванных циркуляцией Y. pseudotuberculosis с плазмидами 82 и 47 MDa.
Теоретическая и практическая ценность
На основании экспериментальных и клинических исследований установлены принципиально различные механизмы формирования псевдотуберкулеза, распространения возбудителя в организме и закономерности морфологических изменений внутренних органов при псевдотуберкулезе, вызванном штаммами Y. pseudotuberculosis 47 MDa и 82:47 MDa. На этой основе разработана схема включения патогенетических и саногенетических механизмов развития псевдотуберкулеза и обоснована целесообразность применения ПЦР с целью ранней диагностики заболевания в очагах, обусловленных штаммами Y. pseudotuberculosis (82:47 MDa).
Апробация работы
Основные положения диссертации доложены на конференции молодых ученых МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского «Актуальные проблемы эпидемиологии, диагностики и клиники инфекционных заболеваний», г. Москва, 1991 г.; на конференции «Актуальные вопросы инфекционной патологии», г. Иркутск, 1993 г.; на заседаниях Иркутской региональной ассоциации врачей-инфекционистов, г. Иркутск, 1993, 1995, 2000, 2003 г.; на научной конференции сотрудников медико-профилактического факультета, посвященной 75-летию образования Иркутского государственного медицинского института, г. Иркутск, 1995 г.; на IV русско-японском международном симпозиуме, г. Иркутск, 1996 г.; на второй международной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера», г. Новосибирск, 2002 г.; на семинаре для медицинских работников г. Иркутска по клинике, диагностике, эпидемиологии и профилактике иерсиниозов, 2002 г.; на научно-практической конференции «Здоровье населения Иркутской области: проблемы и пути решения», г. Иркутск, 2003 г.; на научно-практической конференции, посвященной 80-летию кафедры инфекционных болезней Иркутского государственного медицинско- го университета, г. Иркутск, 2003 г.; на совместном заседании обществ патофизиологов и иммунологов г. Иркутска, 2003 г.
Внедрение результатов исследований
Полученные данные используются в учебном процессе на кафедре инфекционных болезней Иркутского государственного медицинского университета, в лечебной практике городской инфекционной больницы г. Иркутска. Метод ПЦР-диагностики псевдотуберкулеза внедрен в практику работы городской инфекционной больницы г. Иркутска. Материалы диссертации вошли в методическое пособие для инфекционистов, врачей поликлинических учреждений, эпидемиологов «Псевдотуберкулез. Клинико-эпидемиологичес-кие особенности и тактика обследования больных», изданное Центром Госсанэпиднадзора по Иркутской области и Комитетом здравоохранения администрации Иркутской области (Иркутск, 2003 г.).
Разработан способ определения цитокинопродуцирующей способности штамма возбудителя (заявка на изобретение № 2001119710/14 (020834) «Способ определения цитокинопродуцирующей способности штамма возбудителя» И.А. Шурыгина, А.В. Воропаев, В.Т. Климов, И.В. Малов, Е.Г. Кирдей. Приоритет от 16 июня 2001 г.), позволяющий оценивать иммуногенность возбудителей инфекционных заболеваний.
По теме диссертации опубликована 41 работа.
Объем и структура диссертации
Работа изложена на 269 страницах. Состоит из введения, обзора литературы, изложения материалов и методов, 3 глав собственного наблюдения, заключения и выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 58 рисунками и 27 таблицами, семью выписками из историй болезни. Список источников литературы включает 458 работ, из которых 180 работ отечественных и 278 - зарубежных авторов.
Работа выполнена на базе лаборатории кафедры инфекционных болезней ИГМУ (зав. каф. д.м.н., профессор И.В. Малов), отдела электронной микроскопии Центральной научно-исследовательской лаборатории Иркутского государственного медицинского института (зав. отд. д.м.н. проф. И.Ж. Се-минский), лаборатории эпидемиологического отдела (зав. отд. д.м.н., проф. А.С. Марамович) и лаборатории патофизиологического отдела (зав. отд. д.м.н., проф. Е.П. Голубинский) Научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока (директор д.м.н., проф. Е.П. Голубинский), МУЗ городской инфекционной больницы г. Иркутска (главный врач Л.И. Губанова), МУЗ городской инфекционной больницы г. Ангарска, инфекционных отделений ЦРБ г.г. Железногорска-Илимского, Усть-Илимска, Тулуна.
Факторы патогенности возбудителя псевдотуберкулеза
Исследования последних двух десятилетий дали реальную возможность для изучения и анализа факторов, определяющих различные фазы инфекционного процесса. Детерминанты вирулентности способствуют выживанию, размножению и распространению микроорганизма в тканях хозяина. Биологические свойства возбудителя оказывают определяющее воздействие на патогенез и значительно влияют на клинические проявления заболевания.
Возбудитель псевдотуберкулеза обладает большим набором факторов патогенности, часть из которых кодируется хромосомными генами, а часть -генами плазмид. Так, только плазмида вирулентности pYV с молекулярной массой 47 MDa кодирует более десятка белков, два из них являются истинными белками наружной мембраны, а остальные секретируются в культуральную среду. Хромосома бактерии кодирует два инвазина, термостабильный энтеро-токсин, суперантиген и систему утилизации железа.
Все факторы патогенности возбудителя псевдотуберкулеза по механизму действия можно разделить на несколько групп: I. Способствующие адгезии и инвазии в клетки хозяина; II. Вещества, обладающие ферментативной активностью; Ш.Экзо- и эндотоксины; IV. Обладающие функцией защиты от фагоцитоза; V. Способность к антигенной мимикрии. Адгезия является начальным элементом патогенеза многих инфекционных заболеваний. Адгезия возбудителя псевдотуберкулеза осуществляется при помощи целого набора факторов патогенности (это специальные органеллы микроба - пили; структуры оболочки - липополисахарид (ЛПС), порин; а также инвазии и адгезии). Наружная мембрана патогенных микроорганизмов обеспечивает контакт между патогеном и клетками-мишенями и играет важную роль в системе паразит - хозяин, ее компоненты могут принимать участие в адгезии бактерий. Полагают, что такие компоненты мембраны Y. pseudotuberculosis, как ЛПС, порин, липополисахариднобелковый комплекс усиливают адгезию и инвазию бактерий (рис. 1). У Y. pseudotuberculosis обнаружены пили - это филаментозные структуры, отходящие от поверхности бактерии. Они короче, тоньше и многочисленнее жгутиков. Пили адгезии представляют собой высокомолекулярную полимерную структуру, диссоциирующую при электрофорезе в полиакриламидном геле на белковые субединицы с молекулярной массой 16800. Пили обладают резкой гидрофобностью [Водопьянов СО. и др., 1984]. Способность Y. pseudotuberculosis к адгезии и инвазии в клетки эпителия кишечника кодируется хромосомальным регионом размером 3.2 kDa. Этот ген получил название inv-ген. Он экспрессирует инвазии - белок с молекулярной массой 108 kDa. Показано, что мутации в inv-гене обусловливают низкую вирулентность Y. pseudotuberculosis при заражении мышей per os [Schiemann D.A. et al., 1987; Isberg R.R., Falkow S., 1988; Miller V.L. et al., 1988.; Isberg R.R., Leong J.M., 1990; Pepe J.C. Miller V.L., 1990; Voorhis D.L. et al., 1991]. Подтверждением того, что хромосомальные гены кодируют способность к инвазивности, служит наблюдение Н. Fukushima et al. [1991], которые обнаружили, что штамм Y. pseudotuberculosis, изолированный из мезентериальных лимфоузлов ребенка, находившегося на лечении в клинике с диагнозом «острый мезентериальный лимфаденит», хотя и был лишен плазмиды вирулентности, сохранял способность к инвазии в клетки HeLa. По своей природе инвазии является белком наружной мембраны Y. pseudotuberculosis и состоит из 986 аминокислот [Ireton К., Cossart Р., 1998]. Он способствует проникновению Yersinia в клетки человека при помощи прикрепления к рецепторам на их поверхности. Мишенью для инвазина являются, по крайней мере, пять различных рецепторов, называемых интегринами. Интегрины представляют собой трансмембранные протеины, состоящие из а и (3 цепей, которые позволяют клеткам животных связываться с экстра-целлюлярным матриксом или другими клетками, а также микроорганизмами [Clark Е.А., Brugge J.S., 1995; Aderem A., Underbill D.M., 1999]. 20-kDa область инвазина связывается с рецептором на поверхности клетки хозяина и способствует проникновению возбудителя внутрь клетки. С интегринами взаимодействует домен инвазина, который является С-концом и состоит из 192 аминокислот. Взаимодействие инвазина с интегринами отличается высокой аффинностью [Brett S.J. et al., 1993; Fortineau N. et al., 1994; Leong J.M. et al., 1993, 1995; Saltman L.H. et al., 1996]. Специфические рецепторы интегрина, связывающие инвазии, могут принадлежать к различным животным белкам, таким как фибронектин [Saltman L.H. et al., 1996], и молекулам, которые участвуют в иммунном ответе при воспалении. Кроме того, для проникновения бактерии в клетку требуются еще три дополнительных фактора. Изучение мутанта одного из интегриновых рецепторов показали, что структура клеточной оболочки, называемая клатрин (clathrin), взаимодействует с интегриновым рецептором в ходе прикрепления бактерии, вероятно через белок, называемый адаптин АР-2, который облегчает связь между рецептором и клатрином [Tran Van Nhieu G. et al., 1996]. Если этого взаимодействия не произошло, бактерия не может проникнуть внутрь клетки. Третья структура, участвующая в данном процессе, - цитоскелет клетки-хозяина (рис. 2).
Использование метода непрямой иммунофлюоресценции для изучения распространения Y pseudotuberculosis в организме животных
С помощью метода непрямой иммунофлюоресценции изучали влияние плазмидного спектра Y. pseudotuberculosis на распространение возбудителя в организме животных. Исследовали печень, селезенку, терминальный отдел тонкого кишечника мышей, инфицированных различными штаммами возбудителя.
Показано, что у животных, зараженных одноплазмидным (47 MDa) штаммом возбудителя, через 1 сутки после заражения в изучаемых органах специфического свечения не обнаружено (рис. 8). У мышей, инфицированных двухплазмидным (82:47 MDa) штаммом Y. pseudotuberculosis, уже через 1 сутки после заражения обнаружено небольшое количество бактерий на поверхности ворсин терминального отдела тонкого кишечника (рис. 9) и единичные бактерии в селезенке. В паренхиме печени специфического свечения не выявлено. Через 2 суток после заражения животных одноплазмидным штаммом возбудителя (47 MDa) выявлялись единичные бактерии в просвете тонкого кишечника (рис. 10). В печени и селезенке специфического свечения не зарегистрировано. У животных, инфицированных двухплазмидным штаммом (82:47 MDa), в этот же срок обнаружено большое количество палочко- и кокковидных специфически светящихся бактерий в просвете кишечника (рис. 11) и единичные бактерии в селезенке. В печени возбудитель не обнаружен. Через 3 суток после заражения животных штаммом, несущим только одну плазмиду (47 MDa), обнаружено большое количество бактерий в просвете кишечника, единичные бактерии в селезенке. В печени специфического свечения не найдено. У животных, инфицированных двухплазмидным штаммом Y. pseudotuberculosis (82:47 MDa), через 3 суток после заражения количество бактерий в просвете кишечника снижалось, появлялись единичные бактерии в стенке терминального отдела тонкого кишечника, а также в паренхиме печени. Кроме этого мы продолжали наблюдать бактерии в селезенке. Через 4 суток после заражения у животных, инфицированных одноплаз-мидным штаммом К pseudotuberculosis (47 MDa), продолжали наблюдать бактерии в просвете кишечника и в селезенке, кроме того появлялись единичные бактерии в кишечной стенке. В печени специфического свечения не зарегистрировано. У животных, инфицированных двухплазмидным штаммом (82:47 MDa), в этот срок сохранялись бактерии в просвете и стенке кишечника, единичные бактерии в селезенке. В паренхиме печени кроме одиночно лежащих бактерий обнаружены скопления возбудителя в центрах инфильтратов. Через 7 суток после заражения у животных, инфицированных одноплаз-мидным штаммом Y. pseudotuberculosis (47 MDa), количество бактерий в просвете кишечника уменьшалось. В селезенке обнаружено незначительное количество палочковидных специфически светящихся образований. В паренхиме печени впервые для данной группы экспериментальных животных зарегистрировано наличие возбудителя, который образовывал небольшие скопления в центрах инфильтратов. У животных, инфицированных двухплазмидным штаммом возбудителя (82:47 MDa), в этот срок количество бактерий в просвете кишечника также снижалось. Сохранялись скопления Y. pseudotuberculosis в центрах инфильтратов в паренхиме печени. В селезенке наблюдалось большое количество бактерий (рис. 12). Через 10 суток после заражения у животных, инфицированных одноплаз-мидным штаммом Y. pseudotuberculosis (47 MDa), количество бактерий в просвете кишечника увеличивалось на фоне деструкции ворсин. В печени и селезенке отмечены единичные бактерии. У животных, инфицированных двухплазмидным штаммом возбудителя (82:47 MDa), в этот срок обнаружено большое количество бактерий в просвете кишечника на фоне деструкции ворсин. В печени и селезенке зарегистрированы единичные бактерии. У павших животных обеих групп обнаружено огромное количество бактерий в просвете и стенке кишечника на фоне выраженной деструкции слизистой оболочки терминального отдела тонкого кишечника (рис. 13). В печени и селезенке зарегистрировано очень большое количество бактерий, образующих крупные светящиеся скопления (рис. 14, 15). Таким образом, нами показано, что возбудитель, имеющий две плазмиды (82:47 MDa), появляется в просвете терминального отдела тонкого кишечника уже через 1 сутки после заражения, а с 3 суток появляются бактерии в стенке кишечника. К 7 суткам количество бактерий в просвете кишечника уменьшалось, а к 10 - вновь увеличивалось на фоне деструкции ворсин.
У животных, инфицированных одноплазмидным штаммом возбудителя (47 MDa), бактерии обнаруживались в просвете кишечника со 2 суток, их количество во все сроки наблюдения было меньше, чем у животных, инфицированных двухплазмидным штаммом (82:47 MDa).
Влияние штаммов Y. pseudotuberculosis и Y enterocolitica, липополисахарида и суперантигена YPMa Y. pseudotuberculosis на продукцию иммуноцитокинов культурой клеток цельной крови доноров
Для оценки влияния различных факторов патоген ности Y. pseudotuberculosis на продукцию иммуноцитокинов мы исследовали уровни IL-1, IL-6, TNF-a и IFN-a в культуре клеток цельной крови доноров (контроль) и под действием ЛПС Y. pseudotuberculosis, супернатанта, содержащего суперантиген YPMa Y. pseudotuberculosis, живых штаммов иерсиний: Y. pseudotuberculosis (82:47 MDa), Y.pseudotuberculosis(47 MDa), бесплазмидного штамма Y. pseudotuberculosis (pYV-) и Y. enterocolitica (47 MDa). Уровень выработки исследуемых цитокинов определяли методом ИФА в супернатанте культуры клеток цельной крови доноров после суточной инкубации совместно с исследуемыми субстанциями.
В первой серии опытов мы определили концентрацию суперантигена YPMa, которая вызывала бы наибольшую выработку IFN-a (табл. 7). Поскольку только концентрация, эквивалентная дозе Y. pseudotuberculosis 10б м.к./мл, вызывала достоверное изменение продукции IFN-a культурой клеток цельной крови доноров по сравнению с контролем, в дальнейшем мы использовали именно эту концентрацию суперантигена YPMa. Во второй серии опытов мы определили концентрацию Y. pseudotuberculosis (82:47 MDa), которая вызывала бы максимальное изменение уровней продукции IL-1, IL-6 и TNF-a. В таблице 8 отражены полученные результаты. Как видно из таблицы 8, Y. pseudotuberculosis (82:47 MDa) в концентрации 106 м.к./мл достоверно стимулирует выработку исследуемых цитокинов по сравнению с контролем. В то время как под влиянием Y pseudotuberculosis (82:47 MDa) в дозе 103 м.к./мл уровень продукции цитокинов достоверно не менялся. В дальнейшем мы использовали для всех штаммов дозу возбудителя, равную 106 м.к./мл. Таким образом, подобранные для эксперимента дозы суперантигена YPMa и Y. pseudotuberculosis (82:47 MDa) оказались идентичными. В предварительных исследованиях мы показали, что ЛПС в концентрации 5-Ю мкг/мл значимо влияет на активность фагоцитоза культурой моно-нуклеарных фагоцитов селезенки крыс, тогда как в дозе 2.5 мкг/мл достоверных отличий по сравнению с контролем не зарегистрировано. А в дозе 20-30 мкг/мл ЛПС угнетает фагоцитоз (поглощение и респираторный взрыв) мононуклеарных фагоцитов [Воропаев А.В. и др., 2001]. Поскольку при получении ЛПС по методу Вестфаля в модификацией В.А. Кульшина с соавт. [1987], выход ЛПС составляет 5%, концентрация 5 мкг/мл получается из 107 убитых микробных клеток, поэтому доза ЛПС 5 мкг/мл эквивалентна количеству ЛПС, поступившем в кровь при гибели в крови 107 м.к./мл возбудителя. Именно эта доза и была использована в дальнейших экспериментах.
Сравнительная характеристика влияния живых штаммов Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica (в концентрации, равной 106 м.к./мл), ЛПС Y. pseudotuberculosis (в концентрации 5 мкг/мл) и суперантигена YPMa (в дозе, эквивалентной 106 м.к./мл) на продукцию иммуноцитокинов культурой клеток цельной крови доноров отражена в таблице 9.
Продукция IFN-a увеличивалась по сравнению с контролем под действием К pseudotuberculosis (82:47 MDa) в 1.25 раза (р 0.05), Y. pseudotuberculosis (47 MDa) - в 1.40 раза (р 0.05), бесплазмидного штамма Y. pseudotuberculosis (pYV-) - в 1.42 раза (р 0.05), Y. enterocolitica (47 MDa) - в 1.35 раза (р 0.05), ЛПС Y. pseudotuberculosis - в 1.60 раза (р 0.05), суперантигена YPMa Y. pseudotuberculosis - в 2.60 раза (р 0.01).
При этом ЛПС, суперантиген YPMa Y. pseudotuberculosis и все исследованные штаммы иерсиний, кроме Y. pseudotuberculosis (82:47 MDa), вызывали достоверное повышение продукции IFN-a культурой клеток цельной крови доноров. Уровень выработки IFN-a под действием штаммов Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica был достоверно меньше, чем индуцированный ЛПС Y. pseudotuberculosis. Максимальным же стимулирующим эффектом на выработку IFN-a обладал суперантиген YPMa Y. pseudotuberculosis, который увеличивал его продукцию в 1.62 раза больше, чем ЛПС (р 0.05) (рис. 45).
Таким образом, нами показано, что максимальным стимулирующим воздействием на выработку IFN-a обладает суперантиген YPMa Y. pseudotuberculosis, на втором месте стоит ЛПС У. pseudotuberculosis. В то же время живые штаммы иерсиний оказывают меньшее стимулирующее воздействие на выработку IFN-a культурой клеток цельной крови доноров.
Нами изучена продукция провоспалительных цитокинов IL-1, IL-6 и TNF-a культурой клеток цельной крови доноров. Продукция IL-1 увеличивалась по сравнению с контролем под действием У pseudotuberculosis (82:47 MDa) в 1.90 раза (р 0.05), У. pseudotuberculosis (47 MDa) - в 2.50 раза (р 0.05), бесплазмидного штамма У. pseudotuberculosis (pYV-) - в 2.36 раза (р 0.05), У enterocolitica (47 MDa) - в 2.15 раза (р 0.05), ЛПС У. pseudotuberculosis - в 3.34 раза (р 0.05), суперантигена YPMa У. pseudotuberculosis - в 4.36 раза (р 0.01).
Влияние плазмид К pseudotuberculosis на клинические проявления псевдотуберкулеза в условиях вспышечного уровня заболеваемости
При анализе данных литературы мы обратили внимание на значительные различия в течении псевдотуберкулеза в отдельных регионах страны. Экзантема наблюдается у 35% [Дмитровский A.M., Дмитровская Т.И., 1986] - 92-100% больных [Протасеня И.И., 1986; Махнев М.В., Терешков О.Г., 1989]. Гепато-мегалия встречается от 18.2-27.6% [Блюгер А.Ф. и др., 1986] до 86% наблюдений [Латенко Я.П. и др., 1986], увеличение размеров селезенки - от 9% [Марков И.С. и др., 1989] до 41% [Дмитровская Т.И., Дмитровский A.M., 1985], желтуха - от 5.5% [Нагорная Л.Е., 1973] до 57% [Зайденов A.M. и др., 1991]. Частота рецидивов заболевания составляет от 4.4-10.6% [Томилка Г.С. и др., 1989; Буланьков Ю.И., 1990] до 35-48% случаев [Марков И.С. и др., 1989; Махнев М.В., Терешков О.Г., 1989].
Последние достижения в изучении биологии Y. pseudotuberculosis позволяют предположить, что различия в клинической картине заболевания могут определяться биологическими свойствами возбудителя, в частности плазми-дами, несущими различные детерминанты патогенности. В то время как роль плазмиды вирулентности pYV 42-48 MDa к настоящему времени изучена достаточно хорошо, значение других плазмид Y. pseudotuberculosis в реализации патологического процесса остается недостаточно выясненным. Особый интерес представляет плазмида pVM 82 MDa, обнаруживаемая только у Y. pseudotuberculosis І серовара и не встречающаяся у других представителей рода Yersinia.
На территории Иркутской области выявлено два независимых друг от друга очага псевдотуберкулеза, отличающихся тем, что циркулирующий возбудитель У. pseudotuberculosis І серовара содержит разное количество плазмид: на северо-западе области выделяются одноплазмидные штаммы (pYV 47 MDa), на юге области - с двумя плазмидами (pYV 47 MDa и pVM 82 MDa) [Климов В.Т. и др., 1989, 1997].
Нами проведено изучение клинической картины псевдотуберкулеза в условиях вспышечного уровня заболеваемости в период с 1987 по 2001 г. В работу включены результаты анализа десяти вспышек псевдотуберкулеза. Из них пять зарегистрированы на северо-западе Иркутской области (1987, 1989, 1992, 1993, 2001 г.), выделены Y. pseudotuberculosis I серовара, имеющие плаз-миду pYV 47 MDa, и пять - на юге области (1987, 1988, 1992, 1995, 2001 г.), вызванные Y. pseudotuberculosis I серовара с плазмидами 82:47 MDa. Всего обследовано 416 больных (188 из северо-западного очага и 228 из южного).
Во всех случаях псевдотуберкулез характеризовался полиморфизмом клинических проявлений с явлениями общей интоксикации, экзантемой, поражением желудочно-кишечного тракта, печени и других органов. Однако частота отдельных симптомов заболевания, обусловленного одно- (47 MDa) и двухплазмидны-ми (82:47 MDa) штаммами Y. pseudotuberculosis, значительно различалась, что и определяло своеобразную картину отдельных вспышек псевдотуберкулеза. Данные об основных симптомах псевдотуберкулеза в северо-западном (47 MDa) и южном (82:47 MDa) очагах суммированы в таблицах 10 и 11.
У подавляющего числа больных заболевание начиналось остро, сопровождалось ознобом, повышением температуры тела, головными болями.
Одним из наиболее ярких симптомов периода разгара заболевания являлась сыпь. Этот патогномоничный для псевдотуберкулеза симптом достоверно чаще наблюдался у больных, от которых был выделен одноплазмидный возбудитель (47 MDa) по сравнению с больными, чье заболевание было обусловлено двухплазмидным возбудителем (82:47 MDa) (77.66% и 55.26% соответственно (р 0.0001). По-видимому, появление типичной экзантемы в разгар заболевания всего лишь у половины больных, чье заболевание обусловлено двухплазмидным штаммом Y. pseudotuberculosis (82:47 MDa), значительно затрудняет диагностику, особенно при спорадическом уровне заболеваемости.
У значительного числа пациентов в периоды начальных проявлений и разгара заболевания наблюдались симптомы поражения верхних дыхательных путей в виде насморка, сухого кашля, болей в горле при глотании, гиперемии задней стенки глотки, небных дужек, язычка, увеличения и разрыхленности миндалин. Данные симптомы встречались с одинаковой частотой в сравниваемых группах (65.43% и 67.11%).
Характерной особенностью течения псевдотуберкулеза являлось частое вовлечение в патологический процесс органов пищеварения. Поражение желудочно-кишечного тракта проявлялось в виде тошноты и рвоты, жидкого или кашицеобразного стула, болей в животе различной локализации.
