Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Механизмы структурной модификации и нарушений функциональных свойств мембраны эритроцитов в результате действия метгемоглобинобразователей (обзор литературы) 11
1.1. Структурно-функциональные свойства эритроцитарной мембраны и их регуляция 12
1.1.1. Липидный матрикс мембраны эритроцит: характеристика, принципы организации 13
1.1.2. Основы молекулярной организации белков мембраны эритроцита 16
1.1.3. Молекулярные механизмы модификации мембраны эритроцита 19
1.1.4. Роль межмолекулярных взаимодействий в механизмах обеспечения специализации мембраны 23
1.2. Системы структурно-функциональной сохранности мембраны эритроцита 27
1.2.1. Особенности метаболизма эритроцита 27
1.2.2. Система антирадикальной защиты 28
1.3. Механизмы образования и восстановления метгемоглобина. Структурно-метаболическая реакция эритроцитов при воздействии метгемоглобинобразователей 31
1.4. Патофизиологические особенности метгемоглобинемий, индуцированных нитритом натрия и фенилгидразином 35
1.4.1. Механизмы повреждающего действия нитрита натрия 37
1.4.2. Механизмы повреждающего действия фенилгидра 40
Глава2. Материал и методы исследования 45
2.1. Характеристика экспериментальной модели 45
2.2. Методы исследования 47
2.2.1. Количественные методы исследования периферического звена эритрона 47
2.2.2. Определение относительного содержания метгемоглоби на в крови 48
2.2.3. Определение индекса деструкции эритроцитов 49
2.2.4. Определение уровня мембранно-связанного гемоглобина 50
2.2.5. Метод выделения мембран эритроцитов 50
2.2.6. Определение активности На+,К+-АТФазы в мембране эритроцитов 51
2.2.7. Исследование липидного состава мембраны эритроцитов 52
2.2.7.1. Получение липидного экстракта 52
2.2.7.2. Определение содержания общих липидов 53
2.2.7.3. Определение содержания общих фосфолипидов 54
2.2.7.4. Исследование липидного спектра мембраны эритроцитов 54
2.2.8. Исследование структурных свойств мембраны эритроцитов методом флуоресцентного зондирования 55
2.2.9. Математический анализ результатов 57
Глава 3. Результаты собственных исследований 58
3.1. Структурно-метаболические свойства эритроцитов у крыс после однократного введения нитрита натрия 58
3.1.1. Характеристика периферического звена эритрона у крыс после однократного введения нитрита натрия 58
3.1.1.1. Динамика метгемоглобинобразования в крови у крыс после острого воздействия нитрита натрия 58
3.1.1.2. Количественные показатели красной крови у крыс после острого воздействия нитрита натрия 58
3.1.2. Особенности структурно-функционального статуса мембраны эритроцитов у крыс после однократного введения нитрита натрия 62
3.1.2.1. Липидный состав мембраны эритроцитов у крыс после острого воздействия нитрита натрия 62
3.1.2.2. Содержание мембранно-связанного гемоглобина у крыс после острого воздействия нитрита натрия 68
3.1.2.3. Структурная характеристика мембраны эритроцитов у крыс после острого воздействия нитрита натрия 69
3.1.2.4. Исследование активности Ка+,К+-АТФазы в мембране эритроцитов у крыс после острого воздействия нитрита натрия 72
3.2. Структурно-метаболические свойства эритроцитов у крыс после однократного введения солянокислого фенилгидразина 73
3.2.1. Характеристика периферического звена эритрона у крыс после однократного введения солянокислого фенилгидразина 73
3.2.1.1. Динамика метгемоглобинобразования в крови у крыс после острого воздействия солянокислого фенилгидразина 73
3.2.1.2. Количественные показатели красной крови у крыс после острого воздействия солянокислого фенилгидразина 75
3.2.2. Особенности структурно-функционального статуса мембраны эритроцитов у крыс после однократного введения соля нокислого фенилгидразина 78
3.2.2.1. Липидный состав мембраны эритроцитов у крыс после острого воздействия солянокислого фенилгидразина 78
3.2.2.2. Содержание мембранно-связанного гемоглобина у крыс после острого воздействия солянокислого фенилгидразина 82
3.2.2.3. Структурная характеристика мембраны эритроцитов у крыс после острого воздействия солянокислого фенилгидразина 83
3.2.2.4. Исследование активности NaT,K+-ATOa3bi в мембране эритроцитов у крыс после острого воздействия солянокислого фенилгидразина 85
Глава 4. Обсуждение результатов исследования 88
Выводы 119
Библиографический список 121
- Липидный матрикс мембраны эритроцит: характеристика, принципы организации
- Механизмы повреждающего действия фенилгидра
- Липидный состав мембраны эритроцитов у крыс после острого воздействия нитрита натрия
- Исследование активности NaT,K+-ATOa3bi в мембране эритроцитов у крыс после острого воздействия солянокислого фенилгидразина
Введение к работе
Актуальность исследования. Большая распространенность метгемогло-бинобразователей в среде обитания человека определяет высокую частоту и неблагоприятные исходы отравлений данными веществами. Расширяющееся с каждым годом внедрение химических соединений в различные виды промышленности, быта, науки создает условия для повышенного образования метге-моглобина (metHb) в крови при действии окислителей, амидо- и нитропроиз-водных бензола, анилина, гидразина и его производных, окислов азота, нитритов натрия и калия [Pach J. et al., 1996; Струков M.A., 1999; Жаткин О.А., 1999; Башарин ВА., 2001]. Метгемоглобинобразующими свойствами обладает ряд лекарственных препаратов: фенацетин, нитроглицерин, викасол, некоторые сульфаниламиды и противомалярийные средства, анестетики [Могош Г., 1984; Curry S.C. et al, 1991; Rudlof В. et al, 1995; Khan N.A. et al, 1999; Тино Г. и co-авт., 2001], бензилпенициллин [Сальникова Л.А. и соавт., 1989], альмагель [Самсыгина Г.А. и соавт., 1989], тетрациклины [Петренко Ю.М. и соавт., 1995].
Отравления метгемоглобинобразующими ксенобиотиками приводят к развитию полиорганных осложнений в постинтоксикационном периоде, характеризующихся длительными нарушениями со стороны нервной, сердечнососудистой, дыхательной, эндокринной систем, печени, почек, а также системы красной крови [Scalfaro P. et al, 2000; Choi I.S., 2001; Pach J. et al, 2001].
Интерес к всестороннему изучению патологических процессов, протекающих в эритроцитах при воздействии на организм метгемоглобинобразова-телей, остается весьма значимым, поскольку гипоксия является ведущим синдромом данной патологии, а эритроцит представляет собой клетку, во многом определяющую кислородный статус организма [Моран Р., 1998; Тино Г. и соавт., 2001].
Известно, что развивающаяся при воздействии метгемоглобинобразова-телей на организм анемия носит гемолитический характер [Каюмова А.Ф., 1990; McMillan D.C. etal, 1991; Волжская A.M. и соавт., 1993; Кисляков Ю.Я. и соавт., 1993; Магакян ЮА и. соавт., 1993, 1997]. При этом в патологический процесс вовлекаются как костномозговой компартмент, так и периферическое звено эритрона. Прежде всего страдает гемоглобиновый компонент красной
кровяной клетки. Качественные изменения гемоглобина оказывают влияние на структурные и функциональные свойства мембраны эритроцитов [Шиффман Ф.Дж, 2000].
Между тем остаются неясными основные патогенетические пути развития нарушений периферического звена эритрона при остром воздействии мет-гемоглобинобразователей. Тем более, что реакция циркулирующих эритроци-тарных клеток на развивающийся патологический процесс характеризуется дезорганизацией белкового и липидного компонентов мембраны, дисфункцией ионтранспортирующих систем, нарастанием полиморфизма зрелых циркулирующих эритроцитов, а также нарушением функциональньж свойств красньж кровяных клеток [Fujii S., 1981; Терещенко И.П. и соавт., 1996; Новицкий и со-авт., 2004]. В указанном аспекте особый интерес представляет комплексная оценка структурных свойств мембраны красньж клеток крови и их роли в механизмах развития гемолитической анемии при экспериментальных метгемог-лобинемиях.
Учитывая этот факт, вскрытие механизмов развития гемолитической анемии в ответ на острое воздействие метгемоглобинобразователей закономерно диктует необходимость сосредоточения научного интереса на исследовании структуры и функции мембраны эритроцитов.
Цель исследования. Определить роль нарушений структурных и функциональньж свойств мембраны эритроцитов в механизмах развития гемолитической анемии при действии метгемоглобинобразователей в эксперименте.
Задачи исследования:
1. Дать комплексную характеристику структурных свойств мембраны эритроцитов в остром и отдаленном периодах после однократного воздействия нитрита натрия (LD50).
Выявить характер изменений периферического звена эритрона при развитии острой фенилгидразин-индуцированной метгемоглобинемии.
Выявить общие закономерности и особенности повреждения эритроци-тарной мембраны при экспериментальной метгемоглобинемии, вызванной однократным воздействием нитрита натрия (LD50) и солянокислого фенилгидра-зина (LD50).
Получить новые данные о механизмах развития гемолитической анемии при экспериментальных метгемоглобинемиях.
Научная новизна. Впервые с использованием современных методов исследования дана комплексная сравнительная оценка периферического звена эритрона при экспериментальных метгемоглобинемиях, вызванных однократным введением нитрита натрия и фенилгидразина. Показано, что введение крысам метгемоглобинобразователей — нитрита натрия в дозе 90 мг/кг (LD50) и солянокислого фенилгидразина в дозе 150 мг/кг (LD50) — индуцирует развитие гемолитической анемии, одним из основных звеньев патогенеза которой является выраженная и длительная модификация мембраны красных клеток крови. Впервые установлено, что характер и степень выраженности нарушений периферического звена эритрона при экспериментальных метгемоглобинемиях зависят от химических особенностей ксенобиотиков, концентрации метгемогло-бина в крови и продолжительности острого периода метгемоглобинемии. Обнаружено, что введение солянокислого фенилгидразина в дозе 150 мг/кг (LD50) оказывает более выраженный повреждающий эффект на эритроцитарную популяцию, чем введение нитрита натрия в дозе 90 мг/кг (LD50).
Практическая значимость работы. В результате проведенного исследования получены новые данные фундаментального характера, дополняющие существующие представления о патогенезе нарушений в системе эритрона при метгемоглобинемиях. Полученные по итогам работы данные могут быть использованы для разработки новых целенаправленных патогенетически обоснованных способов предупреждения и коррекции нарушений со стороны системы красной крови при токсических метгемоглобинемиях. Положения, выносимые на защиту:
Однократное внутрибрюшинное введение крысам метгемоглобинобразователей нитрита натрия в дозе 90 мг/кг (LD50) и солянокислого фенилгидразина в дозе 150 мг/кг (LD50) вызывает развитие гемолитической анемии, механизмы развития которой сопряжены с изменением структурно-функциональных свойств мембраны эритроцитов.
Изменения структурно-функционального статуса мембраны эритроцитов при остром воздействии нитрита натрия (LD50) и солянокислого фенилгидразина (LD50) носят однонаправленный характер и характеризуются дестабилизацией липидного спектра, повышением микровязкости липидной фазы, увеличением уровня мембранно-связанного гемоглобина и угнетением активности Na+,K*-AT
3. Степень выраженности модификации мембраны эритроцитов при остром воздействии метгемоглобинобразователей — нитрита натрия (LD50) и солянокислого фенилгидразина (LD50) — определяется химическими особенностями ксенобиотиков, концентрацией метгемоглобина в крови и продолжительностью острого периода метгемоглобинемии.
Апробация и реализация результатов работы. Результаты проведенных исследований докладывались и обсуждались на научно-практической конференции с международным участием «Современные достижения фундаментальных наук в решении актуальньж проблем медицины» (Астрахань, 2004), VI Международном конгрессе молодьж ученьж и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2005), итоговьж научно-практических конференциях профессорско-преподавательского состава и слушателей Томского военно-медицинского института (Томск, 2004; 2005), Межгородской конференции молодьж ученьж «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2005).
Диссертационная работа выполнена в рамках отраслевой программы Рос-здрава «Гематология и трансфузиология» (раздел «Фундаментальные механизмы нарушений мембран эритроцитов в клинике внутренних болезней», договор №005/037/002).
В работе приводятся результаты исследований, поддержанных Советом по грантам при Президенте РФ для ведущих научных школ РФ по проблеме «Молекулярные механизмы нарушения структуры, метаболизма и функции клеток крови при патологии» (НШ-1051.2003.4).
Основные результаты диссертациионного исследования включены в лекционный курс по патологической физиологии (раздел «Патофизиология клетки») и гематологии (раздел «Приобретенные гемолитические анемии») на лечебно-профилактическом, педиатрическом и медико-биологическом факультетах ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, из которых 1 — в центральном рецензируемом журнале.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 152 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов и библиографического списка, включающего 298 источник (205 отечественных и 93 зарубежных). Диссертация иллюстрирована 12 таблицами и 15 рисунками.
Липидный матрикс мембраны эритроцит: характеристика, принципы организации
Независимо от специализации клеток основу всех плазматических мембран составляет липидный бислой с ассиметрично встроенными белками [Финдлей Дж.Б. и соавт., 1990]. Липидный бислой, принципиально устроенный у всех мембран одинаково, представляет собой непроницаемый барьер для ионов и полярных молекул, структурную основу («матрикс») мембраны [Владимиров Ю.А. и соавт., 1972; Vladimirov Yu. А., 1980; Cheville N. F., 1983; Владимиров Ю.А., 1989; Финдлей Дж.Б. и соавт., 1990].
Основными липидными компонентами мембраны эритроцитов являются гликолипиды, холестерол и фосфолипиды. Среди фосфолипидов мембраны эритроцитов выделяют сфингофосфолипиды, представителем которых является сфингомиелин, и глицерофосфолипиды: фосфатидилхолин, фосфа-тидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол и фосфатидная кислота [Сторожок С.А. и соавт., 1996; Геннис Р., 1997; Ohvo-Rekila Н. et al., 2002].
Мембранные фосфолипиды играют важную роль в обеспечении метаболизма клетки и в осуществлении внутри- и межклеточной сигнализации [Mallindger A.G. et al., 1993]. Фосфолипиды регулируют активный и пассивный трансмембранный транспорт веществ, обусловливая проницаемость мембраны, определяют чувствительность клеток к действию лигандов, детерминируют активность мембраносвязанных ферментных систем [Габрие-лян Э.С., 1985; Александров О.В. и соавт., 1989].
Непременным условием нормального функционирования эритроцита служит поддержание пространственного соотношения между фракциями фосфолипидов мембраны на физиологическом уровне [Crawford М.А. et al., 1975]. Фосфолипиды в мембране эритроцитов распределены неравномерно [Конев СВ., 1987]: фосфатидилхолин и сфингомиелин являются основными компонентами наружного монослоя мембраны, а фосфатидилэтаноламин и фосфатидилсерин локализуются преимущественно во внутреннем монослое. Переход молекул фосфолипидов с одного монослоя мембраны в другой, избирательный гидролиз фосфолипидов в определенных областях мембраны или формирование небислойных липидных фаз играют важную роль в процессах образования везикул, трансформации и разрушения эритроцитов [Smith J.E., 1987; Gudi S.R.P. et al., 1990; Слобожанина Е.И. и соавт., 1991]. Трансмембранная асимметрия, дифференцирующая две половинки бислоя, обусловливает чувствительность мембраны эритроцита к изменениям среды по обе ее стороны [Новицкий В.В. и соавт., 2004].
Некоторые фосфолипиды могут быть чрезвычайно токсичны. К подобного рода соединениям относятся лизофосфолипиды, которые образуются под действием фосфолипаз при ферментативном отщеплении от молекулы глицерофосфолипидов одной или двух жирных кислот. Они обладают повышенной растворимостью в водных фазах и оказывают мембранолитическое действие (гемолиз эритроцитов, цитолиз). Известно, что лизофосфатидилхо-лин является эхиноцитарным агентом, индуцирующим диск-эхиноцитарную трансформацию эритроцитов [Теннис Р., 1997].
Неблагоприятно сказывается на состоянии эритроцитарной мембраны и увеличение содержания холестерина, определяющего текучесть и вязкость мембраны клеток и оказывающего действие на такие свойства мембраны, как латеральная диффузия рецепторов, ионный транспорт, проницаемость для растворенных веществ [Кожевников Ю.Н., 1985; Захарова Н.Б. и соавт., 1991]. Снижение мембранной текучести, обусловленной, в частности, накоплением молекул холестерина и потерей ненасыщенных жирных кислот, приводит к устранению кооперативных взаимодействий между АТФ-связывающими центрами, что вызывает отрицательную кооперативность по субстрату и в конечном счете снижение активности АТФ-азы [Таганович А.Д. и соавт., 1985; Faloia Е. et al, 1999].
Другой причиной повышения упорядоченности липидных молекул и снижения текучести плазматической мембраны может быть возрастание в среде уровня двухвалентных катионов (Са2+, Mg2+), чреватое уменьшением электростатического отталкивания отрицательно заряженных головок фос-фолипидов [Добрецов Т.Е., 1989]. Поддержание сбалансированности процессов свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты является одним из основных условий стабильности организации клеточных мембран. Выполняя важнейшие функции в поддержании клеточного гомеостаза, активные формы кислорода при определенных условиях способны оказывать выраженное повреждающее действие на клетку. Повышенная продукция АФК, выходящая за границы де-токсицирующих возможностей защитной системы, приводит к развитию окислительного стресса. Источником свободных форм кислорода в зрелых красных клетках крови является оксигемоглобин, который при этом окисляется по мет-типу [Титов В.Ю. и соавт., 1991; Сметанина Н.С. и соавт., 1994].
Механизмы повреждающего действия фенилгидра
Фенилгидразин (ФГ) (химическая формула - C6H5N2H3) — органическое соединение, относящееся к группе производных гидразина, с широким спектром действия на организм человека и животных. При внутрибрюшинном и подкожном введении ФГ быстро проникает в ткани и накапливается в органах с высокой метаболической активностью (печень, почки, головной мозг) [Архипова О.П., 1970; Колла В.Э. и соавт., 1976; Белов А.А., 2000]. Максимальная концентрация ФГ в крови крысы достигается практически сразу после введения. Период полувыведения вещества в первые три часа составляет 44 мин, далее наблюдается медленная фаза с периодом полувыведения 27 ч. У кроликов за 4 сут выводится около 60 % введенного ФГ [Springer D.L. et al., 1981].
Специфическое действие на кровь производных гидразина проявляется окислением оксигемоглобина в metHb и деструкцией НЬ с образованием его производных, содержащих N-фенилпротопорфирин [Гарибов Р.Э. и соавт., 1980; Shetlar M.D. et al., 1985; Портяная Н.И. и соавт., 1998]. В опытах на мышах Л.Х. Костенко и соавт. (1985) отмечали повышение уровня metHb в крови до 40 % в течение первых двух суток после введения ФГ (170 мг/кг). В экспериментах на крысах отмечалось повышенное содержание metHb в крови до 42% в течение двух суток после введения ФГ и до 4,5% в течение первого часа после введения 1,1-диметилгидразина в дозах 170 мг/кг и 107 мг/кг соответственно [Башарин В.А., 2001]. Количественные и временные отличия процесса метгемоглобинобразования после воздействия различных производных гидразина автор объяснял различием в химическом строении токсикантов.
ФГ является мощным прооксидантом, а также ингибирует активность ферментов глутатионредуктазной (глутатионредуктаза, Г-6-ФДГ) и антиоксид антной (глутатионпероксидаза, глутатион-8-трансфераза, каталаза) систем, что ведет к снижению содержания в эритроцитах АТФ и восстановленного глутатиона, редуцирующего metHb [Кушаковский М.С., 1968; Бойт-лер Э.,1981; Башарин С.А., 2001; Шперлинг И.А., 2002].
После введения крысам фенилгидразина в LD50 отмечается повышение концентрации малонового диальдегида в эритроцитах через 1 и 6 ч на 52,3% и 48,1%; активность Г-6-ФДГ снижается на 46,4% и 30,0% соответственно. Активность каталазы через 1 и 3 часа после введения по сравнению с контролем снижается на 23,3% и 29,7% соответственно. В течение первых шести часов опыта концентрация восстановленного глутатиона в эритроцитах снижается с наименьшими значениями через 1 ч после введения ФГ (на 59,1% относительно контроля) [Башарин В. А., 2001]. Клиника интоксикации производными гидразина проявляется полиорганной патологией.
Изменения со стороны крови, вызываемые ФГ, настолько постоянны, что это свойство позволило использовать его для моделирования гемолитической анемии у животных [Малышева Н.М. и соавт., 1964; Костенко Л.Х. и соавт., 1985; Познанская А.А. и соавт., 1989; Магакян Ю.А. и соавт., 1993]. После однократного введения ФГ мышам в дозе 170 мг/кг Л.Х. Костенко и соавт. (1985) наблюдали длительное (до 9 сут включительно) снижение количества эритроцитов (до 40% от контрольных значений на 3 сут исследования).
У крыс после введения им солянокислого ФГ отмечалась анемия в течение 13 сут эксперимента, максимально выраженная на 2-3 сут. При этом гематокрит был снижен в среднем на 70% по сравнению с контролем. Весь период анемии сопровождался выраженными нарушениями морфологической картины красной крови, обратимой агрегации и деформируемости эритроцитов, что объяснялось комплексом патологических факторов, оказывающих влияние как на циркулирующие эритроциты, так и на их костномозговые предшественники [Шперлинг И.А., 2002].
Результаты цитофотометрии клеток красной крови крыс при фенил-гидразиновой анемии [Магакян Ю.А. и соавт., 1993] показали, что в крови выявлялись все содержащие НЬ костномозговые формы клеток. На 4-е сут наибольший вклад в содержание НЬ крови (50%) вносили микроциты. С 5-х сут и до конца периода восстановления важную роль в этом процессе играли макроциты. С 6-х сут возрастало количество нормоцитов, на долю которых к 8-м сут приходилось до 70% НЬ.
Производные гидразина нарушают синтез пиридоксальфосфата, подавляют активность пиридоксалъкиназы [Chatterjee А.К. et al., 1980]. Нарушение метаболизма витамина В}2 при отравлении ФГ позволяет сравнивать возникающие изменения в крови с таковыми при В 12-дефицитной анемии [Корсова Т.Л. и соавт., 1988; Познанская А.А. и соавт., 1989].
Липидный состав мембраны эритроцитов у крыс после острого воздействия нитрита натрия
Проведенное нами исследование показало, что содержание общих ли-пидов в эритроцитарной мембране у животных контрольной группы составляло 1,89±0,05 мг/мг белка, абсолютное количество общих фосфолипидов — 0,98±0,06 мг/мг белка.
Изучение композиции нейтральных липидов эритроцитарной мембраны у интактных животных методом тонкослойной хроматографии выявило преобладание фракции фосфолипидов, составившей 44,12±1,01%. На долю фракций холестерина и эфиров холестерина приходилось 38,10±0,96 и 16,73±1,15% соответственно. Относительное содержание лизофосфатидилхо-лина, фосфатидилинозитолов, сфингомиелина, фосфатидилхолина, фосфатидилсерина и фосфатидилэтаноламина составляло 4,05±0,53; 7,80±0,63; 11,40±0,89; 39,12±0,74; 17,40±0,52 и 19,80±0,91% соответственно.
Исследование абсолютного содержания липидов, их фракционного состава в эритроцитарной мембране у экспериментальных животных после однократного введения 90 мг/кг НН выявило признаки существенной модификации липидной фазы в мембране красных кровяных клеток. Так, в острый период метгемоглобинемии (через 1,5 ч после введения ксенобиотика) уровень общих липидов составлял лишь 70% от соответствующего показателя в контрольной группе (р 0,001), содержание общих фосфолипидов в мембране эритроцитов у подопытных крыс было снижено на 34% от среднестатистической нормы (табл. 4, 5).
Изменение количественного содержания липидов в этот период эксперимента сопровождалось перераспределением фракционного состава липид-ного компонента мембраны красных клеток крови. Так, в эритроцитарной мембране у животных опытной группы регистрировалось снижение уровня общих фосфолипидов на 24% по сравнению с их содержанием в норме на фоне достоверного (р 0,001) увеличения (в 1,6 раза) фракции эфиров холестерина (табл. 4). При оценке фракционного состава фосфолипидов в мембране красных кровяных клеток обращало на себя внимание достоверное (р 0,001) увеличение содержания лизофосфатидилхолина в 3,2 раза (до 12,84+0,98%), сфингомиелина — на 43% (р 0,01) и фосфатидилсерина — на 11% (р 0,05), тогда как количество фосфатидилэтаноламина и фосфатидил-холина, напротив, было снижено по сравнению с их уровнем в мембране эритроцитов у интактных животных на 39 и 16% соответственно (р 0,001). Содержание же остальных фракций липидов (холестерин, фосфатидилинози-толы) в эритроцитарной мембране у крыс через 1,5 ч после воздействия НН не претерпевало существенных изменений (р 0,05) (табл. 4,5).
Практически аналогичный характер модификации липйдного спектра мембраны эритроцитов был выявлен у животных через 1 сут после введения НН. В этот период эксперимента было зарегистрировано достоверное снижение абсолютного содержания общих липидов и общих фосфолипидов в эрит роцитарной мембране у животных опытной группы на 25 и 28% соответственно по сравнению с их уровнем в норме. В мембране клеток красной крови отмечалось накопление эфиров холестерина, содержание которых составляло 26,31±1,23%, что в 1,6 раза превосходило их уровень в мембране эритроцитов интактных животных, а также увеличение количества лизофосфати-дилхолина и сфингомиелина (в 2,7 и 1,4 раза соответственно) по сравнению с нормой.
Вместе с тем, уровень общих фосфолипидов, фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина был статистически значимо снижен по сравнению с аналогичными показателями у животных контрольной группы (табл. 4,5).
На наш взгляд, определенный интерес заслуживают результаты изучения особенностей липидного состава мембраны эритроцитов у животных через 3 сут после воздействия ксенобиотика. В этот период эксперимента были выявлены наиболее выраженные изменения фракционного состава нейтральных липидов мембраны эритроцитов. Так, на фракцию общих фосфолипидов приходилось 28,91±1,03%, что оказалось в 1,5 раза ниже их содержания у животных контрольной группы (р 0,001). Одновременно было обнаружено достоверное увеличение холестериновой фракции общих липидов — на 12% от среднестатистических показателей в контрольной группе (р 0,001) на фоне высоких значений фракции эфиров холестерина. Указанные изменения приводили к возрастанию в 1,7 раза средних значений величины соотношения холестерин/фосфолипиды (1,48±0,06 при 0,86±0,05 в контроле, р 0,001). Модификация фосфолипидного спектра мембраны красных кровяных клеток имела аналогичный характер по сравнению с предыдущими периодами эксперимента.
В последующие сроки наблюдения отмечалась положительная тенденция к восстановлению соотношения изучаемых параметров, однако признаки модификации липидного спектра мембраны эритроцитов регистрировались в течение 13-ти сут от начала эксперимента.
Таким образом, однократное введение НН животным опытной группы приводило к значительному снижению абсолютного содержания общих липидов и общих фосфолипидов в мембране красных клеток крови, которое носило стойкий характер и определялось в течение недели после инициации эксперимента. Фосфолипидный спектр мембраны эритроцитов у крыс после однократного введения НН в дозе 90 мг/кг на протяжении первых 13-ти сут наблюдения характеризовался увеличением доли лизофосфатидилхолина, сфингомиелина и фосфатидилсерина при одновременном снижении уровня фосфатидилэтаноламина и фосфатидилхолина. Наибольшая выраженность указанных изменений была отмечена в острый период метгемоглобинемии (1,5 ч после введения ксенобиотика). Изменения композиции нейтральных липидов мембраны эритроцитов, выявленные у животных в течение 13-сут после воздействия ксенобиотика, характеризовались увеличением относительного содержания холестерина и эфиров холестерина при одновременном снижении доли общих фосфолипидов.
Следует отметить, что в период окончания эксперимента (21-е сут) была достигнута полная нормализация абсолютного и относительного содержания липидов эритроцитарной мембраны у животных опытной группы (табл. 4,5).
Таким образом, исследование особенностей липидного состава эритроцитарной мембраны у животных в динамике индуцированной действием нитрита натрия метгемоглобинемии позволило получить фактические данные, указывающие на факт выраженной дезорганизации липидной компоненты мембраны красных кровяных клеток в ранние сроки после введения ксенобиотика.
Исследование активности NaT,K+-ATOa3bi в мембране эритроцитов у крыс после острого воздействия солянокислого фенилгидразина
Как показало проведенное в нашей лаборатории исследование, в мембране эритроцитов периферической крови у животных, подвергшихся однократному воздействию ФГ в дозе 150 мг/кг, в течение всего периода наблюдения (21 сут) отмечалось статистически значимое угнетение активности Ка+,К+-АТФазы. Уже через 1 сут от начала эксперимента средний уровень активности Na K-АТФазы оказался равным 0,101±0,003 мкмоль Р,- /час-мг белка, что составило 31% от соответствующих значений у животных контрольной группы (р 0,001). Еще более значимое угнетение активности этого ионтранспортирующего фермента было выявлено на 3-й сут наблюдения: средняя величина регистрируемого параметра составляла 0,049+0,003 мкмоль Pt /час-мг белка, что оказалось в 6,7 раза ниже аналогичного показателя у животных контрольной группы.
В дальнейшем отмечалась тенденция к нормализации активности изучаемого энзима (рис.6). Однако активность Na ,К -АТФазы на 21-е сут от начала опыта оказалась равной 0,290+0,005 мкмоль Р,- /час-мг белка, оставаясь, по-прежнему, достоверно (р 0,001) сниженной по сравнению с аналогичным показателем в норме.
В целом, результаты проведенного нами исследования указывают на выраженную структурную дезорганизацию и нарушение функциональной активности мембраны эритроцитов у животных, подвергшихся острому воздействию солянокислого фенилгидразина. Необходимо отметить, что у крыс через 1,5 ч после однократного введения солянокислого ФГ выделение эритро-цитарных мембран было невозможным, так как при центрифугировании расслоения фаз между гемоглобином и мембранами не происходило, что позволило уже на этом этапе исследования предположить факт выраженных нарушений структуры мембраны эритроцитов в острый период фенилгидрази-ниндуцированной метгемоглобинемии.
