Введение к работе
Актуальность проблемы. Исследование клеточных и молекулярных механизмов токсического действия. ксенобиотиков - одна из іриоритетньїх задач современной патофизиологии, токсикологии и физико-химической медицины. В качестве проявлений цитозоксичности і настоящее время рассматриваются обратимые или необратимые ювреждения структур клегок, приводящие к дезорганизации клеточного метаболизма и к нарушению функционирования органа или системы . Такого рода повреждения проявляются широким спектром апологических эффектов (мутагенный, канцерогенный и пр.) ( V. Foa, 1987; D.V. Parke/1987; L. Hightower, 1991).
Накапливающиеся в литературе данные о клеточно-молекулярной эснове действия различных ксенобиотиков позволяют предполагать :уществование неких единых механизмов цитоповреждающего действия химических веществ, реализуемых, в числе прочих, через изменение антегративных межклеточных и внутриклеточных сигнальных процессов. Рецелгор-эффекторные взаимодействия и активация клеточных сигнальных систем являются основой жизнедеятельности всех 5ез исключения клеток про- и эукариотической природы. Регуляция )ффекторных функций ( изменение активности ферментов метаболизма, ,юнных каналов, экспрессии генов ) занимает центральное место в іроцессах межклеточной коммуникации и интеграции. В настоящее время лишь в единичных исследованиях в о'бласти экспериментальной юксикологии учитываются возможность и важность модуляции экзогенными веществами различных этапов этой регуляции ; лиганд-рецепторных взаимодействий, дивергенции и/или конвергенции в :истемах "вторичных посредников", активации и/или ингибирования эффекторных молекул клеток ( M.D.Hollenberg, 1991; M.J. Веггіїїце, 1993; C.Richter, 1993; I.Nakashima, 1994).
Проблема "рецепции" ксенобиотиков и возможность имитации ими естественных рецептор-эффекторных взаимоотношений остаются одними из наименее изученных в современной экспериментальной токсикологии. Недостаточно раскрыты механизмы альтерации клеточных структур -компонентов сигнальных систем, позволяющие разработать наиболее эффективную стратегию антитоксической зашиты клетки и восстановления ее структурно-функционального гомеостази.
Ионные механизмы в повреждающем действии факторов окружающей среды практически не рассматриваются с позиции их ключевой роли в нарушении гомеостаза клеток и индукции ряда компенсаторно-приспособительных процессов, приводящих к адаптации к воздействию ксенобиотиков или сопровождающихся развитием сублстальных и летальных повреждений. Особую актуальность эти механизмы приобретают в клетках, функционирование которых определяется в большей степени ион-транспортными процессами (электровозбудимые ткани), а также в клетках, активность ключевых ферментативных систем которых опосредуется ионными механизмами (R.S. Lewis, 1988; S. Orrenius, 1989; J. Alvvarez, 1992). Широкая распространенность катион-зависимых ферментов, обладающих протеазной, эндонуклеазной и фосфолипазной активностью, предопределяет важность процессов нарушения ионного гомеостаза и патогенезе патологической клеточной смерти (некроза) ним запрограммированной клеточной смерти (апоиюза) при действии химических фактором окружающей среды (С. Dive. 1991).
Физиологическая и патологическая регуляция клеточной никли представляет собой ключевое звено механизмов '"юльшинства конститутивных и индуццбельных реакций клетки. До сих пор внимание патофизиологов и токсикологов было в большей степени сконцентрировано на изучении особенностей индукции ксенобиотиками
некротически-дистрофических процессов в органах и тканях. Лишь в последние годы внимание исследователей привлекли механизмы ііпоптоза, обеспечивающего поддержание постоянства количественного состава клеточной популяции и являющегося объектом регуляции экзогенных и эндогенных факторов физической, химической и апологической природы (MJ. Arrends, 1990; G.T. Williams, 1993).
Одним из базовых механизмов цитотоксичности ряда ксенобиотиков является индукция ими окислительного стресса (H.Kappus, 1987; C.W. Olanow, 1993). Генерация свободных радикалов, сопровождающая физиологические и патологические внутриклеточные процессы, ггановится причиной альтерации биомакромолекул клеток - перекисного экисления липидов, свободно-радикального повреждения нуклеиновых <нслот, окисления белковых молекул и полисахаридов. До сих пор ювреждение белков клеток рассматривалось преимущественно в <ачестве побочного результата действия экзогенных факторов. Однако, в іитературе накапливаются данные о пусковой роли аккумуляции ггруктурно и функционально модифицированных клеточных белков в іроцессах индукции стресс-ответа клетки, ее адаптации и, при іеблагоприятном исходе, гибели ( K.J.A. Davies, 1987; J. Becker, 1994). Эта, так называемая протеотоксичность ксенобиотика может являться :ритернем его обшей цитотоксичности, органотропности его юздействия и "мишенью" патогенетической коррекции. При этом «бщность патогенетических механизмов протеотоксичности при Физическом или химическом воздействии составляет теоретическую [редпосылку для индукции перекрестной толерантности к токсическим кзогенным веществам различной структуры ( M-J. Gething, 1992; A. De Лаіо, 1993).
Цель работы. Исследовать роль нарушений ионного и окислительно-осстановительного гомеостаза клеток, изменения стабильности
клеточных белков в патогенезе цитотоксического действия ксенобиотиков, формирования реакций клеточной адаптации, регуляции запрограммированной клеточной смерти.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
1. Изучить влияние ксенобиотиков-индукторов окислительного стресса-
на процессы регуляции активности ионных каналов в клетках
нейрональной природы. Установить характер взаимосвязи между
механизмами окислительно-восстановительного и ионного гомеостази
клеток в условиях физиологической регуляции нейротрансмиттерными
молекулами и в условиях окислительного стресса.
2. Изучить роль продуктов каталитической деградации
никотинамидадениндинуклеотида в регуляции активности ионных
каналов и процессов запрограммированной клеточной смерти в клетках
нейрональной природы. Оценить возможность коррекции
физиологической активности нейромедиаторов и цитотоксического
действия ксенобиотиков субстратными ингибиторами ферментов
трансформации никотинамидадениндинуклеотида.
3. Исследовать роль протеотоксического действия ксенобиотиков в их
суммарном цитоповреждающем эффекте, в том числе через оценку
значимости функционирования редокс-чувств'ительных центров
белковых молекул - компонентов' рецептор-эффекторных сигнальных
систем в электровозбудимых клетках и идентификацию места действия
сульфгидрильных ядов.
4. Изучить особенности реакций активации и десенсибилизации
рецепторов, сопряженных с ГТФ-связывающими белками, в условиях
окислительного стресса и действия тиолотропных ксенобиотиков.
5. Оценить особенности и значимость нарушений ионных механизмов и
конформационно-функционального состояния клеточных белков в
патогенезе запрограммированной клеточной смерти при действии
ксенобиотиков. Исследовать зависимость проявления чувствительности клеток к действию экзогенных факторов химической и физической природы от степени клеточной пролиферации и дифферснцировки.
6. Изучить вклад генотоксического эффекта ксенобиотиков в реализацию
механизмов запрограммированной клеточной смерти и разработать
методы патогенетической коррекции возникающих нарушений.
7. Исследовать вклад нейротрансмиттерной регуляции в механизмы
контроля пролиферативной активности и апоптоза в популяции
гемопоэтических клеток в физиологических условиях, а также в
присутствии индукторов окислительного стресса. Изучить вклад
кальций- и НАД-зависимых механизмов в миелотоксический эффект
ксенобиотиков и возможность его патогенетической коррекции.
8. Изучить возможность достижения "перекрестной термотолерантности"
к протеотокснческим ксенобиотикам на модели теплового шока in vitro и
in vivo в клетках нейрональной природы и гепатоцитах.
Научная новизна. Работа носит приоритетный характер, поскольку в ней впервые систематически изучено участие механизмов нарушения ионного гомеостаза клеток различной природы, нарушения конформационно-функциональной стабильности клеточных белков в процессах сублетального и летального повреждения клеток при действии экзогенных химических веществ.
1. Впервые установлено, что эффект действия ряда нейротрансмнттеров на клетки нейрональной природы определяется адекватным внутриклеточным уровнем никотинамидадениндинуклеотида и продуктов его каталитической деградации. Впервые доказано функционирование одного из таких продуктов - циклической аденозиндифосфатрибозы - в качестве "вторичного посредника" в нервных клетках млекопитающих при стимуляции холинэргических и
брадикининовых рецепторов и модуляции активности ионных каналов выходящего потенциал-зависимого калиевого тока М-типа.
2. Обнаружено, что снижение. уровня внутриклеточного
никотинамидадениндинуклеотида ( в том числе ксенобиотиками-
индукторами окислительного стресса) является одним из механизмов
цнтотокснческого эффекта, реализуемым через нарушение передачи
сигнала с активированных рецепторов, сопряженных с ГТФ-
связывающими белками. Доказана возможность коррекции данного
эффекта веществами - субстратными ингибиторами ферментов
каталитической деградации никотинамидадениндинуклеотида.
3. Доказано существование редокс-чувствительных центров в белковых
молекулах ионных каналов, являющихся объектом регуляции при
интоксикации тиолотропными агентами и индукторами окислительного
стресса в клетке, а также в физиологических условиях при активации
рецептор-эффекторных систем.
4. Впервые обнаружено, что одним из механизмов цитотоксичности
тиолотропных ядов является "имитация" естественного
физиологического эффекта нейротрансмиттеров в отношении ионных
каналов нервных клеток.
-
Установлено, что одним из факторов регуляции процессов запрограммированной клеточной смерти при действии ксенобиотиков является изменение активности калиевых и кальциевых ионных каналов и окислительно-восстановительного клеточного гомеостаза в клетках нейрональной природы.
-
Изучены закономерности изменения степени чувствительное нервных клеток к действию экзогенных факторов физической (тепловой шок) и химической природы (ксенобиотики) и развитию феномена спонтанной фрагментации ДНК в зависимости от пролнферативного
статуса клеток, плотности клеточной популяции и характера активации рецепторных молекул.
7. Исследованы особенности проявления мутагенной активности
ксенобиотиков в прокариотических и эукариотических клетках, в том
числе на фоне действия модификаторов репаративиых процессов. Оценен
вклад генотоксического эффекта ксенобиотиков в патогенез
запрограммированной клеточной смерти в гемопоэтических клетках.
8. Экспериментально доказана возможность индукции "перекрестной
резистентности" к действию нейро- и гепатотоксичных ксенобиотиков in
vitro и in vivo путем предварительной гипертермической обработки
(тепловой шок). Продемонстрирована возможность "отмены" индукции
ферментов биотрансформации ксенобиотиков (фенобарбитал-
индуцируемых подфракций цитохрома Р-450) умеренным
гипертермическим воздействием.
9. Установлено влияние окислительного стресса в клетках на регуляцию
серотонином процессов пролиферации и естественной гибели
гемопоэтических клеток. Впервые оценены НАД-зависимые и кальций-
зависимые механизмы в цитотоксическом действии акриламида в клетках
костного мозга, продемонстрирована возможность коррекции этого
действия препаратами - субстратными ингибиторами ферментов
каталитической деградации НАД и блокаторами кальциевых каналов.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Данная работа является фрагментом тем " Патология органов и систем организма при действии акрилатов" ( ИК 216082) и "Ионные механизмы и протеотоксичность в повреждающем действии ксенобиотиков. Патогенетическое обоснование физико-химических методов диагностики и профилактики экзогенных интоксикаций" ( РК
071-01, Pi-C 071-02), выполняющихся на кафедре патофизиологии Красноярской государственной медицинской академии с 1984 по 1995 г. и с 1996 г., соответственно, являющихся, в свою очередь, фрагментами программы ВОЗ/ООН/МОТ по безопасности химических веществ, программы Государственного комитета по науке и технике (номер государственной регистрации 0.69.07).
Научно-теоретическое значение работы заключается в том, что в ней исследованы клеточные и молекулярные механизмы цитотоксического действия ксенобиотиков различной химической структуры, имеющих разные токсикокинетические и токсикодинамические параметры, с позиции существования общих закономерностей проявления повреждающего эффекта в результате нарушения естественной межклеточной и внутриклеточной коммуникации, регуляции запрограммированной клеточной смерти.
Разработаны патогенетически обоснованные методы коррекции экзогенной интоксикации, обеспечивающие нормализацию клеточного ионного, окислительно-восстановительного, генетического гомеостаза.
Постулируется участие механизмов индукции синтеза белков теплового шока в развитии клеточного защитного эффекта при умеренной гипертермии и последующем воздействии ксенобиотиков. Продемонстрирована важность развития феномена протеотоксичности в патогенезе повреждения клеточных структур и формирования адаптационных процессов при экзогенных интоксикациях.
В рамках работы получены патенты Российской Федерации на
изобретения "Способ приготовления препаратов митотических
метафазных хромосом" ( АС 1732222 ,1992 г.), "Способ определения
сенсибилизирующих свойств ксенобиотиков" (Патент № 2012876, 1994 г.)
и "Способ определения мембранотоксичных свойств ксенобиотиков"
(Патент № 5054034/14, 1995 г.). *
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на
Всесоюзном координационном совещании "Гигиенические последствия
загрязнения окружающей среды мутагенными факторами" Института
общей генетики им.Н.И.Вавилова РАН, Самарканд, 1990 г.; Всесоюзной
научной конференции "Реактивность и регенерация тканей", Санкт-
Петербург, 1990 г.; научно-практической конференции "Научно-
технический прогресс и здоровье населения", Красноярск, 1990 г.;
Пленуме Сибирского межобластного общества патофизиологов,
Новокузнецк, 1991 г.; региональной научно-практической конференции
"Профессиональная патология в Восточных регионах страны",
Новокузнецк, 1991 г.; конференции молодых ученых Сибири,
Красноярск, 1990 г., научной конференции "Профилактика и
экспериментальная терапия экстремальных и терминальных состояний",
Омск, 1992 г.; Японо-британской физиологической научной
конференции, Нагоя (Япония), 1995 г.; 15-ой конференции Международного общества нейрохимиков, Киото (Япония), 1995 г.; Международной конференции "Оптика лазеров" , Санкт-Петербург, 1995 г.; Всероссийской научной конференции "Актуальные проблемы теоретической и прикладной токсикологии", Санкт-Петербург, 1995 г.; VII Всероссийском симпозиуме "Коррекция гомеостаза", Красноярск, 1996 г.; Первом Конгрессе Всероссийского общества патофизиологов (с международным участием), Москва, 1996 г.; 4-ом Симпозиуме Японо-Российского Фонда медицинского обмена, Иркутск, 1996 г.; нейрофармакологической конференции " Регуляция калиевых ионных каналов", Канадзава (Япония), 1996 г.; научной конференции Международного общества нейрофизиологов, Вашингтон (США), 1996 г.; научной сессии Президиума Красноярского научного центра СО РАН "Фундаментальные науки - медицине", Красноярск, 1996 г.; VIII Международном симпозиуме "Гомеостаз и окружающая среда",
Красноярск, 1997 г.; научных семинарах Института
нейроинформационных исследований Медицинской школы
Университета г.Канадзава (Япония), 1993-1994 гг.; заседаниях кафедры патофизиологии Красноярской государственной медицинской академии, Красноярских региональных отделений Российских обществ патофизиологов и токсикологов (1992-1997 гг.).
Положения, выносимые на защиту:
1. Ведущим механизмом цитотоксического действия ксенобиотиков-
индукторов окислительного стресса является окислительное повреждение
клеточных биомакромолекул, проявляющееся нарушением
конформационно-функциональной стабильности клеточных белков,
генотоксическим и мембранотоксическим эффектами.
2. Возникающее в условиях окислительного стресса нарушение
клеточного окислительно-восстановительного гомеостаза ( вследствие
ферментативной конверсии никотинамидадениндинуклеотида) имеет
своим результатом нарушение никотинамидадениндинуклеотид-
зависимых эффектов эндогенных регуляторных молекул, в том числе
регуляции активности ионных каналов клеток.
3. Присутствие редокс-регулируемых центров в белках-компонентах
клеточных рецептор-эффекторных систем определяет степень и характер
чувствительности клеток к повреждающему действию тиолотропных
ксенобиотиков и индукторов окислительного стресса, реализуемому в
том числе через "имитацию" естественных эффектов трансмиттерных
молекул и изменение реакций рецепторной десенсибилизации.
4. Аккумуляция структурно поврежденных клеточных белков, а также
вызванное ксенобиотиками нарушение интра- и экстрацеллюлярных
взаимодействий являются пусковыми механизмами реакций адаптации
I.)
клеточной системы или элиминации необратимо поврежденных клеток механизмом запрограммированной клеточной смерти. 5. Характер чувствительности клеток к повреждающему действию факторов физической и химической природы определяется степенью :охранности рецептор-эффекторных регуляторних механизмов, особенностями пролиферативной активности клеток. 5. Протеотоксичность, являясь общим механизмом действия ряда экзогенных факторов химической или физической природы, обеспечивает формирование "перекрестной" резистентности клеток, в гом числе через изменение активности нуклеотид-сопряженных клеточных белков ( ГТФ-связывающие белки, белки теплового шока), выполняющих чаперонную ( облегчение реакций ренатурации белковых молекул) функцию.
7. Коррекция цитотоксического эффекта ксенобиотиков может быть
эффективно осуществлена субстратными ингибиторами ферментов
каталитической конверсии никотинамидадениндинуклеотида,
модификаторами активности кальциевых ионных каналов, гиолопротекторными агентами.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 32 печатные работы, из них 12 - в международной печати.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 350 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, списка литературы и приложений, иллюстрирована 33 таблицами и 38 рисунками. Библиографический указатель включает
470 литературных источников, из них 44 отечественных и 426 иностранных.
