Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4
ВВЕДЕНИЕ 5
5 Глава 1. Обзор литературы. Эпидемиология, этиология, осо- 17 бенности патогенеза и клиники острых и хронических лейкозов. Роль иммунной системы в возникновении этих заболеваний
Эпидемиология и этиология острых и хронических 17 лейкозов
Особенности патогенеза и клиники острых лейко- 23 зов
Особенности патогенеза и клиники хронических 31 лейкозов
Роль иммунной системы в патогенезе острых и 40 хронических лейкозов
Функциональная активность клеток иммунной сие- 45 темы в зависимости от внутриклеточного метаболизма
Глава 2. Материал и методы исследования 54
Материал исследования 54
Методы исследования 56
Клинические методы исследования 56
Иммунологические методы исследования 59
Биолюминесцентное определение активности 61 НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах
2.3.4. Статистические методы исследования 64
Глава 3. Характеристика наблюдаемых больных 67
Заболеваемость и структура острых и хронических 67 лейкозов в г. Красноярске и Красноярском крае за период 2000 - 2005 г.г.
Клиническая картина больных острыми лейкозами 82
Клиническая картина больных острым нелимфоб- 89 ластным лейкозом
Клиническая картина больных острым лимфобла- 102 стным лейкозом
Сравнительный анализ клинических картин боль- 114 ных острым нелимфобластным лейкозом и острым лимфобластным лейкозом
3.3. Клиническая картина больных хроническими лей- 117
козами
3.3.1. Клиническая картина больных хроническим миело- 120
лейкозом
Клиническая картина больных хроническим лим- 129 фолейкозом
Сравнительный анализ клинических картин боль- 138 ных хроническим миелолеикозом и хроническим лимфолейкозом
3.4. Сравнительный анализ клинических картин боль- 140
ных острыми и хроническими лейкозами Глава 4. Состояние иммунного статуса и активность НАД- и 143 НАДФ- зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах крови у больных острым нелимфобластным, острым лимфобластным лейкозами, хроническим миелолеикозом и хроническим лимфолейкозом
Особенности состояния иммунного статуса и уров- 143 ней активности внутриклеточных ферментов лимфоцитов крови на разных стадиях острого нелим-фобластного лейкоза
Особенности состояния иммунного статуса и уров- 174 ней активности внутриклеточных ферментов лимфоцитов крови на разных стадиях острого лимфоб-ластного лейкоза
Прогнозирование развития инфекционных и гемор- 207 рагических осложнений у больных острыми лейкозами после проведения химиотерапии
Особенности состояния иммунного статуса и уров- 211 ней активности внутриклеточных ферментов лимфоцитов крови на разных стадиях хронического миелолейкоза
Особенности состояния иммунного статуса и уров- 226 ней активности внутриклеточных ферментов лимфоцитов крови на разных стадиях хронического лимфолейкоза
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 246
ВЫВОДЫ 276
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 279
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 280
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
Введение к работе
Актуальность проблемы. Острые и хронические лейкозы остаются самыми распространенными заболеваниями среди всех опухолевых заболеваний крови. Острые лейкозы (ОЛ) занимают одно из первых мест по частоте встречаемости среди гемобластозов. В год заболеваемость ОЛ составляет в среднем 5 случаев на 100000 населения, при этом 75% случаев заболевания выявляется у взрослых больных (Ковалева Л.Г., 1990; Lukens J.N., 1993; Scheinberg D.A. et al, 1997). На долю хронического миелолейкоза (ХМЛ) приходит 20% от всех лейкозов. Ежегодная заболеваемость ХМЛ составляет 1-1,5 на 100000 населения во всех странах (Brincker Н., 1982; Call Т. et al, 1994). Хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) - распространенный вид лейкоза в странах Европы и Северной Америки. Здесь он выявляется в 30% случаев (Bloomfield CD. et al, 1993). Ежегодная заболеваемость ХЛЛ составляет 3-3,5 на 100000 населения, а среди лиц старше 65 лет — до 20 на 100000 (Linet M.S., Blattner W.A., 1988). В последние годы наблюдается тенденция к увеличению случаев заболеваний ОЛ и ХЛ в мире, в общем, и в России и по Красноярскому краю в частности, а также наблюдается рост числа госпитализаций по данному поводу. Все это свидетельствует об актуальности изучения данной темы.
Анализируя показатели результатов лечения за 2000 - 2005 год, выявлено, что полные клинико-гематологические ремиссии у больных ОЛ в Красноярске и Красноярском крае достигаются в 42,8 - 58,6% случаев, при этом ранний летальный исход составляет от 24,3 — 40,5% случаев. В Российском научном гематологическом центре РАМН и зарубежных гематологических клиниках полные клинико-гематологические ремиссии достигаются в среднем в 75-85% случаев, а летальность составляет 8 — 12% (Воробьев А.И., 2002; Поспелова Т.И., И.Н. Нечунаева, 2004; Лосева М.И. и др., 2005). Все это свидетельствует о необходимости поиска дополнительных диагностических средств, которые улучшат исходы больных ОЛ в Красноярском крае.
В большинстве случаев конкретная причина возникновения ОЛ и ХЛ остается неизвестной. Однако существуют предрасполагающие факторы, которые значительно увеличивают риск развития этого заболевания. На первом месте, можно выделить врожденные и приобретенные хромосомные аномалии. В частности, изменения, связанные с 21-й парой хромосом, могут приводить к развитию лейкоза. У людей с синдромом Дауна вероятность возникновения ОЛ в 20 раз выше, чем в здоровой популяции. Большинство авторов отмечают возникновение генетических и хромосомных нарушений при ОЛ (Козлов И. с соавт., 2005; Alvarez Y. et al, 2005; Bowen D.T. et al, 2005; Christiansen D.H. et al, 2005; Nanri T. et al, 2005; Schnittger S. et al, 2005; Sut-cliffe M.J. et al, 2005; Verhaak R.G. et al, 2005; Yanada M. et al, 2005; Chrzanowska K.H. et al, 2006; Harani M.S. et al, 2006; Yip S.F. et al, 2006).
Роль вирусов в развитии лейкозов доказана в отношении РНК-ретровирусов, в лейкемических клетках обнаруживается обратная транскрип-таза, свидетельствующая об инфицировании ретровирусами (Савченко В.Г., Паровичникова Е.Н., 2001). У людей доказано, что вирус HTLV-1 вызывает Т-клеточный лейкбз/лимфому взрослых (Scheinberg D.A. et al, 1997). Имеются данные, что вирус Эпштейна-Бара, ДНК-вирус, участвует в возникновении лимфомы Беркитта, ряда В-клеточных ОЛЛ и лимфом, ассоциированных с вирусом приобретенного иммунодефицита (Волкова М.А., 2001).
Четко доказана взаимосвязь между ионизирующей радиацией при взрыве атомной бомбы, а также химио- и радиотерапией по поводу других опухолей с повышенным риском возникновения ОЛ (Перехрестенко Т.П. с соавт., 2002; Duhrsen U, 2005; Klymenko S. et al, 2005; Khuder S.A., Mutgi A.B., 2005; Visser O. et al, 2005).
Доказано, что между курением и риском развития ОЛ существует дозо-вая зависимость, которая особенно наблюдается у лиц старше 60 лет (Greer J.P., Kinney М.С., 1993; Scheinberg D.A. et al, 1997). Длительное воздействие бензола, мустаргена, прокарбазина, хлорбутина, циклофосфана, ломустина,
тенипозида, этопозида повышает риск возникновения ОЛ (Pui С.-Н, 1989; Scheinberg D.A. et al, 1997).
При ХМЛ не выявлены признаки наследования заболевания, однако, известны отдельные сообщения о случаях семейного заболевания (Weiner L., 1965; Tokunata G.K. et al, 1968). ХМЛ выявляется чаще у лиц, переживших атомную бомбардировку, и среди больных спондилоартритом, получавшим рентгенотерапию (Lange R. et al, 1954; Heyssel R. et al, 1960; Court Brown W., Abbott J., 1965). Четко доказана роль бензола в возникновении ХМЛ (Infante P.F. etal, 1977).
ХЛЛ является частой формой лейкоза у кровных родственников, как по горизонтальной, так и по вертикальной линии (Fraumeni J.F. et al, 1969; Un-dritz E., Schnyder F., 1971; Cutter J., 1992;). При многочисленных эпидемиологических исследованиях до сих пор не удалось оценить роль каких-либо мутагенных факторов (радиация, химические агенты или алкилирующие препараты и др.), как и роль вируса Эпштейна - Барр, в возникновении ХЛЛ (Волкова М.А., 2001; Rai K.R., Patel D.V., 1997; Mann D.L. et al, 1998). Таким образом, в настоящее время до конца точно неизвестны этиологические факторы, вызывающие появление и развитие ОЛ и ХЛ. Хромосомные аномалии, вирусы, ионизирующая радиация, химио- и радиотерапии, курение, химиче-ские вещества и наследственный фактор могут способствовать появлению того или иного гемобластоза, увеличивать риск возникновения заболевания, однако до конца неизвестна первопричина заболевания.
Многочисленные этиологические факторы, воздействуя на человека, способствуют возникновению мутации в генетическом материале клоноген-ной кроветворной клетки. В результате этого на молекулярном уровне происходят события, приводящие к нарушению контроля над клеточным циклом, изменению процесса транскрипции и продукции ряда ключевых белков, и появлению ОЛ. В результате бесконтрольной пролиферации в отсутствии дифференцировки накапливаются патологические клетки (Ichikawa Н., 2005).
Таким образом, в основе возникновения ОЛ лежит мутация клоноген-ной кроветворной клетки с последующими событиями, приводящими к нарушениям пролиферации, дифференцировки и апоптоза клеток. В настоящее время полностью не изучены патогенетические факторы, приводящие к срыву нормальной функции клетки и запуску патологических процессов, в конечном итоге приводящих к возникновению ОЛ.
В основе патогенезе ХМЛ лежит образование слитного гена BCR-ABL, продуцирующего белок со значительно более выраженной тиразинкиназной активностью, чем его нормальный прототип, который обуславливает последовательную цепь событий в клетках, приводящих к увеличению клеточной пролиферации и дифференцировки клеток-предшественников (Konopka J.B. et al, 1984; Kurzrock R. et al, 1987; Pendergast A.M. et al, 1991; Afar D.E. et al, 1994; Sawyers C.L., 1993).
Большую роль в патогенезе ХМЛ играет нарушение адгезии лейкеми-ческих клеток к клеткам стромы костного мозга и белкам стромальной матрицы, нарушение дифференцировки клеток-предшественников с появлением очагов экстрамедуллярного гемопоэза (Verfaillie СМ. et al, 1992; Bhatia R., Verfaillie СМ., 1995; Lundell B.I., 1996; Bhatia R. et al, 1997). Клетки - носители гена BCR-ABL имеют меньшую чувствительность к факторам, вызывающим апоптоз (Bedi A. et al, 1994; McGahon A. et al, 1994; Fernandes R.S. et al, 1996; Cortes J. et al, 1997), что приводит не только к увеличению массы опухолевых клеток, но и к эволюции болезни в связи с выживанием клеток с добавочными мутациями (Leake R., 1996; Lotem J., Sachs L., 1996).
Образование слитного гена BCR-ABL является необходимым, но не единственным событием, которое обусловливает возникновение ХМЛ, также большую роль играет транслокация хромосом в большинстве предшественников клеток крови (Greenberg В. et al, 1978; First, 1978; Lebien T.W. et al, 1979; Biernaux С et al, 1995; Issa J.P. et al, 1997; Bose S. et al, 1998).
Еще одним фактором, обусловливающим развитие онкологического заболевания, является снижение реактивности иммунной системы. Причем, с одной стороны доказано, что именно иммунодефицитное состояние определяет развитие злокачественной опухоли (Олейник Е.К. с соавт., 2001; Антонов В.Г., Козлов В.К., 2004; Kotlan В. et al., 2005). С другой стороны, накапливается все больше сведений, что и сама опухоль индуцирует развитие иммунной супрессии, которая может проявляться в широком диапазоне (от незначительной степени до полной анергии) (Олейник Е.К. с соавт., 2001; Chiou S.H. et al., 2005). Механизмы, ответственные за нарушения функции иммунной системы, в настоящее время полностью не определены. В целом, установлено, что у больных онкологическими заболеваниями дисфункция иммунной системы проявляется в нарушении функции антигенпрезентирующих клеток, эффекторной функции Т-лимфоцитов, уменьшении пролиферативно-го индекса и экспрессии отдельных субъединиц рецептора интерлейкина-2, а также в нарушении баланса синтеза цитокинов (Liu A.Y. et al., 2004; Bais A.G. et al., 2005; Perez-Perez G.I. et al., 2005).
Несмотря на ряд проведенных исследований, многое в патогенезе ОЛ и ХЛ остается неизученным. Недостаточно полно исследованы механизмы иммунной реактивности при ОЛ и ХЛ. Полностью отсутствуют исследования метаболического статуса клеток иммунной системы при данных заболеваниях. В то же время известно, что интенсивность метаболических процессов в значительной степени определяет функцию клеток иммунной системы. При этом наибольшей информативностью для исследования метаболизма лимфоцитов являются окислительно-восстановительные ферменты. Это связано с тем, что, являясь основными переносчиками электронов в клетке, они осуществляют ключевые реакции клеточного метаболизма и координируют сопряженные метаболические пути (Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф., 1998; Кнорре Д.Г., Мызина С.Д., 1998; Грязева Н.И. с соавт., 2000; Комиссарова И.А. с соавт., 2001). Не исследованными остаются особенности иммунного статуса,
состояние метаболизма клеток иммунной системы в зависимости от вида лейкоза и стадии заболевания.
Таким образом, проведение комплексного исследования на современном методическом уровне, включающего изучение состояния иммунного статуса и активности окислительно-восстановительных ферментов лимфоцитов крови, в зависимости от вида лейкоза и стадии заболевания, позволит не только получить новые сведения о патогенезе ОЛ и ХЛ, но и разработать новые патогенетически обоснованные методы диагностики и прогноза заболевания.
Цель: Установить особенности клинических проявлений, иммунопатогенеза и механизмов нарушения метаболического статуса лимфоцитов у больных ОЛ и ХЛ и разработать метод прогнозирования развития инфекционных и геморрагических осложнений после химиотерапии у больных ОЛ. Задачи исследования:
Изучить заболеваемость и структуру ОЛ и ХЛ за период с 2000-2005гг на примере г. Красноярска и Красноярского края.
Изучить особенности клинических проявлений больных острыми и хроническими лейкозами в зависимости от вида заболевания и стадии.
Исследовать особенности состояния клеточного и гуморального звеньев иммунитета у больных острыми и хроническими лейкозами в зависимости от вида заболевания и стадии.
Изучить изменения уровней активности НАД- и НАДФ- зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах крови у больных острыми и хроническими лейкозами и установить их закономерности в зависимости от вида заболевания и стадии.
Изучить взаимосвязи особенностей клеточного и гуморального звеньев иммунитета больных острыми и хроническими лейкозами с изменениями уровней активности НАД- и НАДФ- зависимых дегидрогеназ в лим-
п фоцитах крови и установить закономерности между ними в зависимости от вида заболевания и стадии.
Установить иммунопатогенетические особенности, способствующие прогрессированию ОЛ и ХЛ, в зависимости от стадии заболевания.
На основании выявленных иммунометаболических особенностей у больных ОЛ разработать новые принципы прогнозирования развития инфекционных и геморрагических осложнений после химиотерапии у больных ОЛ.
Научная новизна. Впервые на современном методическом уровне проведено комплексное исследование активности НАД(Ф)-зависимых дегид-рогеназ лимфоцитов и иммунологического статуса у больных ОНЛЛ, ОЛЛ, ХМЛ и ХЛЛ в зависимости от стадии заболевания.
Впервые выявлены иммунологические и метаболические особенности у больных ОНЛЛ, ОЛЛ, ХМЛ и ХЛЛ в зависимости от стадии заболевания.. Впервые установлено, что у всех больных ОНЛЛ, ОЛЛ, ХМЛ и ХЛЛ вне зависимости от стадии заболевания выявляются иммунологические нарушения и изменения активности внутриклеточных ферментов лимфоцитов, выраженность которых зависит от вида заболевания и усугубляются по мере прогрессировав ия заболевания.
Впервые охарактеризована активность внутриклеточных ферментов лимфоцитов крови в сопоставлении с данными иммунного статуса у больных ОНЛЛ, ОЛЛ, ХМЛ и ХЛЛ в зависимости от стадии заболевания. Проведение данного исследования на современном методическом уровне позволило получить информацию об особенностях интенсивности метаболических процессов в лимфоцитах крови и оценить их роль в прогрессировании ОЛ и ХЛ. Впервые на основании анализа активности НАД- и НАДФ- зависимых дегид-рогеназ в лимфоцитах крови больных лейкозами сформировано представление о метаболическом механизме иммунной недостаточности при ОНЛЛ, ОЛЛ, ХМЛ, ХЛЛ в зависимости от стадии заболевания.
Впервые определена роль обменных процессов в различных компар-тментах лимфоцитов и взаимосвязи между ферментами биоэнергетической направленности и ферментами, несущими преимущественно пластическую функцию, у больных лейкозами в зависимости от вида заболевания и стадии.
Сравнительное исследование популяционного и субпопуляционного состава лимфоцитов крови у больных лейкозами позволило охарактеризовать иммунные механизмы реагирования в зависимости от вида гематологического заболевания и стадии.
Впервые исследование метаболического статуса лимфоцитов крови позволило выявить нарушения, возникающие при появлении осложнений у больных ОЛ и прогрессировании заболеваний у больных ОНЛЛ, ОЛЛ, ХМЛ и ХЛЛ. Впервые установлены закономерности между особенностями клеточного и гуморального иммунитета больных лейкозами с изменениями уровней активности НАД- и НАДФ- зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах крови в зависимости от вида заболевания и стадии.
Впервые на основании выявленных наиболее патогенетически значимых уровней активности НАД- и НАДФ- зависимых дегидрогеназ лимфоцитов крови определен прогноз вероятности возникновения инфекционных и геморрагических осложнений у больных ОЛ после проведенной химиотерапии. Впервые на основании изучения активности НАД- и НАДФ- зависимых дегидрогеназ у больных ОНЛЛ, ОЛЛ, ХМЛ и ХЛЛ установлены особенности интенсивности анаэробного и аэробного дыхания, а также уровни метаболических реакций, определяющих состояние пластического обмена.
Впервые на основании комплексного изучения и анализа иммунофено-типических показателей и метаболических параметров лимфоцитов сформированы иммунопатогенетические механизмы, способствующие прогрессиро-ванию ОНЛЛ, ОЛЛ, ХМЛ и ХЛЛ.
Результаты данного исследования, проведенного с использованием высокоинформативных методов, показали, что перестройка метаболического
статуса лимфоцитов адекватно отражает состояние иммунного гомеостаза, и позволили сформулировать концепцию о метаболически-зависимых иммунных нарушениях у больных ОНЛЛ, ОЛЛ, ХМЛ, ХЛЛ от стадии заболевания. На основании этого, осуществлено теоретическое представление о метаболическом механизме развития нарушений иммунореактивности у больных лейкозами в зависимости от вида заболевания и стадии, что является новым перспективным направлением научных исследований, выполнение которых позволит во многом решить проблемы диагностики, лечения и реабилитации заболеваний, зависящих от развития нарушений иммунного гомеостаза.
Практическая значимость работы. Результаты исследования, выводы и положения работы являются основой для оптимизации и индивидуализации лечения больных ОНЛЛ, ОЛЛ, ХМЛ и ХЛЛ, выступают в качестве дополнительных критериев диагностики, эффективности терапии и прогноза.
В результате проведенных исследований получены новые данные о закономерностях энзиматических изменений в клетках иммунной системы у больных ОЛ и ХЛ в зависимости от вида заболевания и стадии, что расширяет и углубляет фундаментальные представления о патогенезе заболеваний. Использование при обследовании больных ОЛ и ХЛ комплекса дополнительных иммунологических тестов, с учетом их значимости в разные стадии заболевания, позволяет значительно улучшить прогноз характера течения и исхода заболеваний.
Высокая информативность показателей активности НАД- и НАДФ- зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах крови позволила разработать способы прогноза инфекционных осложнений (заявка на изобретение № 2005134594, опубл. 27.05.2007 бюл. №15) и геморрагических осложнений (заявка на изобретение № 2006104774, опубл. 27.08.2007 бюл. №24) после химиотерапии у больных ОЛ. О возможности возникновения этих осложнений судят по сочетанию активности дегидрогеназ в лимфоцитах крови. Данные методы позволяют с высокой точностью прогнозировать возникновение инфекционных и
геморрагических осложнений у больных ОЛ после химиотерапии, что дает возможность своевременно, до проведения химиотерапии, откорректировать план и тактику лечения данной категории больных и положительно повлиять на исход заболевания. Основные положения, выносимые на защиту:
Выраженность и особенности клинических проявлений, уровень заболеваемости и прогноз зависят от вида лейкоза.
Нарушения иммунного гомеостаза у больных О Л и ХЛ характеризуются развитием недостаточности клеточного и гуморального звеньев иммунитета, зависящей от вида лейкоза и стадии заболевания.
Иммунные нарушения у больных ОЛ и ХЛ взаимосвязаны с изменениями активности НАД(Ф) - зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах крови. Особенности нарушений метаболического статуса лимфоцитов влияют на прогрессирование и исход заболеваний.
Новые принципы прогнозирования инфекционных и геморрагических осложнений после химиотерапии у больных ОЛ разработаны на основании оценки наиболее патогенетически значимых уровней активности НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ лимфоцитов.
Внедрение результатов исследования в практику. Результаты исследования внедрены в практику гематологических отделений ККБ №1 и ГБ №7 (г. Красноярск). Основные положения исследования используются в учебном процессе на кафедре биохимии и физиологии человека СибФУ. Материалы исследования отражены в методических рекомендациях и двух заявках на изобретение. Результаты работы использованы при обучении врачей на циклах ФГЖ и ППС, клинических ординаторов и интернов, в лекциях для врачей лечебных учреждений.
Апробация материалов диссертации. Основные результаты диссертации представлены на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Дни иммунологии в Красноярском крае: Метабо-
лические механизмы иммунореактивности (Красноярск, 2004), на итоговой научно-практической конференции с международным участием «Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири» (Красноярск, 2005), на IX Всероссийском Форуме с международным участием имени академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2005), на Межрегиональной научно-практической конференции «Объединение субъектов Российской Федерации и проблемы природопользования в Приенисейской Сибири» (Красноярск, 2005), на Всероссийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири» (Красноярск, 2005), на конференции ФАМ (Красноярск, 2006), на XIII Международном симпозиуме «Сложные системы в экстремальных условиях» (Красноярск, 2006), на X Всероссийском Форуме с международным участием имени академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2006), на Всероссийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири» (Красноярск, 2006), на XI Всероссийском Форуме с международным участием имени академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2007), на итоговой научно-практической конференции с международным участием «Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири» (Красноярск, 2007), на межрегиональной научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири» (Омск, 2007), на заседании Ученого совета ГУ НИИ медицинских проблем Севера (г. Красноярск, 2007).
Личный вклад автора в проведенное исследование.
Автором непосредственно осуществлялся отбор больных и здоровых лиц для исследования, лично проведено исследование у них иммунного статуса с использованием метода непрямой иммунофлуоресценции с помощью моноклональных антител: CD3, CD4, CD8, CD16, CD72, HLA-DR, количественное определение иммуноглобулинов иммуноферментным методом, биолюминесцентный анализ определения активности НАД(Ф)зависимых дегид-
16 рогеназ в лимфоцитах периферической крови, статистическая обработка и анализ материала, обоснование научных выводов и рекомендаций.
Публикации: по теме диссертации опубликовано 30 печатных работ, из них 13 в журналах, рекомендованных ВАК для публикации основных материалов докторских диссертаций.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 315 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 2 глав, содержащих результаты собственных исследований и их обсуждение, заключения, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 13 рисунками и 109 таблицами. Список литературы содержит 144 отечественных и 165 иностранных источников.
