Введение к работе
Актуальность проблемы. Проблема патогенности псевдотуберкулезного микроба представляет собой интересный, но недостаточно изученный раздел его биологии. До сих пор остаются не выясненными механизмы взаимодействия возбудителя псевдотуберкулеза и организма хозяина, особенно на ранних этапах инфекции, когда микроорганизму необходимо преодолеть защитные - гуморальные и клеточные - барьеры макроорганизма и при этом не только выжить, но и увеличить размеры своей популяции. На этой стадии развития инфекционного процесса возбудитель в качестве инструмента воздействия на системы организма хозяина использует макромолекулы, обладающие способностью ингибировать на той или иной стадии фагоцитарный процесс (Езепчук Д.В., 1977; Сомов Г.П. и др., 1990).
По мнению Л.М. Куклевой с соавт. (1997), ведущими факторами патогенности возбудителя псевдотуберкулеза являются адгезины и инва-зины, а также продукты, обусловливающие внеклеточное выживание бактерий путем подавления фагоцитоза или цитопатического воздействия на фагоциты. Что касается внутриклеточного этапа развития возбудителя, то имеющиеся данные фрагментарны, нередко противоречивы (BrubakerR., 1991).
Накопленные к настоящему времени материалы однозначно свидетельствуют о том, что патогенность бактерий, в частности У. pseudotuberculosis, является биологически сложным, полидетерминантным признаком, находящимся под контролем регуляторных систем, детерминирующих выражение как хромосомных, так и плазмидных генов, которые ответственны за синтез макромолекул, принимающих участие в развитии генерализованного инфекционного процесса (Тимченко Н.Ф., 1989; Bolin I. et al., 1982, 1988; Cornells G. R. et al„ 1987, 1998). Рези-стентость псевдотуберкулезного микроба к фагоцитозу, проявляющуюся в способности к факультативному паразитированию в фагоцитах и вследствие этого играющую важную роль в патогенезе инфекции, многие авторы связывают с наличием у него плазмид и их спектром (Шуры-гина И.А. и др., 1994, 2000; Tertti R. et al., 1987).
К настоящему времени выполнено значительное количество исследований, посвященных плазмиде вирулентности иерсиний, однако многие аспекты функционирования антифагоцитарного фенотипа ее генов остаются неясными. Гораздо менее изучен другой внехро-мосомный репликон У. pseudotuberculosis - плазмида pVM82 молекулярной массой 82 мДа. Заболеваемость в виде эпидемических вспышек могут обусловливать оба доминирующих плазмидовара - 48 мДа и 48:82 мДа, содержащиеся в геноме основного этиологического агента псевдотуберкулезной инфекции у людей в Сибири и на Дальнем Востоке - У. pseudotuberculosis 1 серовара. При этом для одноплазмидного варианта характерны вспышки с более благоприятным течением,
преобладанием легких и стертых форм заболевания. Плазмида pVM82 не оказывает влияния на течение эпидемических вспышек, но обусловливает более тяжелое течение заболевания с частым вовлечением в патологический процесс печени и селезенки, поражением суставов и длительностью клинического течения.
С другой стороны, весьма обоснованно полагать, что характер инфекционного процесса, а также течение иммунных реакций при псевдотуберкулезе зависят не только от вирулентности возбудителя, но и от эффективности бактерицидных систем макроорганизма, в том числе антимикробной активности макрофагов и полиморфноядерных лейкоцитов (ПЯЛ) (Фрейдлин И.С., 1984).
К настоящему времени накоплены довольно значительные экспериментальные материалы, затрагивающие более или менее основательно отдельные этапы фагоцитарного процесса при контакте клеток хозяина с псевдотуберкулезным микробом (Ценева Г.Я., 1988; Исачкова Л.М., Плехова И.Г., 1989; Heesmann J., Gaed К, 1989). Между тем, главное звено фагоцитоза - бактерицидные реакции фагоцитов при их взаимодействии с У. pseudotuberculosis, особенно закономерности этих реакций при фагоцитозе бактерий с разным плазмидным составом, -изучены в меньшей мере, что затрудняет понимание механизмов как патогенности псевдотуберкулезного микроба, так и ответных реакций макроорганизма.
Основная цель работы - изучение бактерицидных механизмов (ки-слородзависимые и кислороднезависимые антимикробные системы) фагоцитоза псевдотуберкулезного микроба с разным набором плазмид макрофагами и полиморфноядерными лейкоцитами экспериментальных животных.
Задачи исследования:
-
Изучить фагоцитарную активность макрофагов (перитонеальных, альвеолярных) и полиморфноядерных лейкоцитов экспериментальных животных в отношении псевдотуберкулезного микроба бесплазмидного и плазмидсодержащих вариантов;
-
Исследовать активность ферментных и других систем макрофагов и ПЯЛ, определяющих бактерицидный потенциал фагоцитов при поглощении псевдотуберкулезного микроба бесплазмидного и плазмидсодержащих вариантов.
-
Сопоставить бактерицидную активность в отношении псевдотуберкулезного микроба у перитонеальных, альвеолярных макрофагов и ПЯЛ.
-
Исследовать влияние плазмиды вирулентности У. pseudotuberculosis на бактерицидные реакции фагоцитов.
Научная новизна
На основе комплексного сравнительного исследования впервые получены материалы, характеризующие неизвестные ранее особенности воздействия макрофагов и ПЯЛ экспериментальных животных на
псевдотуберкулезный микроб бесплазмидного и плазмидсодержащих вариантов на всех основных стадиях фагоцитарного процесса.
Установлено, что показатели хемотаксиса и адгезии при взаимодействии макрофагов (как перитонеальных, так и альвеолярных) и ПЯЛ с псевдотуберкулезным микробом в случае бесплазмидного варианта выше, чем в отношении бактерий, содержащих плазмиду pYV48 или комбинацию плазмид pYV48 и pVM82 (pYV48:pVM82).
Показано, что плазмидсодержащие бактерии более устойчивы к разрушению макрофагами и ПЯЛ, чем клетки контрольного бесплазмидного штамма. Плазмида pYV48 и в сочетании с плазмидой pVM82 повышает устойчивость иерсиний к фагоцитозу, подавляет реактивность фагоцитов, что приводит к снижению показателей завершенности фагоцитоза псевдотуберкулезного микроба.
Выявлено, что активность ферментов "окислительного взрыва" (глю-козо-6-фосфатдегидрогеназы и НАДФН-оксидазы), а также супероксиддисмутазы и миелопероксидазы в макрофагах при фагоцитозе бес-плазмидных клеток выше, чем в случае плазмидсодержащих псевдотуберкулезных микробов. Бактерии, несущие плазмиду pYV48 или комбинацию плазмид (pYV48:pVM82), подавляют окислительный взрыв в макрофагах и ПЯЛ, снижают активность супероксиддисмутазы, миелопероксидазы и кислой фосфатазы, уменьшают содержание неферментных катионных белков и тем самым угнетают бактерицидную способность фагоцитов.
Теоретическое и практическое значение работы
Охарактеризованы бактерицидные механизмы фагоцитов при их взаимодействии с псевдотуберкулезным микробом. Разработаны и внедрены в практику научных исследований новые экспериментальные приемы с использованием монослоя культуры макрофагов для количественной оценки активности ферментов, определяющих бактерицидный потенциал макрофагов при фагоцитозе псевдотуберкулезного микроба.
Результаты исследования, представленные в диссертации, использованы при составлении двух методических рекомендаций: "Способ определения активности супероксиддисмутазы в полиморфноядерных лейкоцитах и макрофагах при фагоцитозе У. pseudotuberculosis" и "Способ определения активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и НАДФ-Н-оксидазы в макрофагах".
По результатам работы оформлено два рационализаторских предложения - № 301 и № 302 от 25.01.99. Разработанные методы внедрены в практику научной работы Иркутского противочумного института, Новороссийской и Тувинской противочумных станций.
Положения, выносимые на защиту
1. Плазмидсодержащий псевдотуберкулезный микроб более ус
тойчив, чем бесплазмидный, к фагоцитозу и последующей деструкции
в макрофагах и ПЯЛ.
2. Хемотаксическая и адгезивная активность макрофагов и ПЯЛ в
отношении псевдотуберкулезного микроба зависит не только от наличия в нем плазмид, но и их качественного состава.
3. Факторами, повышающими устойчивость плазмидсодержащего псевдотуберкулезного микроба к фагоцитозу, является его способность ингибировать системы макроорганизма, обеспечивающие выработку активных форм кислорода, синтез неферментных катионных белков, активность СОД и миелопероксидазы, что приводит к снижению бактерицидной способности фагоцитов.
Апробация работы. Материалы, изложенные в диссертации, представлены на:
Международных научных конференциях "Проблемы иерсиниозов и других актуальных инфекций" (Санкт-Петербург, 2000), "Природно-очаговые инфекции" (Улан-Батор, 2000), "Проблемы биологической и экологической безопасности" (Оболенск, 2000); Всероссийских научных конференциях "Экологозависимая патология" (Чита, 1999) и "Проблемы медицины и биологии" (Кемерово, 1999); Всероссийском научно-практическом молодежном симпозиуме "Экология Байкала и Прибайкалья" (Иркутск, 1999,2000); научно-практической конференции "Актуальные вопросы инфекционной патологии" (Барнаул, 1999); научных конференциях Иркутского противочумного института (Иркутск, 1999-2001).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, аналитического обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 110 страницах машинописного текста, иллюстрирована 10 таблицами и 17 рисунками. Список литературных источников содержит 143 наименований, втом числе 73 зарубежных.
