О характере эритропоэза в эритробластических островках костного мозга при экспериментальных анемиях Крестьянинова Ольга Густавовна

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы .

1.1. Эритропоэз и его регуляция 11

1.2. Роль и место эритробластических островков костного мозга в эритропоэзе в норме и при экспериментальных воздействиях 18

1.3. Характер изменений эритропоэза при острой кровопотере 28

1.4. Характер изменений эритропоэза при ожоговой травме 32

1.5. Поверхностный заряд клеток и его функциональная роль 38

ГЛАВА 2. Материал и методы исследования .

2.1. Использованные лабораторные животные и экспериментальные модели 47

2.2. Гематологические методы 47

2.3. Методы исследования эритробластических островков костногр'Гмозга, выделение и определение классов зрелости 48

2.4. Метод разделения корковой и осевой зон костного мозга бедренных костей крыс 49

2.5. Исследование электрофоретической подвижности эритробластических островков костного мозга ... 49

2.6. Методы оценки функционального состояния макрофагов эритробластических островков 50

2.7. Методы исследования селезенки 52

2.8. Оценка эритропоэтической активности плазмы крови... 53

2.9. Статистическая обработка материала 53

ГЛАВА 3. Изменения крови и кроветворения в костном мозге и селезенке при кровопотере .

3.1. Изменения периферической крови в динамике постгеморрагической анемии 55

Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук Страница Ne 2

3.2. Характер изменений процессов кроветворения в костном мозге 55

3.3. Состояние эритробластических островков при постгеморрагической анемии: количественный и качественный анализ 60

3.4 Изменения электрофоретической подвижности эритробластических островков 63

3.5 Характер функциональных сдвигов центральных макрофагов эритробластических островков 67

3.6. Состояние кроветворения в селезенке 69

ГЛАВА 4. Изменения крови и кроветворения в костном мозге и селезенке при ожоговой травме .

4.1. Изменения периферической крови в динамике ожоговой анемии 72

4.2. Характер изменений процессов кроветворения в костном мозге 74

4.3. Состояние эритробластических островков при ожоговой анемии: количественный и качественный анализ ; 77

4.4. Изменения электрофоретической подвижности эритробластических островков 81

4.5. Характер функциональных сдвигов центральных макрофагов эритробластических островков 83

4.6. Состояние кроветворения в селезенке крыс при ожоге... 85

4.7. Эритропоэтические свойства плазмы крови обожженных животных S8

ГЛАВА 5. Обсуждение полученных результатов .

Заключение.

Выводы 91

Список литературы 99

• Характер изменений эритропоэза при острой кровопотере
• Исследование электрофоретической подвижности эритробластических островков костного мозга
• Состояние эритробластических островков при постгеморрагической анемии: количественный и качественный анализ
• Характер изменений процессов кроветворения в костном мозге

Введение к работе

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ.

Жизненноважная роль, выполняемая в организме системой крови, определяет неослабевающий интерес экспериментаторов и клиницистов к углубленному изучению различных сторон ее функционирования. При этом, фундаментальным аспектом исследований продолжает оставаться проблема пролиферации и дифферен-цировки гемопоэтических клеток (А.Н.Фриденштейн, Е.А.Лурия, 1980; И.Л.Чертков, ОА.Гуревич, 1984; Б.В.Афанасьев, В.А.Алма-зов, 1985; T.M.Dexter et.al., 1984; J.Paulus, MAster, 1986; R.Schofield et.al., 1986; J.K.Fraser et.al., 1986; S.Tsai et.al., 1987; F.Hermann, R.Mertelsmann, 1989).

Анемии, характерным признаком которых является снижение содержания эритроцитов и количества гемоглобина в периферической крови, являются не только специфической гематологической патологией, но и симптомом различных органических поражений и заболеваний, представляя собой не только яркий пример нарушения пролиферативно-дифференцировочных процессов, но и удобную модель для их экспериментального изучения. В последние годы анемии стали предметом пристального внимания специалистов в области космической и радиационной медицины, экологии и онкологии (В.П.Карпенко, 1981; К.Р.Седов, Р.Н.Бутакова, 1984; Л.П.Кишева с соавт., 1984; Г.А.Алексеев, 1988; В.П.Дударев, 1988; БА.Велиев, 1989; Г.Б.Берлингер, 1990; В.В.Гладыш, Н.С.Турбина, 1990; В.И.Гудим с соавт., 1991; Ю.Н.Токарев, 1991 и др). Во многом это было обусловлено тяжелыми последствиями загрязнения окружающей среды в зонах активной хозяйственной деятельности человека и экологических катастроф: Чернобыль, Уфа, Семипалатинск и др.

Оставаясь целостной системой, кроветворная ткань, циркулирующая кровь и органы кроворазрушения, чутко реагируют на изменения внутренней среды организма и формируют ответ, обеспечивающий поддержание гомеостаза. Степень возникающего в системе напряжения при адекватной реакции сохраняет жизнь и здоровье индивидуума, а при неадекватной - ведет к развитию патологии. Четкое разделение нормы и патологии в биологии и

Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук

Страница № 5 медицине достаточно затруднено, что нашло свое отражение в появлении таких понятий, как "предболезнь" и "предпатология". С этих позиций, многие авторы рассматривают анемию как предпатологическое состояние, как ранний информативный диагностический симптом, не наполняя, однако, данное представление конкретным содержанием. В то же время, разработанные в последние годы технические приемы и методы исследований дали возможность по-новому подойти к решению как фундаментальных, так и прикладных проблем гематологии. Наиболее продуктивной оказалась концепция о роли межклеточных взаимодействий и кооперативных взаимоотношений различных кроветворных линий в обеспечении функционирования ткани костного мозга. Ярким подтверждением сказанному служат эритробластические островки (ЭО) костного мозга, представляющие собой морфо-функциональную ассоциацию клеток 'моноцитарно-макрофагальной и эритроидной линий (M.Bessis 1958-1991).

Анализ соотношения гуморальных механизмов регуляции эритропоэза: условия образования эритропоэтина (Эп), его кинетика (О.И.Моисеева, 1985; А.Д.Павлов, Е.Ф.Морщакова, 1987), а также клеточных факторов: роль макрофагов (Мф) и стромы костного мозга (И.Л.Чертков, ОА.Гуревич, 1984; Е.Б.Владимирская, 1990; Т.М.Dexter, 1989;) позволили по-новому взглянуть на патогенез апластических и гемолитических анемий, истинной и вторичной полицитемии (А.В.Коробкин с соавт., 1988; А.Г.Рассохин с соавт., 1990; Ю.М.Захаров с соавт., 1990; А.В.Волков, 1991; Б.В.Медяник, 1993).

Известно, что ожоговая травма вызывает нарушение функций и изменение количественного представительства клеток периферической крови и различных ростков кроветворения. Значительный прогресс был достигнут в расшифровке нарушений грануло- и моноцитарных ростков кроветворения при ожогах (И.Г.Попов, 1986, 1990, А.Г.Починский, 1989; Г.К.Попов с соавт., 1989), а также функциональных свойств тромбоцитов (В.Г.Хайдукова. с соавт., 1987), вызванных ожоговой травмой.

Однако, до сих пор малорасшифрованными остаются

Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук Страница № 6 механизмы развития анемии, сопровождающей ожоговую болезнь.

Представляется, что важную роль в ее развитии играет нарушение обмена железа, укорочение продолжительности жизни эритроцитов (И.Бернат,1975), появление токсических соединений, угнетающих эритропоэз (Р.И. Лифшиц, 1986; Н.А.Федоров с соавт., 1985; И.И.Долгушин с соавт., 1989 и др.). Тем не менее, исследований кинетики эритропоэза в ЭО костного мозга, а также функциональных свойств центральных макрофагов (ЦМф) ЭО при ожоговой травме, в доступной литературе мы не встретили. Лишь в единичных работах указывается на чувствительность к действию повреждающих факторов, при ожоге, данных клеточных ассоциаций (А.Г. Рассохин с соавт., 1991).

Хотя закономерности вовлечения КОЕэ в эритробласты в ЭО, амплификации и созревания эритроидной "короны" ЭО при компенсационном эритропоэзе установлены Ю.М.Захаровым с соавт. (1989), Л.В.Ворговой, Ю.М.Захаровым (1990), в литературе отсутствуют сведения о характере функциональных изменений ЦМф ЭО, поддерживающих компенсационный эритропоэз в этих межклеточных ассоциациях.

Поэтому, как для условий компенсационного эритропоэза, так и угнетенного эритропоэза важно было бы: раскрыть механизмы взаимодействия ЦМф с окружающей его эритроидной "короной"; выяснить зависимости между функциональным состоянием лизосом Мф и продукцией (или содержанием) в ЭО кислых ГАГ, электрофоретической подвижностью ЭО (ЭФПэо) и способностью ЦМф ЭО поддерживать эритропоэз; изучить функциональные особенности ЭО различных компартментов костного мозга.

Таким образом, расшифровка процессов, обеспечивающих компенсационный эритропоэз в ЭО, а также характера его нарушений при экспериментальных ожогах у животных, могла бы уточнить механизм анемии, сопровождающей ожоговую травму у человека.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью работы явилось выяснение характера эритропоэза в ЭО костного мозга, состояния функций их ЦМф, состояния гуморальной регуляции эритропоэза, сопровождающих экспериментальный ожог. Характер этих изменений в ЦМф ЭО

Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук

Страница JVsi 7 и их "короне" сопоставлялся с состоянием их функций при компенсационном эритропоэзе - при постгеморрагической анемии.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Исследовать динамику показателей периферической крови, кроветворения в костном мозге и селезенке при постгеморрагической и ожоговой анемиях.

Сопоставить изменения периферического отдела эритрона с динамикой количественных и качественных изменений ЭО костного мозга при данных состояниях.

Исследовать зависимость между активностью эритропоэза в островках и функциональным состоянием ЦМф ЭО, по изменению: состояния лизосомально-пластинчатого комплекса, содержания кислых ГАГ и электрических свойств мембран клеток ЭО, при острой постгеморрагической и ожоговой анемиях.

Сопоставить характер сдвигов эритропоэза в ЭО при ожоговой травме с эритропоэтической активностью плазмы крови обожженных животных.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ.

Впервые исследовано значение функциональной перестройки ЦМф ЭО в реализации процессов стимуляции и ингибиции эритропоэза при острой постгеморрагической и ожоговой анемиях. Показано, что постгеморрагическая анемия сопровождается повышением функциональной активности ЦМф ЭО, а ожоговая анемия, напротив, снижением исследованных функциональных параметров ЦМф ЭО. Установлены особенности ответов гемопоэза в селезенке на указанные воздействия.

Впервые получены сведения, характеризующие прижизненное состояние лизосомального аппарата ЦМф ЭО, электрические свойства мембран клеток островков, содержание в них ГАГ и взаимосвязь этих показателей с активностью эритропоэза в ЭО как в норме, так и при компенсационном и угнетенном эритропоэзе.

Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук

Страница Nt 8

Получены новые доказательства функциональных различий ЭО корковой и осевой зон костного мозга трубчатых костей животных. ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ.

Вскрыты ранее неизвестные закономерности реагирования эритропоэза в ЭО на возмущающее воздействие - кровопотерю. Выяснена роль нарушения межклеточных и гуморально-клеточных взаимодействий в патогенезе анемии, сопровождающей ожоговую травму.

Полученные в работе результаты экспериментального исследования обосновывают изыскание новых подходов к терапии анемических состояний через стимуляцию функциональной активности ЦМф ЭО, нарушаемой при ожогах. Отработанные в эксперименте приемы изучения функционального состояния ЦМф ЭО позволяют обосновать их применение для анализа сохранности межклеточных взаимоотношений у больных с различной гематологической патологией и в эксперименте при изучении патогенеза анемий.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Основные положения диссертации доложены на: Всесоюзной конференции "Лабораторные животные для медикобиологических и биотехнологических исследований" (М., 1990); Уральском съезде физиологов "Физиологические механизмы адаптации человека и животных" (Свердловск, 1990); межинститутской конференции "Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях" (Челябинск, 1990); первом Международном конгрессе патофизиологов (М., 1991); Уральской конференции патофизиологов "Системные и клеточные механизмы адаптации организма к действию повреждающих факторов" (Челябинск, 1991).

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ. Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста,

Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук

Страница № 9

10 иллюстрирована 14 таблицами, 11 графиками; состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, общего заключения, выводов, указателя литературы, включающего 160 источников отечественной и 126 зарубежной литературы.

ПОЛОЖЕНИЯ ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

Экспериментальный ожог, "III А-Б" степени, 15% поверхности тела, характеризуется развитием ожоговой анемии, связанной со снижением функциональной активности ЦМф ЭО, нарушением межклеточных эритропоэтических взаимоотношений в ЭО, нарушением синхронизации амплификации и созревания эритро-бластов в "короне" ЭО, снижением темпа вовлечения ЦМф ЭО в реконструкцию на фоне появления в плазме крови ингибиторов эритропоэза.

Кровопотеря 1% массы тела характеризуется развитием постгеморрагической анемии с активацией эритроидных взаимоотношений в ЭО, сопровождается повышением функциональной активности ЦМф ЭО и выражается в синхронном увеличении дифференциации КОЕэ в проэритробласты, синхронизации нарастающей амплификации и созревания эритробластов в "короне" ЭО.

Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук

Страница Nt 10

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ГЛАВА!

1.1. ЭРИТРОПОЭЗ И ЕГО РЕГУЛЯЦИЯ.

Основным местом кроветворения у млекопитающих и единственным в организме человека является костный мозг. Его ткань, представляющая собой сложную функционирующую систему, состоит из клеток-предшественниц, стромальных элементов и сосудистого русла (И.И.Новиков, 1983; И.Л.Чертков, О.А.Гуревич, 1984; T.M.Dexter et.al. 1984-1989).

Пролиферация и дифференцировка кроветворных клеток происходят одновременно. Пролиферация осуществляется митоти-ческим путем с равномерным распределением генетического материала между дочерними генерациями. Созревание клеток, сопровождающееся биосинтезом специфических белков, обладающих рецепторной или ферментативной активностью, происходит в клетках в G-1 периоде клеточного цикла. В это время замедляется синтез ДНК, вплоть до прекращения. Только молодые, способные к делению, клетки костного мозга составляют пролиферативный пул костного мозга.

Поддержание . нормального уровня эритроцитов в периферической крови осуществляется многоступенчатым процессом дифференциации эритроидных клеток-предшественниц в костном мозге, в ходе которого происходит развитие клеток от недифференцированных стволовых (т.е. стволовой кроветворной клетки - СКК) к КОЕгммэ, и далее к бипотентной КОЕ - КОЕмэ. (ранее именуемой БОЕэ), и далее - к КОЕэ. Последняя дифференцируется в проэритробласт (Ю.М.Захаров, 1988).

В физиологических условиях до 90% КОЕгммэ находятся вне S-фазы клеточного цикла, а время их удвоения занимает до 5 суток, однако при аплазии костного мозга, вызванной облучением или антимитотическими препаратами, до 50% КОЕгммэ переходит в S-фазу, а время их удвоения сокращается до 12-18 часов. БОЕэ подразделяется на менее (БОЕэ-14) и более дифференцированную (БОЕэ-10) колониеобразующую клетку. Большая часть БОЕэ-14 также

Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук Страница Nt 11

12 находится вне S-фазы клеточного цикла. Будучи активированными

ИЛ-3 и Эп, они способны совершать до 13 митозов. До 30% БОЕэ находятся в S-фазе клеточного цикла и из них формируется почти в 10 раз большее количество КОЕэ. До 70-80% их находятся в S-фазе. КОЕэ отличается высокой чувствительностью к Эп. Каждое КОЕэ может совершать до 2-4 делений, дифференцируясь в проэритробласты. КОЕэ образует в ходе дифференциации каждой из них до 50 оксифильных нормобластов (Ю.М.Захаров, 1988, 1991).

Пролиферация и дифференциация эритроидных клеток-предшественниц и, прежде всего, КОЕэ и всех морфологически распознаваемых эритроидных клеток от проэритробласта до ретикулоцита регулируются гормоном - Эп, образующимся в перитубулярных клетках почек при снижении доставки к ним кислорода. В них образуется до 85-90% гормона, остальное количество образуется в Мф (купферовские клетки и др.). Синтез и секреция Эп определяется уровнем оксигенации почек. Структурой почек, чувствительной к гипоксии, является гем-содержащий белок перитубулярных клеток, связывающий молекулу кислорода. При достаточной оксигенации почек окси-форма гемопротеина блокирует гем, регулирующий синтез Эп. В отсутствии кислорода, дезокси-форма гемопротеина прекращает тормозить синтез Эп. При дефиците кислорода в почечных структурах активируются чувствительные к гипоксии ферменты, например, фосфолипаза А2, отвечающая за синтез простагландинов Е2, Е1, и других, активирующих аденилатциклазу и вызывающих рост концентрации ц-АМФ в перитубулярных клетках почек, синтезирующих Эп. Лактат, адреналин, норадреналин, взаимодействующие с JS-2 адренорецеп-торами почек, также активируют аденилатциклазную систему, при этом нарастает концентрация ц-АМФ и ц-ГМФ, вызывающих усиление синтеза и секрецию Эп в кровь (А.Д.Павлов, Е.Ф.Морщакова, 1987).

У человека количество Эп составляет 1/100 - 8/100 МЕ/мл.плазмы, но при гипоксии оно может возрастать в 1000 и более раз.

Обнаружена взаимосвязь между величиной гематокрита и

Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук Страница № \2 уровнем Эп в плазме. При гематокрите, равном 40-50 /о, количество

Эп составляет 5-80 Милли Ед/мл., а при гематокрите, равном 10-20% - 1-8 Ед/ мл. плазмы (A.Erslev et al., 1985-1987; W.I.Williams et al., 1986).

Эритропоэтин - это гликопротеин. Биологической активностью обладает карбогидратная часть его молекулы. Величина аминокислотной последовательности его молекулы достигает 124, а молекулярная масса, в кило Дальтонах = 34-39. Эп усиливает пролиферацию клеток-предшественниц эритроидного ряда - КОЕэ, а также всех способных к делению эритробластов и ускоряет синтез гемоглобина во всех эритроидных клетках, включая ретикулоциты. Эп "запускает" в чувствительных к нему клетках синтез и-РНК, необходимой для образования энзимов, участвующих в формировании гема и глобина. Гормон увеличивает также кровоток в сосудах, окружающих эритропоэтическую ткань в костном мозге и увеличивает выход в кровь ретикулоцитов из его синусоидов (А.П.Ястребов, М.В.Попугайло, 1978; A.Erslev, 1986; А.Д.Павлов, Е.Ф. Морщакова, 1987).

Стимулирующим эффектом на гемопоэз обладают Т-лимфоциты. Показано, что действие на организм возбуждающих гемопоэз стрессоров (кровопотеря, высотная гипоксия и др.) вызывает миграцию лимфоцитов в костный мозг и активацию ими КОЕ (П.Д.Горизонтов с соавт., 1983; Е.Д.Гольдберг с соавт., 1991).

Эритропоэз активируют мужские половые гормоны - андрогены, увеличивающие чувствительность ткани костного мозга к Эп. Стимулирующее влияние оказывают не сами андрогены, а продукты их

5--редуктазного превращения - 5--Н-метаболиты. Женские половые гормоны - эстрогены обладают противоположным действием на эритропоэз. После полового созревания устанавливающиеся различия в содержании эритроцитов и гемоглобина с более высокими их значениями у мужчин, чем у женщин, связаны с указанным эффектом половых гормонов (А.Д.Павлов, Е.Ф.Морщакова, 1987; Ю.М.Захаров, 1988).

На КОЕэ обнаружены рецепторы к нейромедиаторам, катехоламинам, тиреотропному гормону, производным тестостерона.

Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук

Страница N» 13

Это делает понятным способность JS-адреномиметиков усиливать пролиферацию и дифференциацию эритроидных КОЕ (Е.Д.Гольдберг с соавт., 1991).

Важным условием для пролиферации ранних эритробластов является накопление под влиянием Эп их микроокружением кислых ГАГ (R.S.Mc.Cuskey, H.A.Meineke, 1973). Эффект ГАГ реализуется через увеличение проницаемости мембран гемопоэтических клеток для кальция и активацию в них системы циклических нуклеотидов с увеличением концентрации ц-АМФ. Таким образом, ГАГ способствуют формированию . вторичных посредников, обеспечивающих быстрое распространение сигнала от рецептора гемо-поэтической клетки к ее геному, в ходе действия КСФ на КОЕэ (А.П. Ястребов с соавт., 1988).

В эритроидном ряду средний полихроматофильный нормобласт -последняя клетка, способная к делению (L.G.Lajtha, 1959). Синтез ДНК в эритробластах контролируется биосинтезом гемоглобина: чем больше гемоглобина в цитоплазме, тем медленнее происходит синтез ДНК. Он прекращается при содержании гемоглобина 13,5пг.,в расчете на диплоидную клетку. Синтез гемоглобина начинается уже на стадии эритробласта и считается основным событием эритропоэза. При нормобластическом эритропоэзе синтез ДНК прекращается обычно на стадии оксифильного нормобласта. Ядро в это время становится маленьким, пикнотичным и выталкивается из клетки, после чего оксифильный нормобласт становится костномозговым ретикулоцитом. В ЭО, выделенных из костного мозга интактной крысы, созревание эритроидных клеток от эритробласта до ретикулоцита длится 72 часа (Y.M.Zakharov, M.Prenant, 1982).

В ходе нормального эритропоэза, в незначительном (примерно 5%) количестве клеток нарушена синхронность в синтезе ДНК и гемоглобина, что замедляет синтез ДНК, и в результате клетка подходит к митозу с содержанием Нв=27 пг., что блокирует митоз. Такие клетки не способны нормально развиваться и далее погибают или образуют мегалоциты - гигантские эритроциты с малым сроком жизни. Физиологическое значение этого явления, получившего название неэффективного эритропоэза, до конца неясно.

Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук

Страница Нз 14

15 Островки кроветворных клеток, в том числе молодые эо, располагаются на костномозговых балках, выстилающих строму костного мозга. Состоит строма из фибробластов, жировых и эндотелиальных клеток, Мф и экстрацеллюлярного матрикса - продуктов экскреции клеток стромы (фибронектин, коллаген, тромбоспондин, глюкозаминогликаны и др.)- Экстрацеллюлярный матрикс обеспечивает прилипание кроветворных клеток и является средой их обитания. Стромальными клетками выделяются значительные количества специфических регулирующих факторов, без которых невозможны пролиферация стволовых, полустволовых клеток, дифференцировка и функционирование их потомков (Ю.М.Захаров,

И.Ю.Мельников, 1984; И.Л.Чертков, О.А.Гуревич, 1984;

Е.Б.Владимирская 1990; T.M.Dexter, 1984-1989).

Полноценное стромальное микроокружение необходимо для поддержания нормального кроветворения и, в частности, эритропоэза, в костном мозге человека и животных. Так, например, в долговременных культурах костного мозга эритропоэз возможен лишь на предварительно сформированной подложке, состоящей из перечисленных выше элементов стромы, причем особое значение придают Мф (T.M.Dexter, 1989; Е.Б.Владимирская, 1990). Именно использование декстеровской жидкой культуры костного мозга, позволило выяснить способности стромальных клеток костного мозга (человека и мыши) поддерживать "ин витро" в течении нескольких месяцев пролиферацию СКК и клеток-предшественниц эритроидной и гранулоцитарно-моноцитарной линий.

Сканирующая микроскопия позволила выделить стромальные клетки 4 типов, в частности, гигантские жиросодержащие клетки и фагоцитирующие мононуклеарные клетки (T.D.Allen, T.M.Dexter,

1976; F.D.Wilson et.al., 1981). В исследованиях костного мозга человека, собаки и мыши была подтверждена гетерогенность прилипающего слоя стромальных клеток (E.D.Werts et.al., 1980; F.D.Wilson et.al., 1981). Вероятно, внутри прилипающего слоя происходят клеточные взаимодействия, значимые для поддержания

Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук

Страница N» 15

СКК и ее дифференцировки, образуются гуморальные факторы, регулирующие этот процесс.

После применения техники культивирования гемопоэтических клеток в полутвердых средах (J.Stephenson et.at., 1971; B.Varet et.al., 1980) был сделан вывод о том, что основными продуцентами этих факторов, регулирующих дифференциацию: КОЕгммэ—>КОЭэр.мег-->КОЕэ, оказались макрофаги, а секретируемые ими вещества получили название колониестимулирующих факторов (КСФ) - КСФ гранулоцитарного, КСФ моноцитарного; КСФгм.. Оказалось также, что стимулирующие эффекты Мф и моноцитов на пролиферацию эритроидных предшественниц (от 1 до 10% от общего числа клеток в культуре) сменяются угнетающими при добавлении в культуру гемопоэтической ткани до 15% Мф или до 30% моноцитов или их супернатантов, что позволило связать анемии, сопровождающие инфекции и опухоли у человека, с увеличением в костном мозге этих больных количества моноцитов и Мф, оказывающих угнетающее влияние на развитие эритроидной линии клеток (JJ.Rinehart et.al., 1978).

Важная роль влияния стромы гемопоэтических органов на кроветворение и, в том числе, на эритропоэз, связана с эффектом "якорной" функции образуемого стромой фибронектина. Оказалось, что фибронектин выполняет "якорную" функцию в отношении КОЕгммэ, КОЕэ. и других эритроидных клеток, вплоть до ретикулоцитов. Приклеивание всех перечисленных клеток к фибронектину осуществляется через рецепторы их мембран, узнающие аргинил-глицил-аспарил-сериновый локус фибронектинового домена клеточного прикрепления. По мере дифференцировки и созревания от БОЕэ до ретикулоцита способность клеток взаимодействовать с фибронектином снижается. Оказалось также, что взаимодействие КОЕгммэ и БОЕэ с фибронектином увеличивает их пролиферацию, а блокада рецепторов фибронектина на этих клетках резко понижает способность пролиферации этих клеток. Допускается также, что потеря чувствительности к фибронектину у КОЕгммэ включает программу ее развития по направлению миелоидных предшественниц,

Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук

Страница N» 16

17 а сохранение чувствительности к нему ориентирует на дифференцирование по эритроидному пути развития (S.Tsai et.al.,

1987).

В основе селективной фиксации СКК и КОЕгм к строме костного мозга лежат лектин-углеводные взаимодействия этих клеток-предшественниц с особыми микроворсинками, обнаруживаемыми на поверхности ретикулярных, фибробластоидных эндотелиаль-ных клеток, входящих в состав стромы костного мозга (K.Yamazaki et.al., 1989).

В строме костного мозга образуется также особый фактор-модулятор - гемопоэтин-1 (Г-1), который не вызывает пролиферации КОЕ, но резко усиливает пролиферативный эффект КСФ на эти клетки (T.M.Dexter., 1989).

Согласно морфологическим критериям H.Hartwig, H.G.Hartnig (1985),селезенка человека обладает слабой способностью депонировать эритроциты (т.к. относится скорее к защитному типу вследствие особенности структуры ее ткани). На слабую депонирующую функцию человеческой селезенки в отношении эритроцитов указывает и экспериментально оцененное количество массы эритроцитов в селезенке человека, которое составляет 20-40 мл., или 1-2% от общего количества (W.H.Crosby, 1959).

Нормальная человеческая селезенка служит резервуаром тромбоцитов (B.H.Aster, 1966). Кроме резервуарной, к функциям нормальной селезенки относят гемопоэтическую, гемолитическую, участие в гуморальном и клеточном иммунитете, метаболизме железа, а также контроле миелопоэза. У человека гемопоэз в селезенке прекращается после рождения и появляется вновь лишь в условиях патологии. Во взрослом состоянии в случаях, когда костный мозг повреждается или нарушается его развитие, эти эмбриональные очаги кровообразования, сохранившие свой гемопоэтический потенциал, проявляют свою активность в обратном онтогенетическом порядке, т.е. сначала возникает гемопоэз в селезенке, затем в печени и т.д. (H.Loffler, 1970; M.H.Freedman, E.F.Saunders, 1981; M.F.Scifert, S.C.Marks, 1985).

У взрослой крысы менее 5 /о гемопоэза наблюдается в селезенке

Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук

Страница № 17

18 (K.Pantel, et.al., 1990).

Значительное количество КОЕ (в селезенке грызунов) обеспечивает в случае патологии быстрый гемопоэтическии ответ, как то: кровопотеря, экспериментальный ожог, гипоксия, введение эндотоксинов, Эп, облучение, удаление костного мозга (L.O.Iacobson, et.al., 1950; D.Orlic et.al., 1965).

Кроме эритропоэза в селезенке грызунов в норме происходит моноцитопоэз. Было показано, что в селезенке мыши 55% макрофагальной популяции поддерживается за счет вхождения моноцитов периферической крови и 45 /о за счет локального деления мононуклеарных фагоцитов в селезенке (R. Van Furth, 1984).

Человеческая и крысиная селезенка имеют много общего в популяции их клеточных компартментов, поэтому крыса - подходящий объект для изучения гуморального и клеточного иммунитета человека (W. Timens., 1991).

На основании постоянного появления в циркуляции, после СЭ (удаления селезенки) у животных и людей, эритроцитов с тельцами Жоли, представляющими собой остатки ядерного материала эритробластов, предполагается, что селезенка оказывает влияние на созревание поздних эритробластов в костном мозге, их денуклеацию. Кроме того, было показано, что скорость созревания ретикулоцитов в сыворотке кроликов с СЭ выше, чем в контроле. На основании этого было предположено, что селезенка способна гуморальным путем угнетать созревание ретикулоцитов (Р.А.Дымшиц, Ю.М. Захаров, 1966; В.О. Недоспасов, 1972).

1.2. РОЛЬ И МЕСТО ЭРИТРОБЛАСТИЧЕСКИХ ОСТРОВКОВ

КОСТНОГО МОЗГА В ЭРИТРОПОЭЗЕ В НОРМЕ И ПРИ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ВОЗДЕЙСТВИЯХ.

Эритропоэз у человека и млекопитающих протекает в ЭО костного мозга, что было убедительно доказано в многочисленных исследованиях (M.Bessis, 1958-1976; M.Prenant, 1977; I.Breton-Gorius et.al.,1979; J.M.Yoffey, P.I.Yaffe, 1980; D.Zucker-Franklin et. al., 1981).

Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук

Страница № 18 модифицированный метод, позволяющий использовать для среды выделения компоненты отечественного производства (Y.M.Zakharov,' M.Prenant, 1982; Ю.М.Захаров с соавт., 1984).

Количество ЭО определяют в камерах, которые используются для подсчета клеток крови, применяя для маркировки ЦМф ЭО 0,1% раствор нейтрального красного.

Методы, использующие световую микроскопию, для количественного и качественного анализа ЭО животных, позволили детально описать кинетику и морфологию эритропоэза в норме и при экспериментальных воздействиях (M.Bessis, 1976; Ю.М.Захаров с соавт., 1984, 1986). Традиционным же методом исследования ЭО у человека до недавнего времени являлась электронная трансмиссионная и сканирующая микроскопия (И.Бернат, 1975; Н.И.Заболотных, К.Г.Газарян, 1986; Н.С.Турбина с соавт., 1988;), которая позволила осветить морфологические изменения эритропоэза в ЭО при ожоговой болезни (И.Бернат, 1975), железодефицитной анемии (M.Bessis, 1976), постгеморра-гической и др. анемиях (D.Zucker-Franklin et.al.., 1981). Однако широкого применения в клинике и в эксперименте этот метод не нашел в связи с его трудоемкостью. Сравнительно недавно был разработан оригинальный метод выделения ЭО из костного мозга человека, позволяющий определить их содержание в трепанобиоптате и исследовать с помощью световой микроскопии (Ю.М.З ахаров с соавт., 1986, 1988; А.Г.Рассохин с соавт., 1989).

Количество ЭО в кроветворной ткани дает представление об интенсивности эритропоэза (Y.M.Zakharov, M.Prenant, 1983; АТ.Рассохин, И.Ю.Мельников, 1986; J.M.Yoffey, P.Yaffe, 1980).

Роль ЭО заключается в регуляции темпа и качества эритропоэза (воспроизводства эритроцитов).

Реконструкция костного мозга крыс в трехмерном измерении дала представление о пространственной форме ЭО (M.Prenant, 1977; B.N.Mohandas, M.Prenant, 1978). Мф в ЭО не располагались центрально, как это выглядит на препаратах ЭО на предметном стекле, но их цитоплазматические отростки всегда тесно контактировали с эритробластами, причем молодые эритробласты

Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук

Страница Ne 20

19 ЭО представляют собой морфо-функциональную ассоциацию кроветворных клеток, где Мф (гистиоцит) или ЦМф ЭО окружен эритроидными клетками разной степени зрелости (M.Bessis,

1958; Ю.М.Захаров, И.Ю.Мельников, 1984). Занимающая центральное положение клетка в ЭО может быть представлена также монобластом или моноцитом, являющимися предшественниками клеток макрофагального ряда (AJ.L. Macario et.al., 1981). "Корона" ЦМф ЭО представлена одним или несколькими слоями эритроидных клеток, причем морфологические исследования показали, что эритробласты находятся в центральных областях ЭО, а более дифференцированные эритроидные клетки - на периферии (K.Matsuoka, 1965; M.Prenant, 1977). Аналогичным образом организована эритроидная ткань в костном мозге 4-6 недельных крысят, в костном мозге взрослых крыс, в селезенке и костном мозге мыши, в печени новорожденных мышей и в печени эмбриона крысы на поздних этапах его развития, в печени взрослых крыс после субтотальной гепатэктомии, в костном мозге кролика, а при фенилгидразиновой анемии - в селезенке и печени взрослого кролика (Y.M.Zakharov, M.Prenant, 1982, 1983; D.Orlik et al., 1965; K.Matsuoka, 1965; F.Campbell, 1967; Z.Ben-Ishay, J.M.Yoffey, 1971-

1974; J.Nagel, C.Billat, 1974). Данное представление об организации эритропоэза в костном мозге вошло в современные руководства по гематологии (под ред. А.И.Воробьева, 1985; D.Zucker-Franklin et.al.,

1981; William I. Williams et.al., 1986).

Изучение морфологии и функций ЭО потребовало создания специальных методических приемов, позволяющих сохранить данную хрупкую клеточную ассоциацию, т.к. было доказано, что аспирация костного мозга легко вызывала диссоциацию элементов* островка, а редкие сохраненные ЭО обнаруживались лишь в толстых слоях мазков-отпечатков костного мозга (M.Bessis, 1976). Впервые метод изолирования ЭО был описан в 1970 г. (H.Mel., 1970), а в

1975 г. была получена взвесь клеток костного мозга с высоким содержанием ЭО (J.Le Charpenter, M.Prenant, 1975). На базе данного метода отечественными учеными был предложен

Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук

Страница № 19

21 плотно группировались и соприкасались друг с другом. По мере созревания они начинали отделяться от центра островка и расстояние между ними увеличивалось. Физический контакт зрелых эритробластов с другими элементами ЭО снижался и появлялась способность к дисперсии в костном мозге. Оказалось, что эритропоэз в костном мозге крыс не ограничивается прилежащим к синусоидам участком, как предполагалось ранее (L.Weiss, L.T.Chen, 1975), а протекает на всем пространстве костно-мозговой ткани. Другое дело, что кроветворная ткань костного мозга трубчатых костей крыс является как бы пространственно разделенной по функциональным особенностям на осевой компартмент, расположен-ный вокруг центрального синуса сосудистой системы костного мозга и корковый компартмент, прилежащий к эндостальной области. Первый представляет собой зону пролиферации и созревания, второй - зону накопления и воспроизведения гемопоэтических клеток-предшественниц (Н.Г.Хрущов с соавт., 1988; А.Г.Починский, 1989; F.Frassoni et.al., 1982; В.Lord, 1986). Оказалось, что пролиферирующие ЭО обнаруживаются преимущественно также в субэндостальной корковой зоне костного мозга крысы. Зрелые же оказались в центральных синусах бедренной кости крысы. Это указывает на тесную связь формирования новых ЭО с гемопоэтически активной зоной костномозговой ткани, взаимодействующей с эндостальными элементами ( А.Г.Починский, 1989; А.Г.Рассохин с соавт., 1991).

У нормальной крысы 95% ЭО костного мозга представлены эритробластами, находящимися на разных ступенях развития. Эритроидные клетки-предшественницы способны к 4-5 делениям и формированию соответственно 2-4-8-16-32 эритробластов (C.Mize, M.Prenant et.al., 1977). Исходя их этого, в 1982 году было предложено деление ЭО на 3 класса зрелости (Y.M.Zakharov, M.Prenant, 1982). При этом подразумевалось, что ЭО 1 класса представлены элементами ранних стадий развития, а 2-го и 3-го -более дифференцированными. Эта классификация учитывала лишь темп пролиферации и созревания эритроидных клеток в костном мозге. В 1986 Ю.М.Захаровым с соавт. была предложена формула

Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук

Страница № 21

ЭО, учитывающая степень зрелости эритроидных клеток в ЭО и включающая реконструирующиеся ЭО (ЭОрек) и инволюцирующие ЭО (ЭОинв). Таким образом, прежняя классификация была дополнена и в настоящее время имеет следующий вид:

1 кл. зрелости - проэритробласты, эритробласты и базофильные нормобласты, число ядросодержащих клеток, способных к делению, меньше или равно 8; кл. зрелости - базофильные и полихроматофильные нормобласты, число ядросодержащих клеток, способных к делению, от 9 до 16; кл. зрелости - полихроматофильные и оксифильные нормобласты, а также ретикулоциты, число ядросодержащих эритроидных клеток, не способных к делению, менее 16.

Реконструирующиеся ЭО - присоединение к инволюцирующему островку эритроидных клеток, способных к делению, т.е. появление наряду с полихроматофильными нормобластами и ретикулоцитами про-эритробластов и/или базофильных нормобластов (Ю.М.Захаров с соавт., 1990). При этом, предполагают, что реконструирующиеся островки могут образовываться при взаимодействии новой КОЕэ и Мф кроветворной ткани, с признаками деструкции ЭО.

Инволюцирующие островки - полихроматофильные и оксифильные нормобласты и ретикулоциты, число ядросодержащих клеток, не способных к делению, менее 16.

Разработанный метод выделения ЭО из костного мозга человека (Ю.М.Захаров с соавт.,1988) показал значимость исследования ЭО в качестве дополнительного диагностического теста, при исследовании кроветворения здоровых и больных людей. Были систематизированы данные по морфологии ЭО гематологических больных, которые позволили вскрыть существенные отличия в организации эритропоэза в ЭО при стимуляции и ингибиции эритропоэза (А.Г.Рассохин с соавт., 1989).

Экспериментальные и клинические наблюдения состояния эритропоэза у животных и больных людей (А.В.Коробкин с соавт., 1988; Л.В.Воргова, Ю.М.Захаров, 1989; Ю.М.Захаров с соавт., 1990; А.Г.Рассохин с соавт. ,1990; А.В.Волков, 1991;

Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук

Страница N« 22

Л.Г.Запольских, 1991; А.Ф.Каюмова, А.Л.Гизатуллин, 1991;

И.Ю.Мельников, 1991; В.П.Пушкарев с соавт., 1991) позволили сделать следующие выводы:

1. Активация эритропоэза, вызванная у крыс длительной физической нагрузкой, повышающей потребление Oz тканями, кровопотереи, фенилгидразиновои анемией и наблюдающаяся у больных с вторичной полицитемией, гемолитической анемией, характеризуется увеличением абсолютного содержания ЭО в гемопоэтической ткани и параллельным повышением содержания в ней ЭО 1-го и 2-го классов, а также ЭОрек.

2. Напротив, ингибиция эритропоэза, спровоцированная у крыс посттрансфузионной полицитемией, длительным тепловым воздействием, снижением интенсивности эритропоэза в онтогенезе (у взрослых крыс в сравнении с 6-8 недельными), а у больных - при апластической анемии, остром и хроническом лимфолейкозе, характеризуется уменьшением в кроветворной ткани абсолютного содержания ЭО всех классов, в том числе ЭО 1-го класса и ЭОрек., что указывает на низкие темпы вовлечения КОЕэ в дифференциацию в ЭО. Увеличение абсолютного содержания ЭО в бедренной кости без синхронного увеличения абсолютного количества ЭО всех классов зрелости, расценивается как следствие ингибиции амплификации (воспроизведения себе подобных) и дифференциации клеток "короны" ЭО (Ю.М.Захаров с соавт., 1990).

Более полно позволяют оценить состояние эритропоэза в ЭО расчетные показатели (Л.В.Боргова, Ю.М.Захаров, 1990). Количество КОЕэ, вступивших в дифференцировку в ЭО выражается, как сумма абсолютного количества всех классов зрелости плюс абсолютного количества ЭОрек. (в бедренной кости крысы или в 1мг. гемопоэтической ткани человека).

Показатель вовлечения КОЕэ в эритроидную дифференцировку выражается суммой ЭО Ікласса и ЭОрек. (Л.В.Боргова, 1989).

Показатель повторного вовлечения ЦМф ЭО в эритропоэз рассчитывается, как отношение абсолютного количества ЭОрек/ЭОинв. Высокая информативность указанных показателей доказана рядом исследований (А.В.Волков, 1991; Y.M. Zakharov

Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук

Страница № 23

24 et.al._f 1991; В.П.Пушкарев, 1993).

При оценке морфологической картины в ЭО весомы качественные характеристики ЦМф - его распластанность, способность к синтезу ДНК и митозу, качество и сохранность связей с эритроидными клетками, выраженность адгезивных свойств, а также наличие ЭО без Мф или "супер ЭО" - появление ЭО, содержащих в "короне" более 32 ядросодержащих эритроидных клеток (А.Г.Рассохин, Ю.М.Захаров, 1988; Ю.М.Захаров с соавт., 1990).

Свойство ЦМф ЭО приклеиваться к поверхности стекла или пластика было использовано для культивирования ЭО (Y.M.Zakharov, M.Prenant 1982, 1983) и создания культуры ЦМф ЭО, что позволило обнаружить их способность секретировать в культуральную среду эритропоэтинактивные вещества.

Мф ЭО выполняет разнообразные функции в отношении созревающих эритроидных клеток в "короне" ЭО. Так, в ЭО 1-го, 2-го класса зрелости и ЭОрек. пролиферирующие эритроидные клетки, комплементарные Мф, получают от последних пластический материал и эритропоэтинактивные соединения в соответствии с запросами организма в кислороде. В ЭО 3-го класса и ЭОинв., содержащих не способные к делению эритроидные клетки, Мф фагоцитируют неполноценные эритроциты и вытолкнутые ядра нормобластов. В этом процессе снижение комплементарное зрелых клеток и Мф -необходимое условие для диссоциации и выхода их в кровь.

Отражением обеспечения высокого аффинитета Мф и эритроидных клеток явились обнаруженные между ними цитоплазматические мостики (Е.И. Заболотных, К.Г.Газарян 1986). Допускается, что ранние эритроидные клетки вступают в контакт с Мф в силу их взаимного высокого аффинитета (M.Prenant, 1977, 1980). По другой гипотезе (M.Bessis et.al., 1978; I.Breton-Gorius et.al., 1979) возможно обратное, поскольку "ин витро" в культуре гемопоэтических клеток обнаружена способность цитоплазматических отростков ЦМф ЭО вытягиваться к лежащим рядом эритроидным клеткам и вступать с ними в контакт. "Ин виво" анализ ультраструктуры костного мозга полицитемичных крыс также показал усиление взаимодействия ЦМф ЭО с малыми лимфоцитами и так

Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук

Страница Ne 24 называемыми широкоцитоплазматичными переходными клетками (Z.Ben-Ishay, J.M.Yoffey, 1972), морфологически сходными с проэритробластами после активации эритропоэза кровопотерей или инъекцией Эп (Y.M.Zakharov, M.Prenant, 1983), что сопровождалось быстрым (уже через 12 часов) формированием новых ЭО, представленных проэритробластами, а через 24 часа - и ба-зофильными нормобластами.

С помощью электронной микроскопии ЭО выявлен рофеоцитоз-микропиноцитоз эритробластами гранул ферритина, а также неидентифицированных веществ, поступающих от ЦМф ЭО (M.Bessis,1976). Рофеоцитоз характерен для всех клеток эритроидного ряда - от проэритробластов до ретикулоцитов. Микропиноцитоз неидентифицированных соединений эритробластами особенно выражен при острой железодефицитной анемии, когда ферритин не обнаруживается в костном мозге больных (M.Bessis et.al., 1978) Рофеоцитозные пузырьки эритробластов ЭО у интактных крыс и кроликов, как и эритробласты ЭО печени плода крысы, не всегда его содержат.

Исходя из данных в работах по эмбриональной печени крысы, установлена зависимость между числом макрофагальных и эритроидных клеток к единице поверхности: большей плотности макрофагальных клеток в ткани соответствует большая плотность клеток эритроидной популяции (J.Nagel, C.Billat, 1974). Таким образом, ЦМф ЭО соединениями, поступающими от него к эритробластам, активирует их пролиферацию. Так, блокада системы фагоцитирующих мононуклеаров, подавляя функцию ЦМф ЭО, угнетает и пролиферацию эритроидных клеток (K.Matsuoka, 1965).

При гемолитической фенилгидразиновой анемии формирование очагов эктопического эритропоэза в костном мозге мышей связывается с образованием новых ЭО. Между мембраной ЦМф и окружающих их эритроидных клеток обнаружено хлопьевидное вещество, которое секретируется Мф и затем поступает в эритробласты с помощью рофеоцитоза. Число макрофагальных клеток в очагах также увеличено (R.E. Ploemacher, P.Van Soest, 1977).

Мф передает к развивающимся эритроидным клеткам

Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук

Страница № 25 эритропоэтинактивные соединения, которые обнаружены в кондиционной жидкости культивируемых Мф ЭО (Y.M.Zakharov, M.Prenant, 1983). При введении супернатанта культуры этих клеток полицитемичным крысам-реципиентам наблюдалось формирование новых ЭО, за счет увеличения доли ЭО 2-го и 3-го классов зрелости. Аналогичные эффекты наблюдались при введении Эп. Еще большая стимуляция пролиферации и созревания входящих в состав ЭО эритроидных клеток наблюдалась вышеупомянутыми авторами у крыс-реципиентов после одновременного введения супернатанта Мф и Эп. Аналогичная способность фагоцитирующих мононуклеаров усиливать эффекты Эп отмечена в работах J.I.Kurland et.al. и K.S.Zukerman (1980-1981).

Полагают, что эритропоэтические свойства ЦМф ЭО зависят от _v их функционального состояния (Y.M.Zakharov, M.Prenant, 1983). Известно, что у полицитемичных животных угнетена выработка Эп. Авторами были исследованы супернатанты культур ЦМф ЭО костного мозга крыс с экспериментальной полицитемией, обнаружившие снижение эритропоэтических свойств у супернатантов культур ЭО, полученных при этом экспериментальном угнетении эритропоэза, что предполагает угнетение эритропоэтинпродуцирующей функции Мф или же понижение накопления Эп ЦМф ЭО (Ю.М.Захаров, И.Ю.Мельников, 1984). В пользу взаимосвязи эритропоэтическх свойств ЦМф ЭО и его функционального состояния говорит и прекращение выработки Эп Мф костного мозга, печени или селезенки под действием актиномицина-Д и активное усиление его секреции Мф, активированными кристаллической двуокисью кремния (I.N.Rich et.al., 1981, 1982).

Работа с культурой ЦМф ЭО полицитемичных крыс позволила сделать вывод о том, что эритропоэтическая активность ЦМф ЭО зависит от нужд в Эп целого организма. Это подтвердилось рядом работ на анемизированных животных, у которых денуклеация эритробластов в костном мозге сопровождалась появлением в периферическом звене ингибитора эритропоэза (Ю.М.Захаров, 1974; Ю.М.Захаров, В.СЯкушев, 1976; Ю.М.Захаров, 1982).

Допустимо, что ЦМф ЭО может быть источником ингибитора

Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук

Страница № 26

27 эритропоэза (Ю.М.Захаров, 1974).

Итак, ЦМф ЭО, возможно, секретируя стимулирующие и ингибирующие эритропоэз вещества, . выполняет роль локального регулятора продукции эритроцитов, ориентируясь при этом на кислородный запрос организма. Это позволяет рассматривать ЦМф ЭО, как клетки, ответственные за формирование кроветворного микроокружения, поддерживающего формирование эритроидного ростка (Ю.М.Захаров, И.Ю.Мельников, 1984).

По данным M.Bessis (1976) эритроклазия старых эритроцитов протекает в основном в ЦМф ЭО костного мозга. Фагоцитарная активность его значительна - поврежденные эритроциты полностью фагоцитируются за 10 мин. Высокая активность кислой фосфатазы цитоплазмы ЦМф ЭО в норме позволяет ему за сутки фагоцитировать до 12-16 ядер, переварить за 40 минут, причем невозможно даже обнаружить радиоактивные остатки меченных НЗ-тимидином ядер (J.M.Yoffey, P.Yaffe, 1980), что говорит о быстром выделении продуктов их распада из клетки. При стимуляции эритропоэза активность кислой фосфатазы повышается, а при угнетении снижается.

Наконец, в культурах ЭО показано, что гемопоэтические функции Мф сопряжены с активной локомоцией (Ю.М.Захаров, 1989). Оказалось также, что Эп, добавленный к культуре ЭО крысы, усиливает пролиферацию не только эритроидных клеток в "короне" ЭО, но и их Мф. Это доказывается как появлением многочисленных митозов Мф ЭО, так и метки нз -тимидина в 5-6% ЭО, что в интактных культурах ЭО не наблюдается. Уже 30 минутная инкубация его с Эп сопровождается ростом интенсивности флюоресценции ЭО, флюорохромированных акридиновым оранжевым, в диапазонах 630-650 нм. и 530-550 нм. (Ю.М.Захаров с соавт., 1991).

Получены также доказательства, что повышение фагоцитарной активности ЦМф ЭО, усиление процессов протеолиза его лизосомными протеиназами, снижает комплементарность Мф к его эритроидным клеткам, что приводит к усиленному выходу в кровь высвобождающихся из "короны" ЭО ретикулоцитов (А.Г.Рассохин с

Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук

Страница № 27

28 соавт., 1990). Однако, вместе с тем, остаются неясными вопросы: влияет ли гормон (Эп) на эритропоэтическую и другие функции Мф?

Какова взаимосвязь процессов амплификации и дифференцировки эритроидных клеток с функциями Мф?

1.3. ХАРАКТЕР ИЗМЕНЕНИЙ ЭРИТРОПОЭЗА ПРИ ОСТРОЙ КРОВОПОТЕРЕ.

Кровопотеря, вызывая гипоксию почки, активирует в ее ткани метаболизм арахидоновой кислоты, метаболиты которой (проста-циклин или его производное - 6-кето-простагландин 1 ), выступая как триггер для системы аденилатциклазы, увеличивают продукцию ц-АМФ, что приводит к последовательной активации протеинкиназы и фосфорелированию гидролазы, обеспечивающих усиление биосинтеза Эп в почке (J.W.Fisher, M.Hagiwara, 1984; А.Д.Павлов, Е.Ф.Морщакова, 1987).

После острой кровопотери максимальный подъем уровня Эп в крови большинство исследователей обнаружило через 12-24 часа после кровопотери, но высокое его содержание в крови сохраняется и через 32-48 часов после нее (М.Г.Кахетелидзе, 1964; Ю.М.Захаров, 1974; K.Akahane et.at., 1989). На 96-120 часы уровень Эп снижается до нормального и даже оказывается ниже его. Эти изменения в содержании Эп в крови после острой кровопотери отражают, по-видимому, его потребление костным мозгом. Так, например, связывание Эп клетками костного мозга у крыс резко возрастает на 3-4 дни после кровопотери, когда в костном мозге еще повышено количество КОЕэ и увеличен объем делящихся и дифференцирующихся эритроидных клеток.

Усиление эритропоэза всегда сочетается с активацией в костном мозге процессов аэробного окисления: для регенерации эритрона после кровопотери характерно увеличение скорости потребления кислорода клетками, интенсивности дыхания и окислительного фосфорелирования в их митохондриях, укорочение пути диффузии кислорода от капилляра к клетке, увеличение скорости кровотока в костном мозге, обусловленных увеличением его капилляризации за счет раскрытия нефункционирующих капилляров (эффекты метаболитов цикла Кребса,

Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук Страница № 28 жирных кислот), сокращением радиуса тканевого цилиндра костного мозга (А.П.Ястребов, 1972; А.П.Ястребов, М.В.Попугайло, 1978). Важная роль в этих изменениях принадлежит Эп, повышающему проницаемость мембран клеток костного мозга для кислорода, увеличивающему капилляризацию ткани костного мозга.

Однако, до настоящего времени нет четкого представления о зависимости между усилением эритропоэза в ЭО костного мозга и функциональной перестройкой их ЦМф, а также о том, каковы взаимоотношения лизосомальной функции ЦМф и его эритропоэтической функции?

В неэритроидных клетках костного мозга после кровопотери наблюдается ряд метаболических сдвигов, имеющих также важное значение для процессов пролиферации и дифференциации эритроидной ткани. Так, интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиокислительная активность в костном мозге оказываются увеличенными на 3 сутки после кровопотери. Это рассматривается, как условие, важное для формирования пролиферативного ответа, поскольку ПОЛ обеспечивает необходимую степень проницаемости клеточных мембран, влияет на активность внутриклеточных регуляторов-метаболитов арахидоновой кислоты, аденилатциклазную систему, уровень Са2+, энергетику клетки, а высокая антиокислительная активность предохраняет геном клеток от повреждения перекисными соединениями (Л.И.Савельев, 1989). Острая кровопотеря вызывает лабилизацию лизосомальных мембран неэритроидных клеток костного мозга в первые сутки после нее. Их стабилизация отмечается лишь на 3-5 сутки после кровотечения. По-видимому, данный феномен является важным звеном в метаболической перестройке кроветворной ткани для регенерации эритрона (Л.И.Савельев, 1989). Данный вывод подтверждают, в частности, резкая активация фагоцитоза латекса в ЦМф ЭО, понижение рН лизосом, синхронные усилению процессов амплификации и дифференциации эритробластов в их эритроидной "короне" (Ю.М.Захаров, Л.П.Варыпаева, 1992; Ю.М.Захаров с соавт., 1991; А.Г.Рассохин с соавт., 1990).

Допускается, что нейтральные ГАГ поддерживают дифференциа-

Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук

Страница № 29 цию эритроидных клеток до зрелых форм, а кислые ГАГ необходимы для обеспечения ранних этапов эритроиднои дифференциации в гемопоэтическои ткани (R.S.Cuskey, H.A.Meineke, 1973). Действительно, после кровопотери у животных обнаруживается характерная динамика этих соединений в гемопоэтическои ткани. Так, у мышей после острой кровопотери (2% от массы тела) через 6 часов в костном мозге уменьшается содержание кислых ГАГ, затем к концу первых суток их содержание возрастает, на вторые сутки возвращается к исходному уровню, а к третьим - снижается еще более, нормализуясь к четвертым суткам. Изменение концентрации нейтральных ГАГ в костном мозге после кровопотери носит более определенный характер: начиная с 6 часа их содержание становится ниже нормального уровня и остается таковым до 7 суток (А.П.Ястребов с соавт, 1988). Тем не менее, в литературе не встречается работ, в которых исследовалась бы зависимость между функциональным состоянием ЦМф ЭО и содержанием кислых ГАГ при 1% кровопотере, а также их значение при компенсационном эритропоэзе. Описаны изменения ЭФП клеток крови, в частности, ЭФП эритроцитов, при нарушениях функций эритрона, в частности различных анемиях, свидетельствующие об изменениях функций этих клеток (С.С.Хармоненко, А.А.Ракитянская, 1974; Г.И'.Козинец с соавт., 1986; П.М.Явербаум с соавт., 1987; В.И.Никуличева, Н.А.Власова, 1987 и др.). Однако, совсем нет работ по определению ЭФП эритробластических островков. В связи с этим представляет интерес изучение направленности изменений поверхностного заряда ЭО при активации эритропоэза, а именно, при постгеморрагической анемии.

Острая кровопотеря усиливает пролиферацию различных субпопуляций БОЕэ а также КОЕэ в костном мозге. Так, к третьему дню БОЕэ-8 увеличиваются на 70% и постепенно их количество снижается к пятому дню. Количество же активно пролиферирующих БОЕэ-3 возрастает с первого дня после кровопотери, достигает максимального подъема к третьему дню и затем снижается до исходного уровня (J.M.Adamson et.al., 1978). Эти наблюдения совпадают с результатами, полученными "ин виво". Так, добавление

Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук

Страница № 30

Эп к жидкой культуре гемопоэтических клеток вызывает удвоение процента БОЕэ, находящихся в фазе ДНК-синтеза, через 24-48 часов (E.N.Dessypis, S.B.Krantz, 1984). Количество КОЕэ в костном мозге мышей и крыс резко увеличивается уже в первые сутки после кровопотери, а в селезенке их количество возрастает в 30 раз (Н.Нага, M.Ogawa, 1977; KAkahane at.al., 1989). Резко увеличивается в ней и синтез РНК и ДНК (Ю.М.Захаров, 1973). Столь же резко после острой 2 /о кровопотери у крыс в костном мозге возрастает интенсивность формирования и количество Э01 и ЭОрек (В.П.Пушкарев с соавт., 1991), отражающих темп вовлечения КОЕэ в дифференциацию в проэритробласты (Л.В. Боргова, Ю.М.Захаров, 1990).

Анализа же количественных и качественных изменений ЭО в эритроиднои ткани при 1% кровопотере в связи с изменением функций их ЦМф, в доступной литературе мы не встретили.

Глубоко исследованы закономерности ответа морфологически распознаваемой эритроиднои части костного мозга на кровопотерю у человека и животных. Острая кровопотеря увеличивает статмокинети-ческий индекс, почти вдвое возрастает скорость пролиферации ядерных эритроидных элементов и их денуклеация, в костном мозге обнаруживается большое количество свободных ядер, возрастает процентное содержание эритроидных клеток в миелограмме, а в крови -ретикулоцитов. Последнее обстоятельство связывают с увеличением пор костномозговых синусов - свыше трех микрон - после острой кровопотери, уменьшением "липкости" мембраны ретикулоцита. В результате соотношение: ретикулоциты костного мозга/периферическая кровь, в норме составляющее 2,0-2,5, оказывается выровненным (В.И.Филимонов, Ю.М.Захаров, 1974). Но ускоряется не только выход ретикулоцитов из костного мозга в периферическую кровь, но и их созревание в ней (РА.Дымшиц, Ю.М.Захаров, 1966).

После острой кровопотери количественно возрастает явление перескока терминального деления, приводящее к образованию макроцитов, но для основной полиферирующей части эритрона характерно увеличение числа делений до 6-7 (вместо 4-5 в норме), с укорочением генерационного цикла для всех способных к

Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук

Страница Na 31 делению эритроидных клеток (Г.Д.Шостка, 1970; J.R.A.Hanna et.al., 1969; V.G.Tyazhelova, 1987). В костном мозге появляются ЭО, содержащие 40-50 и более эритроидных клеток в "короне" (следствие удвоений - 2:4:8:16:32:64) (А.Г.Рассохин, 1989; Ю.М.Захаров с соавт., 1990).

После кровопотери в костном мозге создаются условия для большего, чем в норме, вовлечения его моноцитов и Мф в эритропоэз. Это доказывается как вовлечением новых моноцитов-макрофагов в формирование Э01, так и увеличением повторной реконструкции Мф ЭОинв. в новую волну эритропоэза. Весьма возможно, что это связано с увеличением аффинитета Мф костного мозга к КОЕэ и ранним эритроидным клеткам под влиянием Эп (Ю.М.Захаров, И.Ю.Мельников, 1984; И.Ю.Мельников, 1987).

Таким образом, остаются неясными вопросы: Какими функциональными изменениями ЦМф ЭО сопровождается активация эритропоэза? Как взаимосвязаны лизосомальная функция ЦМф и его эритропоэтическая функция? Как меняется состояние зарядов на поверхности ЭО при активации эритропоэза? Что стоит за изменениями лизосомальной активности ЦМф, рН и содержания кислых ГАГ?

1.4/ ХАРАКТЕР ИЗМЕНЕНИЙ ЭРИТРОПОЭЗА ПРИ ОЖОГОВОЙ ТРАВМЕ.

Первые работы по изучению патомеханизма ожоговой анемии появились лишь в 40 годах двадцатого века.

Специфика данного вида травмы, как известно, обуславливает многофакторное поражение звена эритрона (И.Бернат, 1975; F.Stephen et.al., 1985), что приводит к развитию гипоксии, которая является одним из основных факторов в патогенезе ожоговой болезни (Н.А.Крыжановская, 1972; М.Г.Григорьев с соавт., 1980). Уже с первых минут наступает ранний гемолиз эритроцитов (Л.А.Никулин, ВАРоманченко, 1973; F.D.Moore et.al., 1946; M.Schultze, 1965; E.Topley et.al., 1962), под действием высокой температуры в

Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук

Страница № 32 тканях и крови, протекающей по сосудам в очаге поражения, и достигающем в зависимости от площади и глубины поражения от 8-Ю до 30-60 % всего объема "красной" крови (Р.И.Муразян, А.В.Илюхин, 1971; Р.И.Муразян, 1973; F.D.Moore et.al., 1946; I.F.K.Muir, 1961), однако некоторые авторы считают, что гемолиз эритроцитов имеет место только у больных с площадью поражения свыше 10-15 % поверхности тела (I.F.K.Muir, 1961; S.Shen et.al., 1943). Считают, что снижение осмотической и механической стойкости клеток является прямым результатом теплового воздействия (T.N.Ham et.al., 1948). оыло показано влияние и самой плазмы на раннюю деструкцию эритроцитов при ожогах (A.Hemptinne, P.Gautheir, 1961), а также уменьшение ее циркулирующего объема в начальном периоде (Н.И.Кочетыгов, 1970).

Большое значение в развитии анемии играют нарушение гемодинамики, замедление капиллярного кровотока, проникновение в рану эритроцитов сквозь капиллярную стенку, депонирование эритроцитов в коже, органах (в основном в селезенке и печени) с их последующим разрушением (О.Е.Кузин, С.А.Сморщок, 1988; Л. Д.Крымский с соавт., 1976; E.Topley et.al., 1962), внутрисосудистая агглютинация эритроцитов как в обожженной коже, так и вдали от нее (A.D.R.Batchelor, 1953). Менее пораженные эритроциты в течение более или менее продолжительного времени остаются в циркулирующей крови и погибают впоследствии в системе фагоцитирующих мононуклеаров (МФС).

Основными причинами поражения эритрона при ожоговых травмах считают: нарушение микроциркуляции (J.L.Ferguson et.al., 1977), выброс в кровь катехоламинов (D.W.Wilmore et.al., 1974), накопление простагландинов (G.Arturson, 1976-1977), изменение содержания липидов и лизолецитинов в мембране эритроцитов (G.Brecher, M.Bessisn, 1972), эндотоксемию (Н.Р.Панченков с соавт., 1979; Л.Г.Сидорова с соавт., 1985), цитотоксическое действие микробных токсинов на гетерогенную клеточную мембрану, ее полисахаридные и белковые комплексы (Р.И.Лифшиц, 1977; Л.Д.Бергельсон, 1982; Н.И.Габриелян с соавт.,

Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук

Страница № 33

34 1985; R.L.Celle et.al., 1980), нарушения кислотно-основного равновесия (S.Baar, 1974), аутоиммунные поражения (Е.Г.Кирдей,

В.Н.Нечаев, 1984).

Было показано также токсическое действие средних молекул на эритропоэз, вызывающее торможение утилизации глюкозы в эритроцитах и их гемолиз, снижение синтеза гемоглобина и ДНК в эритробластах (Н.И.Габриелян с соавт., 1985).

Возникающие при ожоговой травме расстройства желудочно-кишечного тракта (отек, гастрит, изъязвления слизистой, парез), функции печени, нарушают обмен железа, что служит причиной нарушения синтеза гемоглобина (И. Бернат, 1975; F.D.Moore et.al., 1946). Вместе с тем, нарушение обмена железа при ожоговой анемии носит сложный характер. Так, И.Бернат (1975) предположил, что одним из факторов развития патогенеза ожоговой анемии является комплексное нарушение обмена железа и порфирина, замедляющее синтез гема и, в большей степени, глобина, приводящее к развитию гипохромной анемии. Под действием тепловой энергии при ожоговой травме активируется ретикулогистиоцитарная система (РГС), повышается ее аффинитет к железу, изменяется кинетика оборота железа и распределение в организме. Транспорт его из кровеносного русла ускоряется, но не в костный мозг, а в РГС с их последующим депонированием в ней. Из клеток РГС железо трудно мобилизуется и его уровень в плазме не удается восстановить ни препаратами железа, ни переливанием плазмы с трансферрином. Поэтому, в эритробласты включается меньшее количество железа и его содержание в костном мозге не покрывает потребности синтеза гемоглобина. В результате, в периферической крови циркулируют нормохромные эритроциты, образовавшиеся до термической травмы и гипохромные эритроциты (с высоким содержанием свободного протопорфирина), образовавшиеся уже после ожоговой травмы. Эритроциты же гипохромного типа неполноценны и срок их жизни сокращен. Укорочение срока их жизни поддерживает прогрессирование анемии.

На основании исследования ультраструктуры ретикулярных клеток (гистиоцитов) и эритробластов костного мозга больных с ожогами И.Бернатом (1975) было показано: на ранней стадии

Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук

Страница № 34 ожоговой болезни в ретикулярных клетках (гистиоцитах) костного мозга наблюдается оживленный эритрофагоцитоз (в цитоплазме дисперсный, в клеточных структурах - в виде крупных аггломератов). Коэффициент лейко/эритро в 3 раза превышал норму, за счет усиления гранулопоэза и снижения эритропоэза. Островки эритробластов встречались редко (И.Бернат, 1975), а в имеющихся находилось лишь несколько клеток.

Позднее О.Е.Кузин, С.А.Сморщок (1988) также отметили изменение ультрасруктуры "красного" костного мозга на ранних стадиях ожоговой болезни, выраженное в нарушении сосудисто- тканевых взаимоотношений: изменение микроциркуляции, возникновение дистонии капилляров с резким расширением просветов и дезорганизацией стенки синусов. На этом фоне наблюдалось угнетение эритропоэза. Эритро- и нормобласты, в виде островков, состоящих лишь из нескольких клеток, обнаружива лись около ретикулярных клеток и Мф, а также периваскулярно. Как и в работе у И.Берната, отмечался оживленный эрит рофагоцитоз в ретикулоцитах на ранней стадии ожоговой болезни. В стадии острой токсемии нарастали повреждения ультраструктуры синусоидальных капилляров, нарушение связей стромы, гемопоэтических клеток и стенок сосудов.

Многие авторы (Н.А.Белов, 1957; Н.А.Крыжановская, 1972; F.Stephen et.al., 1985) отводят большое значение в развитии послеожоговой анемии угнетению эритропоэза. Признаки нарушения костномозгового кроветворения обнаруживаются уже в первые часы после ожоговой травмы.

Задержка созревания отмечается на стадии полихроматофильных эритробластов. В клеточных структурах присутствуют элементы дегенерации: протоплазма вакуолизирована, диссоциация в созревании ядра и протоплазмы (И.В.Ильинская, 1953-1955; Н.А.Белов, 1957). F.Stephen et.al. (1985) представили морфологические доказательства угнетения эритропоэза, а также обнаружили снижение количества эритроидной ткани костного мозга у ожоговых больных (на основе аутопсий).

Качественный и количественный анализ ЭО костного мозга

Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук

Страница № 35 (А.Г.Рассохин с соавт., 1991) показал снижение их абсолютного количества в костном мозге крыс уже с первых часов после ожоговой травмы, сохранявшееся (при разной динамике) до третьей недели, а при качественном анализе ЭО, выделенных из корковой и осевой зон костного мозга, различных по микроархитектонике, было обнаружено, что наибольшим изменениям подвержены и наибольшей чуствитель-ностью к возмущающему воздействию (А.Г.Рассохин, 1989) обладают ЭОинв., состоящие из небольшего (до 8) числа эритроидных клеток поздних стадий развития, диссоциация которых ведет к увеличению числа свободных Мф костного мозга. Нельзя исключить, по мнению автора, что свободные Мф костного мозга обладают повышенной чувствительностью к дистантным и локальным регуляторам гемопоэза. Итак, осевая зона (зона созревания), представленная в основном ЭОинв., является более реактивной и первая отвечает на ожоговую травму уменьшением общего количества ЭОинв. в костном мозге и увеличением числа ретикулоцитов в крови. Преобладающие в корковом веществе, способные к пролиферации, ЭО 1,2,3 классов и ЭОрек., стали уменьшаться количественно, начиная с 7 суток после ожога (особенно Э01, отражающие темп вовлечения эритроидных клеток-предшественниц в эритропоэз), с наиболее выраженной ингибицией эритропоэза в ЭО на 14 сутки. Таким образом, А.Г.Рассохин с соавт. (1991) отмечают ингибицию дифференцировки эритроидных клеток-предшественниц с одновременным замедлением созревания эритроидных клеток в ЭО.

В то же время ряд авторов отмечает усиление эритропоэза при ожоговой анемии (И.В.Ильинская, 1953-1955; В.С.Баркая, 1962; Л.М.Клячкин, В.М.Пинчук, 1969). В.С.Баркая в первые дни после ожоговой травмы выявил увеличение общего количества клеточных элементов "красного" ряда, преимущественно за счет полихроматофильных и частью базофильных эритробластов, а также увеличение количества ЭО. Н.А.Крыжановская, С.П.Пахомов, (1973) отмечали относительное увеличение числа незрелых (в большинстве полихроматофильных) и уменьшение числа зрелых (оксифильных) эритробластов в костном мозге при обширных ожогах. Ими была выявлена зависимость этих

Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук

Страница Nt 36

37 нарушений и инфекционно-токсических явлений от площади и глубины поражения.

Известно стимулирующее влияние протеолитических ферментов и эндотоксинов на количество KOE-S в циркулирующей крови (O.Vos et.al., 1972). Это может служить объяснением стимуляции миграции стволовых клеток из костного мозга на 4 сутки ожоговой болезни (Г.И.Безин с соавт., 1978), при которой наблюдается рост активности протеолитических ферментов и бактериемия.

Повреждение клеточных структур при ожогах сопровождается повышением протеолитической активности крови вследствие лабилизации лизосомальных мембран и выхода лизосомальных ферментов в кровь (Н.Г.Хрущов с соавт., 1988). Считают также (Г.И.Безин с соавт., 1978), что высокий уровень глюкокортикоидов в крови больных ведет к торможению миграции и циркуляции стволовых клеток.

В период ожоговой токсемии (3-6 суток после ожога) Д.Е.Пекарский и О.М.Захаренко (1980) отмечали гуморальные сдвиги, в результате чего наблюдалась ингибиция грануло-моноцитопоэза. В этом периоде токсемии резко увеличивались процессы протеолиза, приводя к резкому повышению свободных пептидов, обладающих высокой биологической активностью (Р.И.Лифшиц, 1977).

Известно, что после ожоговой травмы кровь теряет свою нормальную эритропоэтическую активность и насыщается ингибиторами эритропоэза. По данным Р.А.Арутюняна с соавт. (1978), наиболее это выражено на 1-3 сутки после ожога.

Представлялось интересным исследовать значение функциональной перестройки ЦМф ЭО в реализации процесса ингибиции эритропоэза при ожоговой анемии, а также получить ответы на вопросы: Какова роль нарушения межклеточных и гуморально-клеточных взаимодействий в патогенезе анемии, сопровождающей ожоговую травму? Как ингибиторы эритропоэза могут влиять на ЭО костного мозга? Какое значение для функционирования ЭО коркового и осевого слоев костного мозга

Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук Страница № 37 имеет разная величина заряда? С какой функцией ЦМф может быть связано изменение содержания кислых ГАГ? К чему приводит выключение эритропоэтической функции ЦМф при ожоговой анемии?

1.5. ПОВЕРХНОСТНЫЙ ЗАРЯД КЛЕТОК И ЕГО ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ.

Функции, выполняемые плазматической мембраной, определяют тот интерес, который испытывают гематологи к их изучению, а именно: рецепция гормонов, медиаторов и других биологически активных соединений; пассивный транспорт воды, ионов низкомолекулярных соединений и активный перенос органических молекул, в том числе путем фагоцитоза и пиноцитоза; выведение веществ из клетки путем экзоцитоза. Не вызывает сомнений, что перечисленные функции имеют непосредственное отношение к классическим представлениям гематологии о кроветворном микроокружении и межклеточных взаимодействиях.

Известно, что химическими компонентами биологических мембран, участвующих в выполнении практически всех жизненно важных функций клеток, являются липиды - около 40% и белки -около 60%, а также углеводы - около 5-10%, входящие в состав гетерогенных макромолекул - гликопротеидов и гликолипидов, и, наконец, в мембранах присутствуют многочиленные минорные компоненты: коферменты, нуклеиновые кислоты, антиоксиданты, неорганические ионы.

Основу биомембран составляет двойной слой фосфолипидов, гидрофобные фрагменты молекул которых погружены в толщу мембраны, а гидрофильные заряженные полярные "головки" ориентированы в окружающую водную среду. Мембранные белки лежат на поверхности или внедрены на различную глубину в гидрофобную зону мембраны и носят название примембранных и полуинтегральных белков. Некоторые белки пронизывают мембрану насквозь и их неполярные участки погружены в липидную часть мембраны, а полярные части обращены в сторону водной фазы (Л.Д.Бергельсон, 1982; А.А.Болдырев, 1987). Эти белки носят

Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук

Страница № 38 название интегральных. На наружной поверхности плазматической мембраны располагается надмемранный слой - гликокаликс, толщиной в несколько десятков нм, представляющий собой гликопротеидный комплекс, ассоциированный с мембраной (А.И.Мирошников с соавт., 1986; БЭС, 1986; Г.И.Козинец с соавт., 1986). Таким образом, принято считать, что на поверхности клетки существует мозаика из зарядов катионных и анионных групп, которые распределены неравномерно по площади и глубине поверхности (Г.И.Козинец с соавт., 1986; А.И.Мирошников с соавт., 1986).

Установлено, что в постоянном электрическом поле клетки ведут себя как отрицательно заряженные частицы, что определяет их перемещение по направлению к аноду. Общий отрицательный заряд создается 1(Г - 10* отрицательных зарядов, обусловливаясь диссоциацией в первую очередь карбоксильных групп неираминовои (сиаловой) кислоты, анионных комплексов РНК и фосфатных групп, а также 10 - 10 положительных зарядов, которые определяются диссоциацией амино- и сульфгидрильных групп (T.Tenford, 1970; G.V.F.Seamen, 1975). Кроме диссоциации ионогенных групп структурных компонентов клеточной мембраны свой вклад в создание поверхностного заряда вносит электрогенный калий-натриевый насос, создающий трансмембранный потенциал (Е.А.Аиберман с соавт., 1978; А.И.Мирошников с соавт., 1986; В.А.Бароненко с соавт., 1988; DA. Mc.Quarrie, P.Mulas, 1977; K.Redmann, 1978; G.V.Sherbet, 1978; E.Heinz, 1981).

Существование заряда на поверхности клеток приводит к образованию ДЭС - двойного электрического слоя из зарядов клетки и зарядов противоионной атмосферы (D.A.Haydon, 1961). Наружная часть ДЭС обуславливает электрокинетический или дзета-потенциал клетки, параметром измерения которого в различных методиках служит ЭФП, так как электрокинетический потенциал складывается из трансмембранного потенциала и поверхностного заряда. Параметром измерения последнего также является ЭФП.

Под электрофоретической подвижностью понимают скорость движения клетки в постоянном электрическом поле при градиенте потенциала - 1 вольт/см. Для измерения ЭФП используют

Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук

Страница № 39

40 микроаппараты, в которых с помощью секундомера и окулярной сетки определяют под микроскопом скорость перемещения каждой клетки в электрическом поле (С.С.Харамоненко, 1960; С.С.Харамоненко,

А.А.Ракитянская, 1974; Е.М.Витебский с соавт., 1983).

В организме человека и животных в норме электрический заряд клеток крови исключительно постоянен из-за неизменности рН и постоянства минерального состава плазмы (С.С.Харамоненко, А.А.Ракитянская, 1974). Предполагается, что величина поверхностного клеточного потенциала детерминирована генетически (G.Ruhenstroth-Bauer et.al. 1963).

При изменении физиологического состояния организма и при патологии электрический заряд клеток крови изменяется вследствие: нарушения клеточных структур или нарушения состава окружающей среды - появления антител, продуктов распада клеток, патологических белков, изменения концентрации гормонов и ферментов (Г.И.Козинец с соавт., 1986; С.С.Харамоненко, А.А.Ракитянская, 1974).

Общепринято, что если инкубация отмытых клеток больного человека в плазме здорового и наоборот, не изменяет первоначальную ЭФП клеток, то причина изменения подвижности лежит в самих клетках (С.С.Харамоненко, А.А.Ракитянская, 1974). Причину изменения заряда выясняют в дополнительных средах или по данным люминесцентной и электронной микроскопии. У здоровых людей клетки крови имеют видовую специфичность и постоянную плотность элетрического заряда. Среди клеток крови наибольшей ЭФП отличаются эритроциты, меньшей - лимфоциты и самую низкую имеют нейтрофилы (Г.И.Козинец с соавт., 1986). Было обнаружено различие по ЭФП у Т- и В-лимфоцитов (K.Zeiller, K.Hannig, 1971), что объясняют отличием в молекулярной архитектуре их поверхности и особой ролью сиаловых кислот (Г.И.Козинец с соавт., 1986), а также маскировкой отрицательных зарядов на поверхности В-клеток иммуноглобулинами (T.Takahasi et.al., 1971).

Таким образом, электрический заряд поверхностной мембраны клетки является отражением ее функциональных свойств и подвержен колебанию при изменениях физико-химических свойств

Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук

Страница Ne 40

, российская Ьссударс^гним

Г гллеякотекл ] плазматической мембраны. Считают, что снижение ЭФП клеток свидетельствует о протекании в них неблагоприятных структурно-функциональных изменений (В.А.Галенок с соавт., 1987; S.Fatulian et.al., 1984; Y.H.Tsoneva, T.C.Tomov, 1984).

Результаты исследования влияния ряда ферментов - трипсина, тромбина, нейраминидазы, а также адреналина, ФГА, антител, вируса гриппа, неиммунологических плазменных белков - на изменение поверхностного заряда клетки, показали, что одни биологически активные вещества (трипсин, тромбин, нейраминидаза) взаимодействуют со специфическими рецепторами клеточной мембраны, уменьшая ее поверхностный отрицательный заряд за счет потери ионогенных молекул сиаловой кислоты (G.Ruhenstroth- Bauer, 1961-1962; G.M.W.Cook et.al., 1961; E.H.Eylar, R.F.Doolittle, 1962; D.E.Brooks, G.V.F.S eaman, 1973), а в других случаях (вирус гриппа, ФГА, антитела, неиммунологические плазменные белки) реабсорбируются на клеточной мембране, блокируя сиаловые кислоты, и также снижая величину отрицательного заряда (Л.В.Борзова, 1976; Г.И.Козинец с соавт., 1986; А.И.Мирошников с соавт., 1986; E.Straub, 1965; E.E.Uzgiris, 1976; G.V.Sherbet, 1978). Адсорбция на мембране мукополисахаридов, в частности, гепарина, v увеличивает ЭФП тромбоцитов (А.А.Маркосян с соавт., 1969, 1973; A.Larean et.al., 1969), а также ЭФП отмытых эритроцитов прямо пропорционально его концентрации в растворе (А.В.Темнов с соавт., 1982). Существуют данные, показывающие зависимость ЭФП от зрелости клеток (Г.И.Козинец с соавт., 1986; А.В.Gear,

1977; G. Salvo et.al., 1982), которые объясняют происходящим в клетке созреванием мембраны, при котором клетки теряют часть своей подвижности за счет уменьшения плотности неираминовых кислот поверхности (С.С.Харамоненко, А.А.Ракитянская, 1974).

Таким образом, в изменении поверхностного заряда клетки важную роль играет метаболизм неираминовых кислот ее мембраны.

Изучение электрокинетических свойств клеток крови у больных с заболеваниями системы крови показало: электрический заряд изменяется в двух направлениях. Резкое увеличение ЭФП клеток крови свойственно патологическим процессам с признаками злокачествен-

Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук

Страница № 41

42 ности - лейкозам, злокачественным опухолям различной локализации.

При этом, ЭФП эритроцитов (ЭФПэ) характеризуется нестабильными изменениями и значительным разбросом полученных значений, а уменьшение и увеличение ЭФП ядросодержащих клеток на фоне проводимого лечения при остром лейкозе коррелирует с количеством бластных клеток в периферической крови (Г.И.Козинец с соавт., 1986). При анемиях различного генеза большинство авторов отмечают четко выраженную тенденцию к понижению ЭФПэ. Данный феномен был обнаружен при исследовании крови больных железо-дефицитными, агастральными, гемолитическими и гипопласти-ческими анемиями, а также при ночной пароксизмальной гемоглобинурии, метгемоглобинемии и талассемии и, наконец, у собак при массивной невозмещенной кровопотере (С.С.Харамоненко, А.А.Р акитянская, 1974; Г.И.Козинец с соавт., 1986: В.И.Никуличева, Н.А.Власова, 1987). Выраженность изменений ЭФП при этом определялась типом кроветворения, нарушенным созреванием эритроидных клеток, сдвигом поверхностных характеристик мембран и нарушением их функций. Последнее при пароксизмальной ночной гемоглобинурии проявлялось в снижении осмотической и кислотной устойчивости эритроцитов, возрастании их деформабельности, а при метгемоглобинемии и талассемии - в нарушении образования гемоглобина и накоплении в клетках метгемоглобина (Г.И.Козинец с соавт., 1986) что, как известно, сопровождается преобладанием в крови больных патологически измененных эритроцитов с укороченным сроком жизни. При трактовке полученных результатов исходят из представления о том, что эритроциты в конце жизненного цикла имеют сниженное количество сиаловых кислот на поверхностной мембране и связанную с этим уменьшенную ЭФП. Исследование вышеупомянутыми авторами нежизнеспособных клеток (убитых путем опускания в жидкий азот, без применения криозащитных средств) показало значительное снижение их ЭФП, хотя у эритроцитов в меньшей степени, чем у лейкоцитов.

В случае аутоиммунной гемолитической анемии снижение ЭФПэ связывают с фиксацией на поверхности эритроцитов антител,

Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук

Страница Ne 42

43 маскирующих ионогенные группы сиаловых кислот (Г.И.Козинец с соавт., 1986).

В ряде случаев авторы отмечают возрастание ЭФПэ при анемиях. Так, резкое увеличение ЭФПэ наблюдалось у больных гипопластической анемией при кровоточивости в остром периоде (Г.И.Козинец с соавт., 1986), причем теоретического объяснения этому дано не было.

Изучалось физико-химическое состояние эритроцитарной мембраны в динамике анемии, моделированной введением свинца (П.М.Явербаум с соавт., 1987). В качестве одного из показателей использовали ЭФПэ. Авторы отмечают в первые периоды развития анемии повышение ЭФПэ, тогда как в стадии выраженного малокровия наряду с изменением формы эритроцитов, повышением содержания в мембранах фосфолипидов и холестерина, изменение физико-химических свойств эритроцитарной мембраны проявляется в резком снижении ЭФПэ. Показано также, (R.Glasser, 1978), что трансформация эхиноцита в стоматоцит сопровождается сдвигом мембранного потенциала. Таким образом, авторы предполагают связь между изменением поверхностного заряда эритроцитов и их морфо-функциональными изменениями.

Отмечают влияние ряда нейро-гуморальных факторов на заряд мембраны эритроцитов. Среди этих факторов простагландинам отводят главную роль (В.И.Шишкин с соавт., 1988), т.к. известно, что они могут связываться кислыми углеводно-белковыми структурами мембран эритроцитов, вызывая трансформацию дискоцитов в эхиноциты и воздействовать на кислородсвязывающую способность гемоглобина, уменьшая сродство последнего к кислороду (А.В.Шаш- кин, И.А.Терсков, 1986). Снижают ЭФП продукты гемолиза эритроцитов, адсорбируясь на поверхности эритроцитарной мембраны. Некоторые авторы (Х.М.Марков, 1979; В.М.Земсков, 1984) считают, что простагландины играют роль медиатора между макрофагальным фагоцитозом, усиливающим в свою очередь продукцию простагландинов, и регуляцией подвижности клеток в очагах воспаления.

ЭФПэ изучалось для оценки функционального состояния

Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук

Страница № 43

44 организма и степени его дезадаптации к воздействию экстремальных факторов (у больных сирингомиелией и у рабочих, связанных с производством ВЖС - высших жирных спиртов). Выявленные изменения - низкий уровень ЭФПэ и увеличение дисперсии говорят о снижении адаптационных механизмов и начальных проявлениях дезадаптации на клеточном уровне (Л.Р.Боговазова,

Г.С.Тупиневич, 1986; Г.С.Тупиневич, 1987; Г.С.Тупиневич,

Л.Р.Боговазова, 1988). Авторы рекомендуют использование определения ЭФПэ в качестве диагностического критерия патологического состояния организма и раннего выявления дезадаптационных сдвигов.

И.А.Сафин с соавт. (1988) у больных с поражением гепатобилиарной системы наблюдали глубокие изменения эритроцитар-ной мембраны, которые сопровождались изменением ее ЭФП.

Было замечено: по мере выздоровления больного ЭФПэ возрастает, при ухудшении состояния - падает, что можно использовать как критерий состояния у печеночных больных в динамике. У больных с наиболее резко выраженной патологией печени отмечалось и наибольшее снижение ЭФПэ, причем этими же авторами (И.А.Сафин, Р.С.Мингазов, 1985) ранее было показано, что в крови таких больных повышался уровень СМП В Среднем В L раза по сравнению с контролем.

Отмечали (Р.М.Баширова с соавт., 1988; W.Schutt et.al., 1985; JJ.Sennesael et.al., 1985), что снижение ЭФПэ у человека при заболеваниях почек любой этиологии - жесткий показатель состояния данной категории больных. Авторы делают предположение, что в основе потери белка и снижения ЭФПэ лежит один механизм - нарушение проницаемости мембран, возникающее в результате воздействия эндогенных токсинов.

Таким образом, для клинической практики важно было установить связь между изменением заряда форменных элементов крови, в частности, эритроцитов, и развитием патологического процесса, с целью диагностики состояния больных.

Важно, что ЭФП является ранним показателем стрессового состояния организма (В.А.Бароненко, Г.С.Тупиневич, 1985;

Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук

Страница № 44

45 В.А.Бароненко с соавт., 1988) и кратковременное снижение ее при стрессе, показанное также Г.И.Козинцом с соавт. (1986) при взятии стернальной пункции или затрудненной венопункции, объясняется авторами, в частности, избытком в крови адреналина, влияние которого на эритроциты наблюдалось, независимо от концентрации, у человека и собаки; и после инкубации с 0,1% ампульным адреналином в дозе 0,3-0,5 мл. уже через 30 минут.

Изучались качественные изменения эритроцитов в динамике ожоговой болезни (Р.И.Панченков с соавт., 1979). ЭФПэ понижалась с 1,128 (в норме) до 0,930 мкм * с х В х см, в фазе ожогового шока, а в периоде токсемии и септикотоксемии слегка повышалась. Авторы регистрировали падение ЭФПэ перед гибелью эритроцитов.

Другими авторами (Р.И.Аифшиц с соавт., 1988), исследовавшими влияние на ЭФПэ ожоговой токсемии, было установлено, что ЭФПэ резко возрастает уже на следующий день после ожоговой травмы и возвращается к исходному уровню к концу первой недели - при ожоге первой степени, и концу второй - при ожоге 3 степени, при этом не было выявлено существенных различий в ЭФПэ от тяжести ожога. По результатам проведенных в дальнейшем экспериментов стало ясно, что увеличение ЭФПэ при ожоговой токсемии не сопровождается нарушением целостности и проницаемости мембран, а связано с адсорбцией на их поверхности СМП, т.к. троекратная отмывка эритроцитов в растворе фосфатного буфера возвращала ЭФП к исходному уровню, а ЭФПэ интактных животных, инкубированных в плазме крыс с тяжелыми ожогами, достоверно повышалась уже через 60 минут инкубации и нарастала до конца второй недели (Р.И.Аифшиц с соавт., 1988).

С появлением метода свободно текущего электрофореза появилась возможность фракционировать клетки костного мозга человека и животных в зависимости от плотности их поверхностного отрицательного заряда. Фракционирование и последующий анализ клеток на способность к колониеобразованию выявил гетерогенность

Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук

Страница № 45

46 колониеобразующих клеток, а также различия в их митотической активности (K.Zeiller et.al.,1972). Например, колониеобразующие клетки, дающие рост колоний в агаре и в диффузионных камерах, характеризовались высокой ЭФП, то есть были менее дифференцированными по сравнению с КОЕэ, дающими колонии только в диффузионных камерах и имеющими низкую ЭФП. Колониеобразующие клетки селезенки с высоким ЭФП, обладающие высокой митотической активностью, оказались более чувствительны к антимитотическому препарату винбластину, чем KOE-S, с низким ЭФП и низкой митотической активностью (K.Zeiller et.al., 1972). На этом основании говорят о существовании в костном мозге двух клеточных групп-предшественников с разными пролиферативными способностями. Предполагают, что клетки-предшественницы, обладающие низкой ЭФП, находятся в интерфазе и при определенных условиях могут трансформироваться во "вторичные" бластные клетки с ограниченной способностью к росту, что сопровождается увеличением отрицательного заряда и используется для фракционирования (Г.И.Козинец с соавт., 1986).

Таким образом, на основании данных, полученных с помощью ЭФП, можно судить о: злокачественности процесса, нарушающего нормальный гемопоэз; гуморальных сдвигах в крови, сопровождающих патологические процессы; о структурных изменениях мембраны клеток крови и о влиянии вышеперечисленных сдвигов на течение заболевания.

Однако, в доступной нам литературе мы не обнаружили работ, в которых исследовалось бы ЭФПэо костного мозга: у интактных животных, при стимуляции эритропоэза острой кровопотерей, а также при депрессиях эритропоэза, вызванных ожоговой болезнью. Между тем, эти знания могли бы оказаться полезными как с точки зрения понимания изменений, происходящих на уровне мембраны в этой ассоциации клеток костного мозга, так и с точки зрения возможного вклада этих изменений в патогенез ожоговой анемии, механизма расстройств гемопоэза, сопровождающих это патологическое состояние. Знание ЭФПэо могло бы быть использовано для выработки дополнительных критериев в оценке эритропоэза при его нарушениях.

Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук Страница № 46

Характер изменений эритропоэза при острой кровопотере

Кровопотеря, вызывая гипоксию почки, активирует в ее ткани метаболизм арахидоновой кислоты, метаболиты которой (проста-циклин или его производное - 6-кето-простагландин 1 ), выступая как триггер для системы аденилатциклазы, увеличивают продукцию ц-АМФ, что приводит к последовательной активации протеинкиназы и фосфорелированию гидролазы, обеспечивающих усиление биосинтеза Эп в почке (J.W.Fisher, M.Hagiwara, 1984; А.Д.Павлов, Е.Ф.Морщакова, 1987).

После острой кровопотери максимальный подъем уровня Эп в крови большинство исследователей обнаружило через 12-24 часа после кровопотери, но высокое его содержание в крови сохраняется и через 32-48 часов после нее (М.Г.Кахетелидзе, 1964; Ю.М.Захаров, 1974; K.Akahane et.at., 1989). На 96-120 часы уровень Эп снижается до нормального и даже оказывается ниже его. Эти изменения в содержании Эп в крови после острой кровопотери отражают, по-видимому, его потребление костным мозгом. Так, например, связывание Эп клетками костного мозга у крыс резко возрастает на 3-4 дни после кровопотери, когда в костном мозге еще повышено количество КОЕэ и увеличен объем делящихся и дифференцирующихся эритроидных клеток.

Усиление эритропоэза всегда сочетается с активацией в костном мозге процессов аэробного окисления: для регенерации эритрона после кровопотери характерно увеличение скорости потребления кислорода клетками, интенсивности дыхания и окислительного фосфорелирования в их митохондриях, укорочение пути диффузии кислорода от капилляра к клетке, увеличение скорости кровотока в костном мозге, обусловленных увеличением его капилляризации за счет раскрытия нефункционирующих капилляров (эффекты метаболитов цикла Кребса,

жирных кислот), сокращением радиуса тканевого цилиндра костного мозга (А.П.Ястребов, 1972; А.П.Ястребов, М.В.Попугайло, 1978). Важная роль в этих изменениях принадлежит Эп, повышающему проницаемость мембран клеток костного мозга для кислорода, увеличивающему капилляризацию ткани костного мозга.

Однако, до настоящего времени нет четкого представления о зависимости между усилением эритропоэза в ЭО костного мозга и функциональной перестройкой их ЦМф, а также о том, каковы взаимоотношения лизосомальной функции ЦМф и его эритропоэтической функции?

В неэритроидных клетках костного мозга после кровопотери наблюдается ряд метаболических сдвигов, имеющих также важное значение для процессов пролиферации и дифференциации эритроидной ткани. Так, интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиокислительная активность в костном мозге оказываются увеличенными на 3 сутки после кровопотери. Это рассматривается, как условие, важное для формирования пролиферативного ответа, поскольку ПОЛ обеспечивает необходимую степень проницаемости клеточных мембран, влияет на активность внутриклеточных регуляторов-метаболитов арахидоновой кислоты, аденилатциклазную систему, уровень Са2+, энергетику клетки, а высокая антиокислительная активность предохраняет геном клеток от повреждения перекисными соединениями (Л.И.Савельев, 1989). Острая кровопотеря вызывает лабилизацию лизосомальных мембран неэритроидных клеток костного мозга в первые сутки после нее. Их стабилизация отмечается лишь на 3-5 сутки после кровотечения. По-видимому, данный феномен является важным звеном в метаболической перестройке кроветворной ткани для регенерации эритрона (Л.И.Савельев, 1989). Данный вывод подтверждают, в частности, резкая активация фагоцитоза латекса в ЦМф ЭО, понижение рН лизосом, синхронные усилению процессов амплификации и дифференциации эритробластов в их эритроидной "короне" (Ю.М.Захаров, Л.П.Варыпаева, 1992; Ю.М.Захаров с соавт., 1991; А.Г.Рассохин с соавт., 1990).

Допускается, что нейтральные ГАГ поддерживают дифференциацию эритроидных клеток до зрелых форм, а кислые ГАГ необходимы для обеспечения ранних этапов эритроиднои дифференциации в гемопоэтическои ткани (R.S.Cuskey, H.A.Meineke, 1973). Действительно, после кровопотери у животных обнаруживается характерная динамика этих соединений в гемопоэтическои ткани. Так, у мышей после острой кровопотери (2% от массы тела) через 6 часов в костном мозге уменьшается содержание кислых ГАГ, затем к концу первых суток их содержание возрастает, на вторые сутки возвращается к исходному уровню, а к третьим - снижается еще более, нормализуясь к четвертым суткам. Изменение концентрации нейтральных ГАГ в костном мозге после кровопотери носит более определенный характер: начиная с 6 часа их содержание становится ниже нормального уровня и остается таковым до 7 суток (А.П.Ястребов с соавт, 1988). Тем не менее, в литературе не встречается работ, в которых исследовалась бы зависимость между функциональным состоянием ЦМф ЭО и содержанием кислых ГАГ при 1% кровопотере, а также их значение при компенсационном эритропоэзе. Описаны изменения ЭФП клеток крови, в частности, ЭФП эритроцитов, при нарушениях функций эритрона, в частности различных анемиях, свидетельствующие об изменениях функций этих клеток (С.С.Хармоненко, А.А.Ракитянская, 1974; Г.И .Козинец с соавт., 1986; П.М.Явербаум с соавт., 1987; В.И.Никуличева, Н.А.Власова, 1987 и др.). Однако, совсем нет работ по определению ЭФП эритробластических островков. В связи с этим представляет интерес изучение направленности изменений поверхностного заряда ЭО при активации эритропоэза, а именно, при постгеморрагической анемии.

Острая кровопотеря усиливает пролиферацию различных субпопуляций БОЕэ а также КОЕэ в костном мозге. Так, к третьему дню БОЕэ-8 увеличиваются на 70% и постепенно их количество снижается к пятому дню. Количество же активно пролиферирующих БОЕэ-3 возрастает с первого дня после кровопотери, достигает максимального подъема к третьему дню и затем снижается до исходного уровня (J.M.Adamson et.al., 1978). Эти наблюдения совпадают с результатами, полученными "ин виво". Так, добавление к жидкой культуре гемопоэтических клеток вызывает удвоение процента БОЕэ, находящихся в фазе ДНК-синтеза, через 24-48 часов (E.N.Dessypis, S.B.Krantz, 1984). Количество КОЕэ в костном мозге мышей и крыс резко увеличивается уже в первые сутки после кровопотери, а в селезенке их количество возрастает в 30 раз (Н.Нага, M.Ogawa, 1977; KAkahane at.al., 1989). Резко увеличивается в ней и синтез РНК и ДНК (Ю.М.Захаров, 1973). Столь же резко после острой 2 /о кровопотери у крыс в костном мозге возрастает интенсивность формирования и количество Э01 и ЭОрек (В.П.Пушкарев с соавт., 1991), отражающих темп вовлечения КОЕэ в дифференциацию в проэритробласты (Л.В. Боргова, Ю.М.Захаров, 1990).

Анализа же количественных и качественных изменений ЭО в эритроиднои ткани при 1% кровопотере в связи с изменением функций их ЦМф, в доступной литературе мы не встретили.

Исследование электрофоретической подвижности эритробластических островков костного мозга

Для измерения ЭФПэо использовали модифицированный метод С.С.Харамоненко, А.А.Ракитянской (1974). Выделенные ЭО окрашивали в суспензии 5-7 минут 0,03% раствором нейтрального красного из расчета 1:3 и переносили в среду фиколл-верографин, плотностью 1,077 г/смЗ, которая препятствовала адгезии ЭО на стекле камеры во время проведения исследования. В качестве измерительной ячейки использовали стандартный капилляр фирмы "Радиометр", длинной 75 мм., который после заполнения клеточной суспензией с обеих сторон герметизировался плотными агаровыми пробками. Микрокамеру-капилляр фиксировали между двумя чашками Петри, диаметром 40 мм, представляющими собой ионообменные ячейки с агаровым гелем, в боковых стенках которых имелись отверстия для размещения капилляра. Чашки Петри предварительно фиксировали на платформе, расположенной строго горизонтально. Сверху на агаровый гель ионообменной ячейки устанавливали электродные отделения, представляющие собой полиэтиленовые цилиндры высотой 20 мм. и диаметром 19 мм., снизу герметизированные пробками из агарового геля высотой 10 мм. В электродное отделение поверх агара заливали 3,5 М раствор KCI. В раствор опускали электроды. Контакты между агаровыми пробками измерительной ячейки и ионообменными ячейками, а также между последними и электродными отделениями увлажняли электропроводным раствором KCI ("Устройство для электрофореза клеток" А.Г.Рассохин, 1987). Блок управления служил для подключения внешнего источника постоянного напряжения к электродам на определенное время и в определенной полярности. Проводили 100-200 измерений ЭФПэо при поочередной смене полярности, выводя среднюю подвижность для каждого островка. Подвижность рассчитывали по формуле: txH где: U - подвижность островка, в мкм с В cm; S расстояние, на которое переместился исследуемый ЭО, в мкм; t -время, за которое ЭО переместился на указанное расстояние, в с; Н градиент потенциала, в Ъ ст . Предварительно для получения абсолютных величин S, мкм., проводили калибровку измерительной линейки окуляра по объект-микрометру, t, с измеряли с помощью секундомера. Время работы с одной измерительной ячейкой определялось скоростью оседания исследуемых клеточных агрегатов, среднее время - 15 минут. ЭФПэо измеряли при температуре воздуха v24-26 С, рН среды - 7,2-7,4. Функциональное состояние Мф ЭО костного мозга оценива 51 ли по общей и удельной активности лизосом, их рН и количеству кислых глюкозаминогликанов (ГАГ), с привлечением цитофотометрической и микрофлюориметрической техники. Все цитофото- и микрофлюориметрические исследования выполняли на микроскопе "ЛЮМАМ-ИЗ" с насадкой "ФМЭЛ-1А" со стабилизированным питанием систем освещения и регистрации в пределах 0,1 /о. Интенсивность окраски и флюоресценции выражали в условных единицах. Определение общей активности лизосом в ЦМф ЭО проводили по методу А.Г. Рассохина с соавт. (1992), в витальных препаратах ЭО после адгезии их на покровных стеклах в термостате при 37 С в течении 40 минут. Препараты ЭО промывали "средой-199" и флюорохромировали раствором акридинового оранжевого (в концентрации 1:10000), приготовленного на той же среде, в течений двух минут. Затем краситель тщательно смывали избытком среды и проводили микрофлюориметрию ЭО с помощью насадки "ФМЭЛ-1А" с ФЭУ-79 при возбуждении сверху синим светом от осветителя ОИ-35 со стабилизированным в пределах 0,1% питанием лампы накаливания КГМ9-70, возбуждающий светофильтр СС-15-2. Регистрацию флюоресценции проводили 2-3 секунды на приборе Щ-4300, в диапазоне 200 В, при напряжении питания на ФЭУ 2200 В, диаметре зонда - 1,5. Объектив - 65х, водная иммерсия. Интерференционный светофильтр N15 (630-650 нм). Интенсивность флюоресценции фона была равна нулю, а интенсивность флюоресценции ЭО в красной части спектра оценивалась как показатель общей активности лизосомального аппарата ЦМф ЭО. Расчет удельной активности осуществляли путем деления общей активности лизосом на количество клеток в ЭО.

Прижизненное определение рН лизосом осуществляли с помощью модифицированного метода А.Н.Литинской с соавт. (1979). Суспензию клеток костного мозга, содержащую ЭО, помещали на предметных стеклах в термостат на 30 минут при 37 С. Адгезированные ЭО окрашивали 5-7 минут 0,03% раствором нейтрального красного. После отмывки избытка краски препарат накрывали покровным стеклом и прижизненно исследовали на микрофотометрической системе "ЛЮМАМ-ФМЭЛ". О внутрилизо сомальном рН судили по отношению интенсивности световых потоков, замеренных при 470 нм. (Ф-470) и 450 нм. (Ф-450). Предварительно строили калибровочную кривую зависимости их от рН, используя фосфатно-цитратные буферы. Зонд - 0,1.

Состояние эритробластических островков при постгеморрагической анемии: количественный и качественный анализ

Абсолютное количество ЭО в бедренной кости (График N2) особенно высоким было на 3 и 7 сутки и составило 285,0 9,2х103 /бедро (Р 0,05) и 446,0 55,0х103 /бедро (Р 0,02) соответственно, против 209,0 23,5x10 /бедро в контроле. Это подтверждает ранее сделанный вывод о том, что стимуляция эритропоэза всегда сопровождается увеличением количества ЭО в гемопоэтической ткани костного мозга.

Подробный анализ изменений качественного состава ЭО после кровопотери позволил обнаружить следующую эволюцию эритропоэза в островках (Таблицы N3,4). Уже на 6 час после кровопотери увеличивалось количество Э01 и ЭОрек., что свидетельствовало как о вовлечении новых КОЕэ в эритропоэз, благодаря комплектации их с резидентными Мф костного мозга, так и вовлечении КОЕэ в контакт с Мф созревающих ЭО (реконструкция эритропоэза на базе Мф ЭОинв.). Количество ЭОинв. на бедренную кость резко снижалось. Данный характер изменений в ЭО сохранялся и через 24 часа после кровопотери. Можно думать, что снижение абсолютного количества ЭОинв. в костном мозге бедренных костей отражало ускорение темпа созревания оксифильных нормобластов в ретикулоциты. Вместе с тем, нельзя исключить, что снижение ЭОинв. на 24 час могло отражать увеличение объема терминального эритропоэза, т.е. денуклеации полихроматофильных, а возможно и более ранних эритроидных клеток в эти часы после кровопотери.

На 3 сутки закономерно обнаруживалось движение волны амплификации эритробластов в "короне" ЭО, выразившееся в нарастании абсолютного количества Э02 , ЭОЗ классов и ЭОинв.. Еще ярче устойчивое увеличение абсолютного количества всех классов зрелости: Э01, Э02, ЭОЗ, ЭОрек. и ЭОинв. обнаруживалось на 7 сутки, свидетельствуя об устойчивом прохождении удвоения эритроидных клеток от проэритробластов до средних полихроматофильных нормобластов в ЭОЗ и их созревании до ретикулоцитов в ЭОЗ и ЭОинв.. Повышенная реконструкция эритропоэза в ЭО сохранялась до 7 суток включительно. Исходя из данных по классам зрелости и показателя повторного вовлечения ЦМф в эритропоэз, уровень реконструкции уже на 7 и 14 сутки упал по сравнению с контролем. Это можно объяснить закономерной реакцией костного мозга, следующей на компенсацию эритроцитов в крови, содержание которых к этому сроку уже сравнялось с контрольным уровнем. Детально проанализировать изменения эритропоэза в ЭО после 1% кровопотери позволили расчетные показатели (Таблица N5). Они также подтвердили увеличение вовлечения КОЕэ в дифференцировку с 6 часа по 7 сутки включительно. Закономерное повышение объема реконструкции в ЭО вызвало увеличение показателя повторного вовлечения ЦМф ЭО в эритропоэз. Интенсивность этих процессов снижалась лишь к 14 суткам после кровопотери. Периоду наиболее интенсивного образования ЭО с 6 часа по 3 сутки после кровопотери соответствовало увеличение их ЭФП (График N3). На 7-14 сутки ЭФПэо возвращалась к пределам, характерным для интактных животных. Представляется интересным, что в процентном распределении ЭО (Таблица N3) не отличались между 3 и 7 сутками, хотя их абсолютное количество и было различным: на 7 сутки возрастала доля Э02,3 классов и ЭОинв., по сравнению с 3 сутками (Таблица N4). По-видимому, разная ЭФПэо, не различавшихся в процентном отношении, может объясняться изменением зарядов на поверхности ЭО.

Известно, что на распределение зарядов на мембране клеток, в частности, ЦМф ЭО, могут влиять кислые ГАГ.

Действительно, исследование кислых гетерополисахаридов в ЭО костного мозга животных в разные сроки после кровопотери обнаружило отчетливое увеличение их содержания в ЭО на 6, 24 часы и на 3 сутки. На 7 сутки их содержание не отличалось от исходного уровня, а на 14 сутки вновь повышалось (График N4). Возможно, именно этим можно объяснить возрастание ЭФПэо с 6 часа по 3 сутки и уменьшение ее на 7 сутки после кровопотери. Другим фактором, существенно влиявшим на повышение ЭФПэо, могло быть взаимодействие Эп с мембраной эритроидных клеток островков, поскольку суммарное количество эритроидных клеток, особенно богатых рецепторами к Эп, нарастает максимально в 1-3 сутки после кровопотери (K.Akahane et.al., 1989). Убедительно показано, что высокие значения ЭФПэ периферической крови являются признаком их высокой жизнеспособности и отражают адаптивную эритроцитарную реакцию костного мозга в ответ на возросшую потребность организма в переносчиках кислорода в различных экстремальных условиях (Г.И.Козинец с соавт., 1986; Ю.М.Захаров с соавт., 1986; Г.С.Тупиневич, Л.Р.Боговазова, 1988; С.Л.Сашенков с соавт., 1989). Напротив, понижение ЭФПэ, как правило, наблюдается при значительных нарушениях функций эритрона и характерно для железодефицитных, гемолитических, гипопластических и других анемий или анемий, связанных с энзимопатиями и часто свидетельствует об укорочении жизни эритроцитов. Поэтому, увеличение отрицательного заряда "короны" ЦМф и ЭО в целом, сочетающееся, как мы отметили выше, с активно протекающими процессами пролиферации и дифференциации эритроидных клеток в ЭО, можно рассматривать как признак высокой функциональной активности данной клеточной ассоциации. С другой стороны, утверждение о том, что увеличение ЭФПэо отражает хорошее функциональное состояние клеток, подтверждают наблюдения снижения ЭФП у ядросодержащих клеток при нарушении их плазматической мембраны (Г.И.Козинец с соавт., 1986).

Характер изменений процессов кроветворения в костном мозге

Абсолютное число миелокариоцитов в костном мозге бедренных костей после ожога снижалось на 1, 3 и 7 сутки, до 101,4 3,4x10 /бедро (Р 0,05), 94,6 6,7x10 /бедро (Р 0,05) и 79,4 3,5x10 /бедро (Р 0,001) соответственно, против 120,0 7,2x10 /бедро в контроле, причем первоначально за счет неэритроидных клеток (1-3 сутки). По-видимому, появление лейкоцитоза на 1 сутки было связано с повышенным выходом депонированных белых клеток из костного мозга в кровь. Последующему лейкоцитозу (7-14 сутки) соответствовало увеличение доли белых ядросодержащих клеток в костном мозге, о чем можно было судить по нарастанию отношения лейко/эритро (График N6). Параллельно указанным изменениям лейкопоэза, на 7 и 14 сутки отмечалось уменьшение абсолютного количества эритроидных клеток в костном мозге до 18,9 2,5x10 /бедро (Р 0,02) и 19,0±0,9х106 /бедро (Р 0,01), против 30,6 3,0х106 /бедро в контроле. Представляется, что этому предшествовало замедление созревания эритроидных клеток на 1-3 сутки после ожога, что доказывается увеличением в эти сроки содержания в парциальной эритрограмме доли полихроматофильных нормобластов, не сопровождавшимся подъемом количества оксифильных нормобластов (Таблица N9) и ретикулоцитов (Таблица N8). На 7 сутки достоверно снижалась доля эритробластов и базофильных нормобластов, что к 14 суткам закономерно приводило к уменьшению доли оксифильных нормобластов. Доказательством того, что последнее было следствием снижения пролиферации материнских эритроидных форм, а не следствием ускорения их денуклеации,

Угнетение эритропоэза при ожоге особенно отчетливо отражало уменьшение абсолютного количества ЭО в бедренных костях животных (График N7). Так, дефицит ЭО на 1 сутки составил 140х103 /бедро, или 38%, а на 7 и 14 сутки достиг 48-44%. Основной вклад в снижение абсолютного количества ЭО в 1 сутки после ожога внесло резкое уменьшение абсолютного количества инволюцирующих ЭО со 167,6 14,9x10 /бедро в контроле, до 40,9 6,2х103 /бедро (Р 0,001). Учитывая, что уменьшение количества ЭОинв. не сопровождалось, как при кровопотере, повышением ретикулоцитарного уровня крови, можно утверждать, что ожоговая травма вела к торможению созревания эритробластов в "короне" ЭО на уровне островков I и 2 классов.

Резкое замедление созревания эритроидной "короны" уже через сутки после ожога показало процентное распределение ЭО по классам зрелости (Таблица N10): содержание Э02 и ЭОЗ классов было выше контроля в 1,8-2 раза, соответственно, при одновременно резком (в 2,8 раза против контроля) снижении ЭОинв. и отсутствии нарастания "выхода" ретикулоцитов в периферической крови. Интересно, что в эти же сроки уже при имеющемся дефиците гемоглобина в крови не следовало увеличения реконструкции ЭО. В последующие сроки от 7 к 14 суткам наблюдалось резкое снижение содержания всех классов ЭО, а также ЭОрек. и ЭОинв. на бедренную кость крыс (Таблица N11). Уровень реконструкции в эти сроки был соответственно в 3 и 4 раза ниже, по сравнению с интактными крысами. Содержание инволюцирующих островков на 7-14 сутки хотя и возросло, по сравнению с первыми сутками, но оставалось почти на 40% ниже уровня контрольных животных.

Расчетные показатели, характеризующие состояние эритропоэза в ЭО, также отчетливо свидетельствовали о глубоком угнетении эритропоэза на 7-14 сутки после ожога (Таблица N12). Так, количество КОЕэ, вступивших в дифференциацию в ЭО, оказалось более чем 2 раза снижено на 7 сутки и примерно в 3 раза - на 14 сутки. Одновременно в эти сроки в 3-4 раза была снижена величина вовлечения КОЕэ в эритроидную дифференцировку, что свидетельствовало о замедлении темпа дифференцировки КОЕэ в проэритробласты, взаимодействующие с ЦМф костного мозга. Резкое угнетение повторной реконструкции эритропоэза, на основе ЦМф инволюцирующих ЭО, также наблюдалась на 7-14 сутки. Возрастание показателя повторного вовлечения ЦМф ЭО в эритропоэз через 24 часа объяснялось отмеченным выше резким уменьшением количества ЭОинв. в гемопоэтической ткани.

Похожие диссертации на О характере эритропоэза в эритробластических островках костного мозга при экспериментальных анемиях

Кинетические характеристики эритропоэза в эритробластических островках костного мозгаМедяник, Борис Викторович

Влияние острой застойной экспериментальной спленомегалии у крыс на эритропоэз в эритробластических островках костного мозгаТишевский, Игорь Андреевич

Эритробластические островки костного мозга и их место в эритроне в норме и при изменении состояния эритропоэза в организмеРассохин, Александр Григорьевич

Характер межполушарного распределения мощности биопотенциалов головного мозга в норме и при его латерализованном пораженииЗверева Зоя Федоровна

Неврологические и когнитивные нарушения у больных рассеянным склерозом в зависимости от характера поражения головного мозга.Минеев Константин Константинович

Характер морфологических изменений головного мозга при экспериментальном гипотиреозе и защитное действие антиоксидантовЭркенова, Лариса Далхатовна

Влияние эритропоэтина и Т-лимфоцитов на эритропоэз в культуре эритробластических островков костного мозга полицитемичных крысФёкличева Инна Викторовна

Влияние эритропоэтина и Т-лимфоцитов на эритропоэз в культуре эритробластических островков костного мозга полицитемичных крысФекличева Инна Викторовна

Адгезивные свойства эритробластических островков костного мозга крыс при различных функциональных состояниях эритропоэзаЩипицын Михаил Анатольевич