Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Проблема транспорта биологически активных веществ и лекарственных препаратов с целью увеличения терапевтической эффективности и ограничения побочных эффектов является одной из центральных в современной медицинской биотехнологии. Это связано с тем, что используемые в настоящее время переносчики должны отвечать целому ряду признаков и способствовать решению сложных задач. Во-первых, попадая в организм биологически активные вещества (БАВ) и лекарственные препараты очень быстро разрушаются в печени в системе метаболизма ксенобиотиков, полностью так и не реализовав своего лечебного действия. Во-вторых, у многих людей к лекарственным препаратам развивается лекарственная аллергия и длительное введение их, особенно в больших дозах, оказывается невозможным. В-третьих для лечения ряда патологических состояний (опухолевые процессы, ферментативная, гормональная недостаточность, и т.д.) обязательно необходима доставка лекарственных препаратов непосредственно в клетку, что связано с преодолением клеточного барьера. В-четвертых, эффективные переносчики необходимы для транспорта генетического материала в ядра клеток.
Особое место среди возможных переносчиков лекарственных препаратов занимают липопротеины (ЛП) плазмы крови. После открытия рецептор-опосредованного механизма поглощения ЛП клетками американскими учеными Брауном и Гольдштейном в конце 70-х годов внимание к этим структурам, как потенциальным переносчикам лекарственных препаратов, сильно возросло. Липопротеины представляют собой одну из самых больших групп сложных плазменных белков крови. ЛП впервые были описаны Машбефом в 1929 г. Было показано, что это сложные молекулярные ассоциации, состоящие из белка и липидов. ЛП осуществляют транспорт липидов из мест их всасывания и синтеза в жировые депо или другие органы, а также обеспечивают нормальный об-
мен липидов между кровью и клетками организма. Это, пожалуй, основная роль ЛП.
Однако повышенный интерес исследователей к этим структурам вызван, как оказалось, и другими характерными свойствами, среди которых можно выделить следующие: ЛП осуществляют регуляцию обмена холестерина не только в плазме крови, но и посредством рецепторов внутри клетки; ЛП оказывают влияние на функцию эндокринной системы, в частности, на стероидогенез; ЛП являются одним из регуляторов клеточного иммунитета и, наконец, нельзя не отметить появившиеся в последнее время данные о способности ЛП связывать и транспортировать в клетку некоторые гидрофобные соединения.
Прояснилась роль некоторых внутриклеточных белков в связывании и транспорте ксенобиотиков метилхолантренового ряда (тетрахлордибензодиоксина и бензо(а)пирена). Soues и соавт. (1989) удалось выделить из цитоплазмы рецептор Ah с молекулярной массой 90 кДа и белок 4S, с высокой специфичностью связывающие соединения метилхолантренового ряда. Оказалось, что рецептор Ah (aryl hydroxylase receptor) регулирует также индукцию цитохрома Р-450, в частности, форму CYPIA1, метаболизирующую ксенобиотики метилхолантренового ряда в печени и стенке аорты крыс (Thirman е.а.,1994). Предполагается, что многие полициклические соединения на этих первых этапах индукции ферментов микросомальной системы окисления ксенобиотиков связываются с рецептором Ah, затем комплекс переносится из цитоплазмы в ядро.
Несмотря на успехи, достигнутые в изучении внутриклеточных рецепторов для бензо(а)пирена и других ксенобиотиков метилхолантренового ряда, рецепторов для них на поверхности клетки выявить до сих пор никому не удалось. Таким образом, механизм проникновения соединений типа бензо(а)пирена в клетку остается неясным. Остается практически невыясненным вопрос, каким образом такое гидрофобное соединение как бензо(а)пирен транспортируется из легких в клетки печени, сосудистой стенки и других тканей.
Не меньшее внимание исследователей направлено на идентификацию макромолекул, связывающих стероидные гормоны в крови, в надежде выявить специфические метаболические пути доставки и попадания гормонов в клетки. Идентифицировано несколько плазменных белков, которые специфически или неспецифически связывают стероидные гормоны (транскортин, сексстероид-связывающий глобулин, альбумин). Однако так и не удалось выделить мембранные рецепторы для свободных стероидов или же их комплексов с белками, хотя расчетные данные в координатах Скэтчарда свидетельствуют об их существовании на мембранах гепато-цитов (Панин Л.Е.и др., 1992). По-прежнему наиболее популярной на сегодняшний день остается модель простой пассивной диффузии свободного стероида через клеточную мембрану (Pardridge, 1981; 1985). Эта модель полностью исключает рецептор-опосредованный механизм проникновения гормонов в клетку.
Цель и задачи исследования. Цель работы - изучить роль липопротеинов плазмы крови в транспорте биологически активных веществ и ксенобиотиков в клетки организма.
Для этого были поставлены следующие задачи:
-
Изучить динамику и особенности процессов поглощения ЛП различных классов плотности органами и тканями крыс.
-
Изучить внутриклеточное распределение меченных по белковому компоненту ЛП плазмы крови крыс в зависимости от функционального состояния организма.
-
Провести внутриклеточную иммунохимическую детекцию некоторых аполипопротеинов в клетках печени крыс. Для достижения этой задачи необходимо было провести оптимизацию метода твердофазного иммуноферментного определения аполипопротеинов, включая получение соответствующих антигенов и антител, выбор рабочих режимов, а также способов химической обработки биологического материала для более полного выявления антигенных детерминант.
4. Изучить роль ЛП в транспорте биологически ак
тивных веществ (стероидные и тиреоидные гормоны).
-
Изучить взаимодействие гидрофобных и гидрофильных ксенобиотиков с ЛП плазмы крови.
-
Показать роль отдельных аполипопротеинов в связывании биологически активных веществ (стероидные гормоны, тироксин) и липофильных ксенобиотиков (бензо(а)пирен). Для этого на изолированных, хроматографически очищенных аполипопротеинах изучить механизмы их взаимодействия с названными лигандами и получить основные физико-химические характеристики белок-лигандного взаимодействия изучаемых комплексов.
7. Используя ЛП в качестве транспортной формы для
различных гидрофобных лигандов изучить поглощение и
распределение этих лигандов между органами и тканями
крыс.
Научная новизна. В опытах in vivo и in vitro впервые показано, что после поглощения меченые белковые компоненты ЛП связываются с различными клеточными структурами: ядрами, митохондриями, лизосомами, микросомами. Отмечалось перераспределение метки в зависимости от функционального состояния организма. В частности, физическая нагрузка снижала поглощение печенью ЛПНП и увеличивала поглощение ЛПВП надпочечниками. Накопление метки наблюдалось в цитозоле и во фракции мелких мембран. Корти-зол увеличивал включение меченых ЛПОНП в митохондрии печени. Адреналин повышал содержание меченых ЛПНП во фракции крупных клеточных мембран и снижал уровень меченых ЛПВП в митохондриях печени.
Выявлена селективность поглощения меченных по белковому компоненту ЛП органами и тканями: из 12 исследованных тканей ЛПОНП больше поглощались печенью, а ЛПВП -надпочечниками. Это позволяет использовать различные классы ЛП для избирательного транспорта лигандов в определенные органы.
Опыты с меченными коллоидным золотом частицами ЛПВП показали, что ЛПВП связываются с рецепторами на
поверхности макрофагов и эндотелиальных клеток печени. При этом, только в макрофагах осуществлялся транспорт ЛПВП-конъюгатов в лизосомы, т.е., по-видимому, именно в этих клетках происходит ферментативная модификация ЛПВП. Эндотелиальные клетки связывают и интернализуют частицы ЛПВП, а также осуществляют их активный транспорт в пространство Диссе печЪни.
Для проведения иммунохимических исследований выделены и хроматографически очищены апоА-I, В и Е плазмы крови человека и крысы. Полученные специфические антитела к данным белкам показали иммунохимическую гетерогенность апоА-I и В у человека и крысы. Видовой гетерогенности не отмечено для апоЕ, что позволило использовать антитела к апоЕ для исследований как на крысином, так и на человеческом материале.
С целью выявления скрытых антигенных детерминант апоА-I в частицах ЛПВП предложен новый метод химической обработки биологических образцов с использованием диметилсульфоксида.
Проведена характеристика и иммунохимическая идентификация цитоплазматического пула апоА-I в гепатоцитах крыс. Методом иммуноэлектроблоттинга в цитоплазме выявлена изоформа с молекулярной массой порядка 31,5 кДа, которая является предшественником внутриклеточного синтеза этого белка, т.н. препроапоА-1. Другая полоса по элек-трофоретической подвижности близко соответствовала зрелой форме апоА-I. Впервые показано присутствие двух белковых фракций с молекулярными массами около 26 и 23 кДа, являющихся, по всей вероятности, продуктами лимитированного внутриклеточного протеолиза.
Показано присутствие белков, иммунохимически идентичных апоА-I, в хроматине ядер печени крыс. АпоА-1-иммунореактивность выявлялась во фракции суммарного хроматина, транскрипционно неактивного хроматина, тран-скрипционно активного хроматина и ядерного матрикса. Удельная апоА-1-иммунореактивность транскрипционно активного хроматина и ядерного матрикса была вдвое выше,
чем суммарного и транскрипционно неактивного хроматина. С помощью иммуноэлектроблоттинга обнаружено две фракции белка: первая фракция - с молекулярной массой, соответствующей апоА-1 (28,3 кДа); вторая фракция - с молекулярной массой около 14 кДа. Первый белок присутствовал в транскрипционно активном хроматине и ядерном матриксе. Второй белок - только в транскрипционно неактивном хроматине. Предполагается определенная роль аполипопротеи-нов в поддержании хроматина в транскрипционно активном состоянии, а также участие аполипопротеинов в транспорте в ядро некоторых биологически активных веществ и ксенобиотиков.
Впервые подробно изучен целый спектр биологически активных веществ и ксенобиотиков, способных связываться и транспортироваться с ЛП. Это стероидные гормоны, тироксин, дигидроальпренолон, цитохалазин, актиномицин Д, бензилпенициллин, бензо(а)пирен, бензантрацен .
Для доказательства возможности селективной доставки лигандов к органам и тканям-мишеням использовали меченый тритием бензо(а)пирен, а также такие естественные лиганды как меченые углеродом холестерин и эфир холестерина (холестерин-олеат). Данные подтвердили результаты о возможной селективной доставке лигандов с ЛПОНП в печень, а с ЛПВП - в надпочечники.
Установлено, что ЛПВП являются основной транспортной формой холестерина и прегненолона в митохондрии надпочечников крыс. В опытах с нагруженными неэстери-фицированным холестерином и прегненолоном ЛПВП впервые показано, что, во-первых, гидрофобные лиганды в составе ЛП проникают в отдельные субклеточные структуры, а именно: в митохондрии и микросомы; во-вторых, переносимые с ЛП лиганды включаются в метаболический процесс клетки и осуществляют регуляторное влияние. Эффект проявлялся при инкубации надпочечников в присутствие АКТГ.
Обнаружено, что третий подкласс ЛПВП обладает более выраженным стимулирующим эффектом на стероидогенез по сравнению со вторым подклассом ЛПВП. Этот подкласс и
необходимо использовать в качестве транспортной формы для селективной доставки лигандов в надпочечники и, по-видимому, в яичники.
Теоретическая и практическая значимость. Внесен важный вклад в понимание механизмов проникновения липофильных ксенобиотиков в клетку. Результаты исследования позволили сформулировать гипотезу о том, что липофильные ксенобиотики и некоторые вещества гормональной природы проникают в клетку посредством рецепторно-обусловленного эндоцитоза в составе липопротеиновых комплексов.
Новый способ химической обработки биологического материала с целью более полного выявления скрытых антигенных детерминант оказался пригоден для изучения внутриклеточной локализации аполипопротеинов, а также для определения концентрации аполипопротеинов в самых различных биологических средах.
Впервые с помощью данного метода удалось оценить состояние почечного барьера у здоровых людей и у больных с почечной патологией . Присутствие в моче больных с хроническим пиелонефритом как апоА-I, так и апоВ важно не только для прогноза тяжести состояния, но также для диагностики и оценки эффективности лечения.
Предложен простой и удобный метод оценки связывания гидрофобных соединений с липопротеинами плазмы крови или с любыми другими транспортными белками. Метод позволяет количественно оценить характер взаимодействия ли-ганд-белок.
Совокупность полученных фактов свидетельствует о перспективности использования липопротеинов и их белковых компонентов в качестве транспортных форм для биологически активных веществ и лекарственных препаратов в клинических и экспериментальных исследованиях.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. После интернализации не все аполипопротеины подвергаются обязательной лизосомальной деградации, часть из них взаимодействует с другими клеточными структурами (ядрами, митохондриями, микросомами и цитозолем) и уча-
ствует в регуляции метаболических процессов. На распределение аполипопротеинов между клеточными структурами оказывает влияние функциональное состояние организма.
-
Предложенный метод для иммуноферментного определения аполипопротеинов пригоден для количественной оценки последних в плазме крови, моче, клетках, субклеточных структурах и другом биологическом материале. Метод может использоваться для решения как теоретических, так и клинических задач.
-
В ядерной фракции гепатоцитов крыс присутствует белок, по электрофоретическим свойствам и иммунохимически идентичный апоА-I. Удельная апоА-1-иммунореактивность транскрипционно активного хроматина и ядерного матрикса вдвое выше, чем суммарного и транскрипционно неактивного хроматина.
4. АпоА-1-иммунореактивностью в ядрах обладают две
фракции белка: первая - с молекулярной массой, соответ
ствующей зрелой форме апоА-1 (28,3 кДа); вторая - с молеку
лярной массой около 14 кДа. Первый белок присутствует в
транскрипционно активном хроматине и ядерном матриксе,
второй белок - только в транскрипционно неактивном хрома
тине.
-
Липопротеины плазмы крови связывают и транспортируют в клетки организма различные по структуре соединения, такие как бензо(а)пирен, бензантрацен, актиномицин Д, ци-тохалазин, стероидные и тиреоидные гормоны.
-
Основным белком, связывающим бензо(а)пирен в ЛП-частицах является аполипопротеин В.
-
Аполипопротеин A-I проявляет достаточно высокий аффинитет по отношению к тироксину и стероидным гормонам.
-
Комплексы гидрофобных лигандов с ЛП могут использоваться для их направленного транспорта не только в органы и ткани организма, но и в отдельные клеточные структуры. Переносимые с ЛП лиганды включаются в метаболический процесс клетки и осуществляют регуляторное влияние.
Апробация материалов диссертации. Материалы работы докладывались на III Всесоюзном симпозиуме "Структура, биосинтез и превращение липидов в организме животного и человека" (Ленинград, 1978), IV Всесоюзном биохимическом съезде (Москва, 1979), Всесоюзной конференции "Структура и функции лизосом" (Новосибирск, 1980), III Всесоюзной конференции по патологии клетки (Москва, 1982), IV Всесоюзном симпозиуме по биохимии липидов (Киев, 1983), Всесоюзной конференции "Медиаторы иммунного ответа в эксперименте и клинике" (Горький, 1983), V Всесоюзном симпозиуме по биохимии липидов (Алма-Ата, 1987), Всесоюзной конференции "Здоровье человека в Сибири" (Новосибирск, 1989), IV Всесоюзном съезде патофизиологов (Кишинев, 1989), X Всесоюзном симпозиуме "Структура и функция клеточного ядра" (Гродно,1990), 8 Международной конференции по органической и биоорганической химии (Рига, 1991), IV Всесоюзной конференции "Люминесцентный анализ в биологии и медицине" (Москва, 1992), XII Международном конгрессе фармакологов (Монреаль, 1994).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 53 научные работы, из них 30 статей в центральных журналах. Получено 2 авторских свидетельства на изобретение:
1) А/с № 1506671 "Способ введения биологически активных веществ в организм животного" (Панин Л.Е., Поляков Л.М., Розуменко А.А.);
2) А/с № 1737340 "Способ определения апопротеина A-I в сыворотке крови (Поляков Л.М., Потеряева О.Н., Панин Л.Е., Загребельный С.Н.)
Объем и структура диссертации. Диссертация содержит 294 страницы машинописи, из них собственно текст - 231 страница. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, пяти глав собственных исследований, обсуждения результатов и выводов. В списке литературы приведены 35 отечественных и 450 иностранных источников.
Весь материал, представленный в диссертации, получен, обработан и проанализирован лично автором.
Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Института биохимии РАМН.
Автор выражает глубокую благодарность за консультативную помощь и поддержку "на всех этапах выполнения работы академику РАМН Панину Льву Евгеньевичу.
