Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Модифицируемые факторы кардиоваскулярного риска 13
1.2. Генетические факторы кардиоваскулярного риска 18
1.2.1. Полиморфизм гена F2(20210G/A) 19
1.2.2. Полиморфизм гена F5(Arg506Gln) 20
1.2.3. Полиморфизм гена SERPINE 1(675 4G/5G) 23
1.2.4. Полиморфизм гена MTHFR(C677T) 24
1.3. Факторы риска развития рестенозау больных ИБС после 4KB 25
Глава 2. Материалы и методы исследования 29
2.1. Клиническая характеристика больных и дизайн исследования 29
2.2. Методы исследования
2.2.1. Антропометрическое исследование 34
2.2.2. Гемодинамические исследования 34
2.2.3. Биохимические методы исследования 35
2.2.4. Генотипирование однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) 37
2.3. Статистическая обработка результатов исследования 42
Глава 3. Распространенность полиморфных вариантов генов F2 (20210G/A), F5 (Arg506Gln), SERPINE1 (675 4G/5G), MTHFR (С677Т) у больных с ИБС лиц группы сравнения 44
3.1. Распространенность однонуклеотидного полиморфизма 20210G/A гена 2 у больных с ИБС и лиц группы сравнения 45
3.2. Распространенность однонуклеотидного полиморфизма Arg506Gln гена.Р5 у больных с ИБС и лиц группы сравнения 47
3.3. Распространенность однонуклеотидного полиморфизма 4G/5G гена SERPINE1 у больных с ИБС и лиц группы сравнения 49
3.4. Распространенность однонуклеотидного полиморфизма
3.5. С677Т гена MTHFR у больных с ИБС и лиц группы сравнения 51
Глава 4. Особенности клинического течения ибс в зависимости от наличия полиморфизма генов F2 (20210G/A), F5 (Arg506Gln), SERPINE1 (675 4G/5G) и MTHFR (С677Т) и при их сочетании с модифицируемыми факторами риска 54
4.1. Влияние полиморфизма генов F2 (20210G/A), F5 (Arg506Gln), SERPINE1 (675 4G/5G) и MTHFR (С677Т) и их сочетания с модифицируемыми факторами риска на возраст клинического дебюта ИБС J
4.1.1. Влияние однонуклеотидного полиморфизма 20210G/A гена F2 на возраст клинического дебюта ИБС 55
4.1.2. Влияние однонуклеотидного полиморфизма гена F5 (Arg506Gln) на возраст клинического дебюта ИБС 57
4.1.3. Влияние однонуклеотидного полиморфизма гена SERPINE1 (675 4G/5G) на возраст клинического дебюта ИБС и уровень PAI-1 58
4.1.4. Влияние однонуклеотидного полиморфизма гена MTHFR (С677Т) на возраст клинического дебюта ИБС и уровень гомоцистеина 62
4.2. Влияние полиморфизма генов F2 (2021OG/A), F5 (Arg506Gln), SERPINE1 (675 4G/5G) и MTHFR (С677Т) на возникновение ИМ 65
4.3. Место полиморфных вариантов генов F2, F5, SERPINE1, MTHFR
в оценке суммарного сердечно-сосудистого риска 68
Глава 5. Генетические и модифицируемые факторы риска как предикторы развития рестеноза после 4KB у больных ИБС 71
5.1. Возникновение рестеноза после 4KB у пациентов с ИБС при наличии модифицируемых факторов риска 72
5.2. Развитие рестеноза после 4KB у больных с ИБС при наличии полиморфизма гена F2 (20210G/A), а также модифицируемых факторов риска 74
5.3. Развитие рестеноза после 4KB у больных с ИБС при наличии полиморфизма гена,Р5 (Arg506Gln) в сочетании с модифицируемыми факторами риска 78
5.4. Развитие рестеноза после 4KB у больных с ИБС при наличии полиморфизма гена SERP1NE1 (675 4G/5G), а также модифицируемых факторов риска 81
5.5. Развитие рестеноза после 4KB у больных с ИБС при наличии полиморфизма гена MTHFR (С677Т), а также модифицируемых факторов риска 85
Обсуждение результатов (заключение) 89
Выводы 101
Практические рекомендации 102
Список литературы
- Полиморфизм гена F5(Arg506Gln)
- Гемодинамические исследования
- Распространенность однонуклеотидного полиморфизма 4G/5G гена SERPINE1 у больных с ИБС и лиц группы сравнения
- Влияние однонуклеотидного полиморфизма 20210G/A гена F2 на возраст клинического дебюта ИБС
Введение к работе
Актуальность проблемы
Болезни системы кровообращения в XXI веке приобрели характер пандемии. По прогнозам Всемирной организации здравоохранения сердечнососудистая смертность и в будущем останется основной причиной смертности населения в мире (Бюллетень ВОЗ, 2011). Лидирующую позицию в структуре сердечно-сосудистой смертности удерживает ишемическая болезнь сердца (Р.Г. Оганов и соавт., 2009). В связи с этим профилактика возникновения и прогрессирования ИБС остается одной из наиболее важных проблем современной медицины.
В настоящее время установлены основные модифицируемые факторы сердечно-сосудистого риска, которыми являются, прежде всего, курение, ожирение, АГ и дислипидемия (Wilson P. et al., 1998; Chambless L. et al., 2003; Morrison A.C. et al., 2007). Известно, что наличие этих факторов способствует развитию дисфункции эндотелия (Sitia S. et al., 2010; Del Turco S. et al., 2012), а также активации процессов атерогенеза (Jackson S.P. et al, 2011; Manduteanu I. et al, 2011). Политика активной первичной профилактики, направленная на устранение факторов сердечно-сосудистого риска, способствовала тому, что в течение двух последних десятилетий в индустриально развитых странах стандартизированная по возрасту смертность от ИБС снизилась более чем на 40% (Klenk J. et al., 2007; Lloyd-Jones D. et al, 2009).
В то же время, в достаточно большом количестве исследований определены специфические гены, детерминирующие риск развития атеросклероза и атеротромбоза (Kim R.J. et al., 2003; Stephens J. et al., 2003; McCarthy J. et al, 2004; Juo S.H. et al, 2009; Emiroglu O. et al., 2011; Marian A.J. et al., 2012). Показано, что носительство полиморфных генов системы гемостаза и фолат-ного цикла - F2 (20210G/A), F5 (Arg506Gln), SERPINE1 (675 4G/5G) и MTHFR (С677Т) приводит к развитию острых форм сердечно-сосудистых заболеваний, таких как инфаркт миокарда и инсульт (Rosendaal F.R. et al., 1995; Doggen C.J. et al, 1998; Mikkelsson J. et al, 2000; Kim R.I. et al, 2003; Onalan O. et al., 2008). При этом недостаточно изучено влияние носительства полиморфных генов системы гемостаза и фолатного цикла, в том числе при сочетании с различными модифицируемыми факторами риска, на клинические особенности хронических форм ИБС.
Важным направлением вторичной профилактики сердечно-сосудистой заболеваемости и смертности является активное использование хирургической реваскуляризации (Ford E.S. et al., 2007; Sampietro M.L. et al., 2009), которая способствует улучшению качества и продлению жизни больных
(Anderson J.L. et al., 2007; Bassand J.P. et al, 2007; Antman E.M. et al., 2008; Van de Werf F. et al, 2008; Mukherjee D. et al, 2009; Simoons M.L. et al, 2010). Однако процедура коронарной ангиопластики не лишена недостатков, одним из которых является рестенозирование коронарных артерий после проведенного вмешательства (Jukema J.W. et al., 2011). В развитии рестенозов после 4KB определенное значение могут иметь генетические факторы (Monraats P.S. et al., 2004; Monraats P.S. et al., 2005; Petrovic D. et al., 2005). До настоящего времени мало изучена взаимосвязь носительства полиморфных вариантов генов системы гемостаза и фолатного цикла с развитием рестенозов у пациентов с ИБС после 4KB. Не установлено влияние генетических факторов на уровень плазменного гомоцистеина, а также ингибитора активатора плазминогена, повышенное содержание которых относится к дополнительным факторам кардиоваскулярного риска, и в том числе может способствовать развитию рестенозов после 4KB у пациентов с ИБС. Изучению этих важных вопросов посвящено настоящее исследование.
Цель исследования: выявить клинические особенности ИБС у больных с полиморфизмом генов F2 (20210G/A), F5 (Arg506Gln), SERPINE1 (675 4G/5G) и MTHFR (С677Т).
Задачи исследования
-
Изучить распространенность полиморфных вариантов генов F2 (20210G/A), F5 (Arg506Gln), SERPINE1 (675 4G/5G) и MTHFR (С677Т) у больных с ИБС и в группе сравнения.
-
Изучить влияние полиморфизма генов F2 (20210G/A), F5 (Arg506Gln), SERPINE1 (675 4G/5G) и MTHFR (С677Т) в сочетании с модифицируемыми факторами кардиоваскулярного риска на возраст клинического дебюта ИБС.
-
Исследовать взаимосвязь полиморфизма генов F2 (20210G/A), F5 (Arg506Gln), SERPINE1 (675 4G/5G) и MTHFR (С677Т) с наличием ИМ в анамнезе.
-
Оценить влияние однонуклеотидного полиморфизма гена SERPINE1 (675 4G/5G) на плазменную концентрацию PAI-1, а также полиморфизма гена MTHFR (С677Т) на уровень гомоцистеина плазмы крови у больных с ИБС.
-
Определить взаимосвязь носительства полиморфных вариантов генов F2 (20210G/A), F5 (Arg506Gln), SERPINE1 (675 4G/5G) и MTHFR (С677Т), а также их сочетаний с модифицируемыми факторами кардиоваскулярного риска с развитием рестенозов после 4KB у больных с ИБС.
Научная новизна исследования
Впервые изучена распространенность полиморфных вариантов генов системы гемостаза - F2 (20210G/A), F5 (Arg506Gln), SERPINE1 (675 4G/5G) и фолатного цикла - MTHFR (С677Т) у мужчин, страдающих ИБС, стенокардией напряжения II-IV ФК, а также у сопоставимых по возрасту и полу лиц без ИБС, проживающих на территории Алтайского края.
Впервые определено, что носительство генотипов G/A гена F2 (20210G/A), 4G/4G гена SERPINE1 (675 4G/5G), а также Т/Т гена MTHFR (С677Т) ассоциируется с ранним клиническим дебютом ИБС у мужчин.
Впервые получены данные о том, что наиболее высокий уровень PAI-1 у больных с ИБС ассоциирован с наличием патологического гомозиготного генотипа 4G/4G гена SERPINE1 (675 4G/5G).
Показано, что носительство патологического гомозиготного генотипа Т/Т по сравнению с другими вариантами гена MTHFR (С677Т) обусловливает наиболее высокий уровень гомоцистеина в плазме крови у мужчин с ИБС, стенокардией напряжения II-IV ФК.
Впервые установлена роль полиморфизма генов F2 (20210G/A), F5 (Arg506Gln), SERPINE1 (675 4G/5G) и MTHFR (С677Т) в развитии рестено-зов после 4KB стентами без лекарственного покрытия у мужчин с ИБС. Наиболее высокий риск развития рестеноза коронарных артерий имеется при наличии генотипа G/A и аллеля А гена F2 (20210 G/A), генотипа G/A и аллеля А гена F5 (Arg506Gln), генотипа 4G/4G и аллеля 4G гена SERPINE1 (675 4G/5G), а также аллеля Т гена MTHFR (С677Т).
Практическая значимость исследования
Полученные данные позволяют рассматривать генотип G/A и аллель А гена F2 (20210G/A), генотип 4G/4G и аллель 4G гена SERPINE1 (675 4G/5G), а также генотип Т/Т и аллель Т гена MTHFR (С677Т) как дополнительные факторы риска развития ИБС, стенокардии напряжения II-IV ФК у мужчин.
Установленная взаимосвязь носительства генотипов G/A гена F2, 4G/4G гена SERPINE1, Т/Т гена MTHFR с ранним клиническим дебютом ИБС, а также генотипов G/A гена F2 и G/A гена F5 - с наличием ИМ в анамнезе, позволяет обосновать целесообразность определения в клинической практике полиморфных генов F2 (20210G/A), F5 (Arg506Gln), SERPINE1 (675 4G/5G), а также MTHFR (С677Т).
Полученные данные о роли генотипа G/A и аллеля А гена F2 (20210 G/A), генотипа G/A и аллеля А гена F5(Arg506Gln), генотипа 4G/4G и аллеля 4G гена SERPINE1(675 4G/5G), а также аллеля Т гена MTHFR (С677Т), могут быть ис-
пользованы для прогнозирования индивидуального риска развития рестенозов у больных с ИБС после 4KB стентами без лекарственного покрытия..
Комплексная оценка основных модифицируемых факторов риска (курения, метаболического синдрома), дополнительных факторов риска (PAI-1, гомоцистеина), а также полиморфных генов F2 (20210G/A), F5 (Arg506Gln), SERPINEl (675 4G/5G) и MTHFR (С677Т), позволит повысить эффективность первичной и вторичной профилактики ИБС.
Внедрение результатов исследования в практику. Результаты исследования внедрены в практику оказания медицинской помощи больным с ИБС в КГБУЗ «Алтайский краевой кардиологический диспансер». Основные положения диссертационной работы используются в образовательном процессе на кафедре госпитальной и поликлинической терапии с курсами профессиональных болезней и эндокринологии ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России.
Работа выполнена в КГБУЗ «Алтайский краевой кардиологический диспансер», являющегося клинической базой кафедры госпитальной и поликлинической терапии с курсами профессиональных болезней и эндокринологии ГБОУ ВПО АГМУ (зав. кафедрой - доктор медицинских наук, профессор В.Г. Лычев). Отдельные фрагменты работы выполнены на базе Алтайского филиала ФГБУ «Гематологический научный центр» МЗ РФ (директор - доктор медицинских наук, профессор А.П. Момот), а также в отделе лабораторной диагностики КГБУЗ «Диагностический центр Алтайского края» (и.о. зав. отделом - И.А. Карбышев).
Основные положения, выносимые на защиту:
-
У мужчин, страдающих ИБС, стенокардией напряжения II-IV ФК, имеется более высокая частота встречаемости генотипа G/A и аллеля А гена F2 (20210G/A), генотипа 4G/4G и аллеля 4G гена SERPINEl (675 4G/5G), а также генотипа Т/Т и аллеля Т гена MTHFR (С677Т), по сравнению с лицами без ИБС.
-
Носительство генотипов G/A гена F2 (2021OG/A), 4G/4G гена SERPINEl (675 4G/5G), а также Т/Т гена MTHFR (С677Т) ассоциируется с ранним клиническим дебютом ИБС у мужчин.
-
Предикторами развития рестеноза коронарных артерий у мужчин с ИБС в течение первого года после 4KB стентами без лекарственного покрытия являются: носительство генотипа G/A и аллеля А гена F2 (20210G/A), генотипа G/A и аллеля А гена F5 (Arg506Gln), генотипа 4G/4G и аллеля 4G гена SERPINEl (675 4G/5G), а также аллеля Т гена MTHFR (С677Т).
Личный вклад автора заключается в ведении больных и заполнении медицинской документации, проведении анализа отечественной и зарубежной литературы по рассматриваемой проблеме, выполнении статистической обработки с интерпретацией результатов и их обсуждением.
Апробация работы. Основные положения исследования доложены и обсуждены на XII городской научно-практической конференции молодых ученых «Молодежь - Барнаулу» (Барнаул, 2010), на Всероссийской конференции «Актуальные проблемы сердечно-сосудистой патологии» (Кемерово, 2010), на Втором краевом конкурсе «Молодежная наука - практической медицине» (Барнаул, 2011), на IV международном конгрессе по проблемам диабета и метаболического синдрома (Мадрид, 2011), на 79-м конгрессе Европейского Общества по Атеросклерозу (Ґетеборг, 2011), на VII Международной Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2012), на II Итоговой конференции Научного общества молодых ученых АГМУ (Барнаул, 2012), на 22-ом конгрессе Европейского Общества по Артериальной Гипертонии (Лондон, 2012), на Международном форуме профилактической кардиологии «EuroPrevent -2012» (Дублин, 2012), на Международном научно-образовательном форуме «Кардиология: на стыке настоящего и будущего» (Самара, 2012).
Апробация диссертации проведена на расширенном заседании проблемной комиссии по эпидемиологии, прогнозированию и профилактике хронических неинфекционных заболеваний, клинической кардиологии ГБОУ ВПО АГМУ Минздравсоцразвития России с участием сотрудников кафедры госпитальной и поликлинической терапии с курсами профессиональных болезней и эндокринологии, кафедры факультетской терапии с курсами военно-полевой терапии и иммунологии, кафедры внутренних болезней стоматологического и педиатрического факультетов, кафедры гематологии и трансфузиологии ФПК и ППС, кафедры биохимии и клинической лабораторной диагностики, а также сотрудников кардиологического отделения КГБУЗ «Городская больница № 1» г. Барнаула и кардиологического отделения № 2 КГБУЗ АККД.
Публикации. По теме диссертации опубликована 21 печатная работа, в том числе 6 статей - в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.
Структура и объем диссертации. Работа изложена на 133 страницах машинописного текста, иллюстрирована 20 таблицами и 9 рисунками. Со-
стоит из введения, обзора литературы, описания характеристики больных и методов исследования, трех глав собственных результатов, обсуждения результатов (заключения), выводов и практических рекомендаций. Указатель литературы содержит 265 источников, в том числе 17 отечественных и 248 зарубежных авторов.
Полиморфизм гена F5(Arg506Gln)
В настоящее время доказано, что основными факторами сердечнососудистого риска являются модифицируемые факторы, такие как курение, ожирение, АГ, дислипидемия, а также немодифицируемые факторы риска -пол и возраст (48, 169, 257). Показано, что сочетание этих факторов способствует развитию дисфункции эндотелия (64, 224), активации процесса атеро-генеза с формированием атеросклеротической бляшки и последующим тромбозом (114, 149).
В многочисленных эпидемиологических исследованиях изучена распространенность основных факторов риска ИБС. Одним из наиболее мощных факторов риска является курение (160, 228, 229, 235). Пристрастие к курению быстро набирает темпы, в том числе среди молодежи и женщин, и является одной из самых серьезных угроз для настоящего и будущего состояния здоровья населения в мире (76, 251, 261). Ежегодно почти 6 миллионов людей погибают от никотиновой зависимости (251). Табакокурение является одной из самых мощных и распространенных навязчивых привычек, влияющих на поведение людей уже более нескольких веков. Курение табака затрагивает различные системы и органы. Известные риски для здоровья курение наносит органам дыхания, вызывая хроническую обструктивную болезнь легких, рак легких, гортани и языка. Помимо этого, согласно данным Фрамингемско-го исследования, курение является причиной развития острого инфаркта миокарда, а также стенокардии напряжения (111). Известно, что длительное пристрастие к курению приводит к развитию функциональных и структурных изменений в сосудистой стенке, приводящих к формированию и повреждению атеросклеротической бляшки (193).
В России табачные изделия потребляют около 40% населения, что является одним из самых высоких показателей распространенности курения в мире. В нашей стране курильщиками являются 60,2% мужчин и 21,7% женщин, при этом основная доля курящих лиц приходится на возраст от 17 до 44 лет (3). Большинство курильщиков (86,4%) употребляют сигареты ежедневно, выкуривая в среднем 17 сигарет в сутки (3). Курение - это одна из причин преждевременной смерти, которой можно избежать (251).
Другим независимым фактором кардиоваскулярного риска является повышенное АД. Среди взрослого населения России распространенность АГ чрезвычайно высока. Повышенные цифры артериального давления выявля-ютс, в среднем у 41,1% женщин и у 39,2% мужчин (17). АГ является одной из главных причин развития сердечно-сосудистых осложнений - коронарной болезни сердца и мозгового инсульта, смертность от которых в течение последних двадцати пяти лет неуклонно возрастает (99, 161, 233).
Чрезвычайно важным независимым фактором кардиоваскулярного риска считают ожирение, которое в XXI веке приобретает характер глобальной эпидемии (31, 139, 212, 220). Наиболее опасным является абдоминальное ожирение, которое обычно определяется по увеличению окружности талии (180, 248). Известно, что повышенное образование свободных жирных кислот в адипоцитах - клетках висцеральной жировой ткани, приводит к гипергликемии и гиперинсулинемии (200). Постоянная гиперинсулинемия приводит к различным нарушениям углеводного обмена - гипергликемии нато 15 щак, нарушению толерантности к глюкозе и сахарному диабету. Возникающие на фоне инсулинорезистентности нарушения углеводного обмена являются факторами риска развития атеросклероза и сердечно-сосудистых заболеваний (33).
АГ, ожирение, дислипидемия, а также инсулинорезистентность являются основными компонентами МС (187, 200, 204, 244). В настоящее время в мире проведено большое количество исследований, доказывающих повышенный риск развития сердечно-сосудистых заболеваний у лиц с МС. Так, среди лиц, страдающих МС, риск развития ИБС и мозгового инсульта повышается в 1,5-3 раза (63, 101).
В последние годы широко обсуждается патогенез МС, до сих пор отсутствуют единые, общепринятые критерии его диагностики. Несмотря на то, что большинство авторов придерживается мнения о главенствующей роли инсулинорезистентности, существуют и альтернативные позиции, в которых наличие обязательного критерия синдрома не учитывается, а наоборот, все компоненты являются равнозначными.
Согласно рекомендациям, разработанными экспертами Всероссийского научного общества кардиологов (12), диагностировать МС позволяет наличие основного признака и двух дополнительных критериев. Основным признаком является центральное (абдоминальное) ожирение, когда окружность талии (ОТ) составляет более 80 см у женщин и более 94 см у мужчин. Дополнительными критериями являются: АД 130/85 мм рт. ст.; повышение уровня триглицеридов ( 1,7ммоль/л); снижение уровня ХС ЛПВП ( 1,0 ммоль/л у - мужчин; 1,2 ммоль/л - у женщин); повышение уровня ХС ЛПНП 3,0 ммоль/л или гипергликемия натощак (глюкоза в плазме крови натощак 6,1 ммоль/л) или нарушение толерантности к глюкозе (глюкоза в плазме крови через 2 часа после нагрузки глюкозой в пределах 7,8 и 11,1 ммоль/л).
МС продолжает оставаться весьма широко распространенным во всем мире, а особенно частота его встречаемости увеличивается с возрастом. В США его распространенность среди взрослого населения превышает 40%, в Европе - 30% (42, 43, 75, 101). Также МС считается эпидемией быстрораз-вивающихся стран, включая Китай, Японию и Корею.
В последние годы широко обсуждаются дополнительные факторы кардио-васкулярного риска. Еще в 1969 году в работе K.S. McCully впервые была показана взаимосвязь сосудистой патологии с тяжелой наследственной гомоцистеи-немией (159). Впоследствии было показано, что повышенный уровень гомоци-стеина является независимым фактором риска атеросклероза и артериального тромбоза (37, 49, 52). Исследования последних лет позволяют утверждать, что повышение уровня гомоцистеина в крови является независимым фактором риска ИБС (27, 53, 259), а также ишемического инсульта (192).
Гомоцистеин представляет собой серосодержащую аминокислоту и является промежуточным соединением в метаболизме незаменимой аминокислоты - метионина. В физиологических условиях гомоцистеин метаболизиру-ется одним из двух путей: либо реметилированием, превращаясь в метионин с использованием фолиевой кислоты и витамина В12, либо транссульфури-рованием, превращаясь в цистатионин, а затем в цистеин, при участии витамина В6. За счет реакции реметилирования и транссульфурирования поддерживаются низкие внутриклеточные концентрации гомоцистеина, являющегося цитотоксичной аминокислотой (85, 103). Нарушения метаболизма гомоцистеина приводят к его накоплению в крови и межтканевых жидкостях, в результате чего гомоцистеин оказывает повреждающее действие на сосудистый эндотелий. Это приводит к эндотелиальной дисфункции, ассоциированной с активацией тромбоцитов, и атеротромбозу (45, 46, 237, 253).
В настоящее время определен нормальный уровень гомоцистеина в плазме крови, который составляет 5-15 мкмоль/л. Гипергомоцистеинемия диагностируется в случае увеличения концентрации гомоцистеина более 15 мкмоль/л. Содержание гомоцистеина более 100 мкмоль/л свидетельствует о наличии тяжелой гипергомоцистеинемии (27, 202). Известно, что тяжелые формы гипергомоцистеинемии в основном являются редкими врожденными дефектами метаболизма. Однако незначительное или умеренное повышение уровня гомоцистеина в крови может быть вызвано гомозиготным или гетерозиготным носительством точечной мутации гена MTHFR (С677Т) (54, 133, 163, 175). Показано, что даже легкая или умеренная гипергомоцистеинемия связана с риском развития сердечно-сосудистых событий - хронической ишемической болезни сердца, острого инфаркта миокарда, мозгового инсульта, а также смертностью от ИБС (52, 230, 231).
В настоящее время широко обсуждается значение фибринолитической системы в развитии тромботических состояний. Ключевую роль в функционировании фибринолитической системы играет тканевой активатор плазминоге-на (t-PA), являющийся основным активатором фибринолитических реакций, продуцируемых эндотелием. Главным ингибитором t-PA является белок - ингибитор активатора плазминогена-1 (PAI-1 или serpin El). Физиологический баланс между фибринолитической системой и ее ингибитором позволяет предупреждать развитие системных кровотечений (247, 249). В случаях, когда уровень РА1-1 повышен, появляется риск развития тромбообразования, что приводит к развитию и прогрессированию коронарного атеросклероза, ишемической болезни сердца и острому инфаркту миокарда (30, 35, 93, 181, 246, 247, 260). Таким образом, белок PAI-1 может являться ключевым звеном в развитии атеротромботических состояний. Кроме того, имеются данные о взаимосвязи повышенного уровня циркулирующего в крови PAI-1 с развитием серьезных нежелательных сердечно-сосудистых событий после коронарного стентирования (28, 197, 226, 234). Учитывая, что белок PAI-1 кодируется геном SERPINE1, можно предположить, что его уровень в крови может быть генетически обусловлен.
Гемодинамические исследования
За 20-30 минут до приготовления рабочей амплификационной смеси комплект реагентов для ПЦР извлекался из морозильника и размораживался. Пробирки с реакционной смесью и полностью размороженным раствором разбавителя тщательно перемешивали. Перемешивание разбавителя происходило при переворачивании пробирки (пузырём воздуха), а перемешивание реакционной смеси проводили вортексированием.
Из компонентов комплекта готовили рабочие смеси реагентов для амплификации из расчета на 1 пробу: 17,5 мкл разбавителя, 2,5 мкл реакционной смеси, 0,2 мкл Taq-полимеразы (вносили в последнюю очередь). Готовили 2 рабочие смеси: с реакционной смесью «НОРМА» и с реакционной смесью «МУТАЦИЯ». После добавления Taq-полимеразы смесь тщательно перемешивали пипетированием. Затем добавляли по 20 мкл соответствующей рабочей амплификационной смеси во все соответствующие пробирки, подготовленные для амплификации. После также во все пробирки добавляли по 1 капле (около 25 мкл) минерального масла. Затем вносили по 5 мкл образца из обработанной анализируемой пробы в пробирку с рабочей амплификационной смесью «НОРМА» и в пробирку с рабочей амплификационной смесью «МУТАЦИЯ» под слой масла. В качестве отрицательного контрольного образца вносили разбавитель в объеме 5 мкл в оба типа реакционной смеси. Закрытые пробирки центрифугировали в течение 3-5 секунд при 1500-3000 об/мин при комнатной температуре на микроцентрифуге - вортексе. После этого пробирки переносили в прогретый до температуры +94 С (установившаяся температура в режиме Пауза) программируемый термостат и проводили амплификацию по следующей программе (табл. 2).
Разделение продуктов амплификации проводилось методом горизонтального электрофореза. В аппарат для электрофореза заливали ТАЕ буфер, приготовленный на дистиллированной воде разбавлением 50хТАЕ в 50 раз (рН=8,3). Готовили 3% агарозу из расчета на 1 гель: к 1,5 г агарозы добавляли 1 мл 50х ТАЕ буфера и 55 мл дистиллированной воды (включен запас на испарение). Приготовленную смесь расплавляли в СВЧ-печи на небольшой мощности. Добавляли к 50 мл расплавленной агарозы 5 мкл 1% раствора бромистого этидия. Перемешивали, после чего расплавленную агарозу сразу же заливали в планшет для заливки геля. Для получения в агарозном геле карманов для нанесения образцов на планшет гребенку устанавливали зажим типа «бульдог». После застывания агарозы гребенку осторожно вынимали из геля и переносили на планшет с гелем в камеру для проведения электрофореза.
В карманы геля наносили по 10-15 мкл амплификата в последовательности, соответствующей нумерации проб, подключали электрофоретиче-скую камеру к источнику питания и задавали напряжение, соответствующее напряженности электрического поля 10-15 В/См геля (для камеры с расстоянием между электродами 27 см максимальное напряжение 150 В). Проводили электрофоретическое разделение продуктов амплификации в направлении от катода (-) к аноду (+). Контроль за электрофоретическим разделением осуществляли визуально по движению полосы красителя. Полоса красителя должна была пройти от старта 1,5-2 см (полосы амплико-нов опережают полосу красителя, оптимальное время разгонки -17 минут).
Гель вынимали из формы и переносили на стекло УФ-трансиллюмина-тора. Включали трансиллюминатор и анализировали результаты (визуальную детекцию проводили только с использованием защитного экрана либо в очках, не пропускающих УФ излучение). Фрагменты анализируемой ДНК проявлялись в виде светящихся оранжево-красных полос под УФ-излучением с длиной волны 310 нм.
Статистическая обработка данных выполнена с помощью электронных таблиц «Microsoft Excel» и пакета прикладных программ «Statistica for Windows» v.6.1 (StatSoft Inc.,США). Тест на соблюдение равновесия Харди-Вайнберга выполнялся с использованием % Пирсона в программе «De Finetti».
Проверка нормальности распределения количественных признаков проводилась с использованием критерия Шапиро-Уилка. Для количественных параметров были определены: среднее значение (М), стандартное отклонение (SD), стандартная ошибка (SE), для качественных данных - частота (Р), ошибка частоты (Sp).
В случаях нормального распределения, а также равенства выборочных дисперсий, оцененному по F-критерию, для сравнения выборочных средних использовали t-критерий Стьюдента. При отсутствии нормального распреде 43 ления проводили парное межгрупповое сравнение с помощью U-критерия Манна-Уитни.
Для обнаружения ассоциации между частотами встречаемости аллелей применялись стандартные генетико-статистические методы. Попарное сравнение контрольных и опытных частот проводилось с помощью критерия і , с включением поправки Иейтса на непрерывность, при условии, что все значения частот сравниваемых признаков больше 5. При частотах меньше 5 сравнение проводилось с использованием точного критерия Фишера. Отношение шансов (OR) с 95% доверительным интервалом (C.I.) рассчитывали по таблице сопряженности. Статистически значимыми считались отличия при р 0,05.
Распространенность однонуклеотидного полиморфизма 4G/5G гена SERPINE1 у больных с ИБС и лиц группы сравнения
В основной группе носителями гетерозиготного генотипа G/A были 7,6±2,3% пациентов, а в группе сравнения частота встречаемости генотипа G/A составила 4,0±1,8 (%2=0,85; р=0,35). Выявленная частота гетерозиготного варианта гена F5 как в группе больных с ИБС, так и в группе сравнения соответствует его встречаемости у европейского населения, которая составляет 2-6% (2). При исследовании полиморфизма гена F5 (Arg506Gln) как в основной, так и в группе сравнения гомозиготных носителей по неблагоприятному аллелю А выявлено не было. Полученные данные подтверждают тот факт, что варианты гомозиготного носительства по аллелю А в популяции встречаются крайне редко (201). При анализе частоты распределения аллелей G и А гена F5(Arg506Gln) нами было выявлено, что ни встречаемость аллеля G, ни встречаемость аллеля А статистически значимо не отличались в сравниваемых группах.
Распространенность однонуклеотидного полиморфизма 675 4G/5G гена SERPINEI у больных с ИБС и лиц группы сравнения Распределение частот генотипов и аллелей однонуклеотидного полиморфизма 675 4G/5G гена SERPINEI как в основной, так и в группе сравне ния не имело отклонений от равновесия Харди-Вайнберга (рис. 6).
При изучении распространенности полиморфного варианта гена SERPINEI (675 4G/5G) выявлено, что 39 мужчин с ИБС являлись носителями нормального гомозиготного генотипа 5G/5G, 67 мужчин - носителями гетерозиготного 4G/5G генотипа. У 26 больных основной группы при генотипи-ровании выявлен патологический вариант гомозиготного носительства аллеля 4G гена SERPINEI. В группе сравнения носителями генотипа 5G/5G явились 59 человек, генотипа 4G/5G - 54 человека, носителями генотипа 4G/4G - 10 пациентов (табл. 5). Как видно из таблицы 6, в основной группе частота встречаемости нормального гомозиготного генотипа 5G/5G составила 29±3,9%, а в группе сравнения - 48,0±4,5% (х==8,37; р=0,004). Частота встречаемости гетерозиготного генотипа 4G/5G у больных с ИБС была несколько выше при сопоставлении с группой сравнения (51,0±4,3% и 44,0±4,5% соответственно), однако различие не было статистически значимым (р=0,33). Патологический генотип 4G/4G в основной группе больных определялся статистически чаще, чем в группе сравнения (OR=2,77, С.1.[ 1,28-6,02], р=0,01).
Таблица 6 Распределение генотипов и аллелей гена SERPINE1 (675 4G/5G) у больных с ИБС и лиц группы сравнения Генотипы и аллели Основная группа Группа сравнения 2X Р OR 95%C.I. п P±Sp(%) п P±Sp(%) 5G/5G 39 29,0±3,9 59 48,0±4,5 8,37 0,004 0,45 0,27-0,76 4G/5G 67 51,0±4,3 54 44,0±4,5 0,94 0,33 1,32 0,8-2,16 4G/4G 26 20,0±7,1 10 8,0±2,4 6,1 0,01 2,77 1,28-6,02 5G 145 55,0±3,1 172 70,0±2,9 11,54 0,001 0,52 0,36-0,75 4G 119 45,0±3,1 74 33,0±2,9 11,54 0,001 1,91 1,32-2,75 Примечание: Р — частота генотипов и аллелей; Sp — ошибка частоты; OR - отношение шансов, 95%С1. - доверительный интервал В основной группе больных с ИБС патологический аллель 4G встречался статистически значимо чаще (OR=l,91, C.I.[1,32-2,75], х2=И,54, р=0,001), тогда как нормальный аллель 5G чаще встречался в группе сравнения (% =11,54, р=0,001).
Исходя из полученных данных, можно сделать вывод, что генотип 5G/5G и аллель 5G чаще встречаются в группе лиц без ИБС. В то же время генотип 4G/4G, а также аллель 4G статистически значимо чаще встречаются у больных основной группы, что свидетельствует об их неблагоприятной рО ли в развитии ИБС.
Распространенность однонуклеотидного полиморфизма С677Т гена MTHFR у больных с ИБС и лиц группы сравнения
Распределение частот генотипов и аллелей однонуклеотидного полиморфизма С677Т гена MTHFR как в основной, так и в группе сравнения не имело отклонений от равновесия Харди-Вайнберга (рис. 7).
Примечания: - группа сравнения %2 =0,93, р=0,33 - основная группа х =0Л» р=0»74 При изучении носительства однонуклеотидного полиморфизма гена MTHFR (С677Т) в группе лиц без ИБС носителями генотипа С/С были 63 человека, генотипа С/Т - 53 человека, а генотипа Т/Т - 7 мужчин (табл. 7). Сре 52 ди пациентов, страдающих ИБС, гомозиготный вариант С/С встречался у 50 больных, гетерозиготный вариант С/Т - у 61 больного, а патологический вариант Т/Т - у 21 больного. Таблица 7 Распределение генотипов и аллелей гена MTHFR (С677Т) у больных с ИБС и лиц группы сравнения Генотипыи аллели Основнаягруппа Группа сравнения X" Р OR 95%C.I. п P±Sp(%) п P±Sp (%) С/С 50 37,9±4,2 63 51,2±4,5 4,07 0,04 0,58 0,35-0,96 С/Т 61 46,2±4,3 53 43,1±4,4 0,14 0,7 1,13 0,69-1,86 Т/Т 21 15,9±3,2 7 5,7±2,1 5,8 0,01 3,14 1,28-7,67 С 161 61,0±3,0 179 72,8±2,8 7,43 0,006 0,59 0,4-0,8 т 103 39,0±3,0 67 27,2±2,8 7,43 0,006 1,71 1,18-2,48 Примечание: Р - частота генотипов и аллелей, Sp - ошибка частоты, OR — отношение шансов, 95%СЛ. — доверительный интервал При сравнении распределений генотипов и аллелей изучаемого гена было выявлено, что гомозиготный генотип С/С статистически значимо чаще встречается в группе сравнения {% =4,07; р=0,04). Это подтверждают литературные данные о том, что генотип С/С является «диким», нормальным и наиболее распространенным в популяции (54). Встречаемость гетерозиготного варианта С/Т в основной группе составила 46,2% против 43,1% в группе сравнения, однако разница была статистически не значима (х=0,14; р=0,7). Встречаемость гомозиготного, неблагоприятного варианта Т/Т у больных с ИБС, а также в группе сравнения составила 15,9±3,2% и 5,7±2,1% соответственно. Нами получено, что частота распространенности генотипа Т/Т гена MTHFR в группе больных с ИБС значимо превышает распространенность данного генотипа в группе лиц сравнения (х2=5,8; р=0,01, OR=3,14, C.I.[1,28-7,67] ). Носительство данного гомозиготного генотипа может свидетельствовать о неблагоприятной роли Т/Т генотипа в риске развития ИБС.
Кроме того, нами выявлена более высокая частота встречаемости неблагоприятного аллеля Т гена MTHFR (С677Т) у пациентов с ИБС при сопоставлении с группой без ИБС (х =7,43, р=0,006). Напротив, в группе сравнения частота носительства нормального аллеля С была статистически значимо выше по сравнению с больными ИБС (р=0,006). Следовательно, исходя из полученных нами данных можно сделать вывод, что гомозиготный генотип С/С, а также аллель С чаще встречаются среди лиц без ИБС, а аллель Т, и как следствие генотип Т/Т, наиболее распространены среди больных с ИБС, что свидетельствует о неблагоприятной роли аллеля Т для развития ИБС.
Таким образом, наличие более высокой частоты встречаемости гетерозиготного генотипа G/A и аллеля А гена F2 (20210 G/A), гомозиготного генотипа 4G/4G и аллеля 4G гена SERPINE1 (675 4G/5G), а также генотипа Т/Т и аллеля Т гена MTHFR (С677Т), у пациентов с ИБС по сравнению с лицами без данного заболевания позволяет предположить их неблагоприятную роль в увеличении риска развития ишемической болезни сердца.
Влияние однонуклеотидного полиморфизма 20210G/A гена F2 на возраст клинического дебюта ИБС
Было определено, что носительство нормального гомозиготного 5G/5G и гетерозиготного 5G/4G генотипов в подгруппе лиц без рестеноза несколько выше, чем в подгруппе с рестенозом, однако эта разница оказалась статистически незначимой (р=0,81 и р=0,06 соответственно). В то же время имелась статистически значимая разница в частоте встречаемости гомозиготного патологического генотипа 4G/4G между подгруппами. Так, данный вариант но-сительства чаще встречался в подгруппе больных с рестенозом (р=0,004). При этом шанс развития рестеноза при носительстве данного генотипа увеличивался в 4 раза (OR=4,05, 95% C.I.[1,64-10,01]). Носительство аллелей 5G и 4G статистически значимо не отличалось в обеих подгруппах больных. Таким образом, полученные данные позволяют предположить, что генотип 4G/4G гена SERPINEI(675 4G/5G) является фактором риска для развития рестеноза после 4KB у больных с ИБС.
Нами был также проведен сравнительный анализ распределения частот генотипов и аллелей гена SERPINE1{615 4G/5G) при сочетании с МС в подгруппах больных с рестенозом и без рестеноза (табл. 19). Среди больных с МС рестеноз возник у 17 человек, четверо из которых (23,5%) были носителями гомозиготного варианта 5G/5G, пятеро (29,4%») - гетерозиготного генотипа 5G/4G, 8 больных (47,1%) являлись носителями гомозиготного генотипа 4G/4G гена SERPINE1 (675 4G/5G). У больных с МС в подгруппе без рестеноза распределение генотипов было следующим: 11 больных (34,4%) явились носителями гомозиготного генотипа 5G/5G, 18 больных (56,2%) - носителями гетерозиготного генотипа 5G/4G, а 3 больных (9,4%) - носителями гомозиготного генотипа 4G/4G.
Как видно из таблицы 19, в подгруппах больных с рестенозом и без него не выявлено статистически значимого различия между встречаемостью сочетания МС с носительством нормального гомозиготного генотипа 5G/5G (Х =0,21, р=0,65). Также не было выявлено статистически значимого различия между подгруппами по встречаемости МС в сочетании с гетерозиготным неблагоприятным генотипом 5G/4G (х"=2,2, р=0,14). При этом получено, что при сочетании МС и патологического гомозиготного варианта 4G/4G гена SERPINE 1 (675 4G/5G) рестеноз наблюдался статистически значимо чаще (Х =7,02, р=0,008). Шанс развития рестеноза у больных с наличием МС и но-сительством генотипа 4G/4G был значительно повышен (OR=8,59, 95% C.I. [1,87-39,41]).
Кроме того, отмечены статистически значимые различия по встречаемости различных аллелей гена SERPINE 1 (675 4G/5G) в сочетании с МС у пациентов с рестенозом и без него. Так, у пациентов с ИБС и носительством аллеля 4G при сочетании с МС, рестеноз встречался значимо чаще (х2 =4,33, р=0,03). При этом риск развития рестеноза был статистически значимо выше (OR=2,69, 95% C.I.[1,14-6,34]) по сравнению с подгруппой больных, имевших МС и носительство аллеля 5G гена SERPINE1 (675 4G/5G). Таким образом, можно сделать вывод, что ассоциация МС с гетерозиготным генотипом 4G/4G, а также аллелем 4G гена SERPINE] (675 4G/5G) является значимым фактором риска и с высокой вероятностью вызовет развитие рестеноза.
Для оценки возможного риска развития рестеноза после операции 4KB нами был проведен анализ распределения частот генотипов и аллелей гена SERPINE 1 среди курящих лиц с ИБС, что также представлено в таблице 19.
У курящих больных было выявлено два аллельных варианта гена SERPINE1 (675 4G/5G), а также три варианта генотипов - 5G/5G, 5G/4G, 4G/4G. Распределение представленных генотипов у курящих лиц с рестенозом было следующим: 6 больных (28,6%) были носителями генотипа 5G/5G, еще 6 (28,6%) - носителями генотипа 5G/4G, а 9 пациентов (42,8%) являлись носителями генотипа 4G/4G. У курящих больных без рестеноза встречаемость данных генотипов распределилась следующим образом: 12 больных (31,6%) были носителями генотипа 5G/5G, 22 (57,9%) - носителями генотипа 5G/4G, а 4 курящих пациента (10,5%) - гомозиготного генотипа 4G/4G. Нами не зарегистрировано статистически значимых различий в частоте возникновения рестенозов между подгруппами пациентов при сочетании курения с носительством как генотипа 5G/5G, так и генотипа 5G/4G. При этом выявлено повышение риска раз 85 вития рестеноза при сочетании курения с носительством гомозиготного генотипа 4G/4G (х2=6,46, р=0,01; OR=6,38, 95% С.Ц1,65-24,57]). Таким образом, в работе показано, что комбинация курения с носительством патологического гомозиготного генотипа по аллелю 4G - 4G/4G гена SERPINE1 (675 4G/5G) может значительно повышать риск развития рестеноза после 4KB.
Развитие рестеноза после 4KB у больных с ИБС при наличии полиморфизма гена MTHFR (С677Т), а также модифицируемых факторов риска Исходя из результатов генотипирования однонуклеотидного полиморфизма гена MTHFR (С677Т), в подгруппах больных с рестенозом и без рестеноза были выявлены носители двух аллелей - С и Т, а также трех вариантов генотипов - С/С, С/Т и Т/Т. В таблице 20 представлен сравнительный анализ частоты распределения генотипов и аллелей изучаемого гена. Как видно из таблицы, частота встречаемости нормального гомозиготного генотипа С/С статистически значимо отличается в подгруппах. Данный вариант носительства представлен у 11,8% больных с рестенозом против 47% больных без рестеноза (р 0,001). По частоте встречаемости гетерозиготного неблагоприятного генотипа С/Т статистически значимых отличий выявить не удалось. Она составила 61,8% в подгруппе с рестенозом против 41,0% - в подгруппе без рестеноза (р=0,06). Частота встречаемости патологического гомозиготного генотипа Т/Т была выше в подгруппе с рестенозом по сравнению с подгруппой без рестеноза, однако это отличие также не было статистически значимым (р=0,09). Аллель Т статистически чаще встречался среди больных с рестенозом (57,4% против 33,0%, р 0,01) и повышал шанс его развития почти в 3 раза (OR=2,77, 95% C.I.[1,58-4,88]). При сравнении частоты встречаемости аллеля С было выявлено статистически значимое преобладание данного аллеля у больных без рестеноза (р 0,01). Таким образом, можно сделать предположение о том, что аллель Т играет роль в развитии рестеноза и повышает риск его развития у больных после 4KB. В таблице 20 представлена также частота встречаемости различных генотипов и аллелей гена MTHFR (С677Т) в сочетании с МС в подгруппах с рестенозом и без рестеноза.
