Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Материалы и методы исследований 12
1.1 .Материалы. Объекты исследования 12
1.1.1..Рыбы 12
1.1.2. Белки 16
1.2. Методы исследований 18
1.2.1. Постановка внутривидовых и межродовых скрещиваний леща, плотвы и синца 18
1.2.2. Морфологический анализ потомства от индивидуальных скрещиваний рыб 18
1.2.3. Отбор проб крови и интерстициальной
жидкости 20
1.2.4. Электрофоретические методы анализа белков и нуклеиновых кислот 23
1.2.5. Хроматографические методы анализа белков 37
1.2.6. Разные методы 39
1.2.7. Выделение и очистка белков 48
Глава 2. Внеклеточные белки в раннем развитиирыб 53
2.1. Литературный обзор 53
2.2. Результаты исследований 59
2.2.1. Идентификация белка липовителлина 66
2.2.2. Липовителлин как резервный, структурный и пластический белок 67
2.2.3. Определение времени проявления зародышевых генов 74
2.2.4. Липовителлин как регулятор раннего развития 82
2.2.4.1. Характер проявления родительских аллелей зародышевых генов с разным временем экспрессии в раннем развитии гибридов F] леща, плотвы и синца 82
2.2.4.2. Динамика распределения субстратспецифической активности между изоферментами в ходе развития зародышей рыб 93
Заключение главы 96
Глава 3. Принципы структурно-функциональной организации белков крови хрящевых и костных рыб 99
3.1. Литературный обзор.: 99
3.2. Результаты исследований 101
3.2.1 . Структурно-функциональная организация альбуминов 105
3.2.1.1 .Альбуминоподобные белки хрящевых рыб 105
3.2.1.2. Альбумины хрящевых ганоидов 107
3.2.1.3. Альбумины костистых рыб 112,
3.2.1.3.1. Роль генетических и негенетических факторов формирования структурного разнообразия альбуминов пресноводных рыб 112
3.2.1.3.1.1. Сезонные перестройки альбуминов 119
3.2.1.3.1.2. Универсальный алгоритм структурных трансформаций альбуминов 124
3.2.1.3.2. Низкомолекулярные фракции морских костистых рыб и видов- вселенцев 127
3.2.1.4. Сравнительный анализ альбуминов хрящевых и костных рыб 130
3.2.2. Структурно-функциональная организация глобулинов 131
3.2.2.1. у-глобулины и а-глобулины 131
3.2.2.1.1. Глобулины хрящевых ганоидов 132
3.2.2.1.2. Глобулины костистых рыб 135
3.2.3. Роль небелковых соединений в создании структурного разнообразия сывороточных белков 138
3.2.3.1. Липиды и углеводы 138
3.2.3.1.1. Трансферрины. Роль сиаловых кислот в создании их структурного разнообразия 139
3.2.4. Сравнительный анализ структурно-функциональной организации белков крови рыб 143
3.2.4.1. Белки хрящевых и костных рыб 143
3.2.4.2. Белки пресноводных, солоноватоводных и морских костистых рыб 149
Заключение главы 152
Глава 4. Структурно-функциональная организация гемоглобина 154
4.1. Литературный обзор 154
4.2. Результаты исследований 155
4.2.1. Влияние экспериментальных дестабилизирующих факторов, моделирующих действие факторов внутренней и внешней среды на структурно-функциональные показатели гемоглобина 158
4.2.1.1 .Действие мочевины, солей и замораживания на гемоглобин рыб... 158
4.2.1.2.1. Гемоглобины хрящевых морских туводных рыб 158
4.2.1.3. 2. Гемоглобины хрящевых ганоидов, туводных и проходных 161
4.2.1.4.3. Гемоглобины костистых морских и пресноводных рыб 163
4.2.2. Действие длительного голодания на устойчивость гемоглобина 166
4.3. Роль экологической дифференциации видов в формировании структурно-функциональной разнокачественности гемоглобинов 170
Заключение главы 173
Глава 5. Особенности функциональной организации белков плазмы крови рыб. Сывороточные пероксидазы 175
5.1. Литературный обзор 175
5.2. Результаты исследований 177
5.2.1.Белки с пероксидазной активностью у хрящевых рыб 180
5.2.2. Белки с пероксидазной активностью у хрящевых ганоидов 182
5.2.3. Белки с пероксидазной активностью у костистых рыб 184
5.3. Функциональная организация белков плазмы крови у рыб 190
Заключение главы 194
Глава 6. Особенности интеграции белков внутренней среды рыб в единую систему 196
6.1. Литературный обзор 196
6.2. Результаты исследований 204
6.2.1. Особенности распределения белков плазмы крови между специализированными компартментами внутренней среды организма рыб 206
6.2.2. Фракционный состав белков плазмы крови и интерстициальной жидкости белых мышц рыб в разных экспериментальных условиях 211
6.2.3. Избирательная проницаемость стенок капилляров для белков плазмы крови у костистых рыб 219
6.2.4. Структурные трансформации комплекса альбуминов в ходе адаптации к солености костистых пресноводных и солоноватоводных рыб 220
6.2.5. Перестройка альбуминового комплекса как источник формирования пула низкомолекулярных белков в интерстициальной жидкости белых мышц 222
6.2.6. Олигомерные белки и комплексы у позвоночных 225
Заключение главы 233
Заключение 235
Выводы 237
Список литературы
- Постановка внутривидовых и межродовых скрещиваний леща, плотвы и синца
- Липовителлин как резервный, структурный и пластический белок
- Структурно-функциональная организация альбуминов
- Влияние экспериментальных дестабилизирующих факторов, моделирующих действие факторов внутренней и внешней среды на структурно-функциональные показатели гемоглобина
Введение к работе
Эволюция рыб охватывает несколько геологических эпох. Пережив глобальные изменения климата Земли, рыбы заняли господствующую позицию в Мировом океане, превзойдя по числу видов все другие группы позвоночных (Берг, 1938; Никольский, 1963; Расе, 1977). Эволюционный и экологический успех рыб обеспечен, прежде всего, эффективными механизмами стабилизации внутренней жидкой среды организма, включающей плазму крови, интерстициальную и некоторые другие внеклеточные жидкости (Gamble, 1954; Строганов, 1962; Thorson et al., 1967; lutz, Robertson, 1971; Шмидт-Ниельсен, 1982; Немова, 1992; Новиков, 2000; Озернюк, 2003).
Основной функцией внутренней жидкой среды организма является поддержание оптимальных осмотических отношений внутри организма и с внешней средой. Роль осмотически активных компонентов крови рыб выполняют соли, мочевина и триметиламиноксид (Строганов, 1962; Хлебович, 1974; Наточин, 1979; Шмидт-Ниельсен, 1982; Hegar, Hanke, 1982; Aas-Hansen et al., 2005; Veillette et al., 2005). Белки плазмы крови обеспечивают распределение внеклеточной жидкости организма между внутри- и внесосудистым компартментами и, помимо специфических функций, участвуют в пластическом обмене и транспорте ряда соединений (Строганов, 1962; Share, Claybaugh, 1972; Уайт и др., 1981; Wells et al., 2003).
Современные представления о белках плазмы крови и их транс капиллярном обмене у высших позвоночных основаны на модели крупных белков-мономеров (Klotz et al., 1975; Шульц, Ширмер, 1982), способных проникать в интерстициальное пространство в некоторых отделах макроциркуляционного русла ввиду функциональной разнокачественности капилляров в отношении белков (Pappenheimer, 1953; Landis, Pappenheimer, 1963; Zweifach, Intaglietta, 1968; Peterson et al., 1972; Поленов, Дворецкий, 1976; Осборн, 1978). Белки крови рыб поставлены в условия постоянного осмотического взаимодействия с жидкостями организма и внешней среды, уровень минерализации которой, особенно в случае пресных вод, может существенно колебаться (Шилов, 1985). Поэтому способ организации белков крови и их распределение во внеклеточной жидкости организма подчинены цели быстрой стабилизации водного обмена in situ. Несмотря на то, что исследования физико-химических свойств отдельных белков крови охватывают представителей разных отрядов рыб (Herschberger, 1970; Valenta et al., 1976, 1977; Купер, 1980; Чихачев, 1982; Кирпичников, 1987; Зорин и др., 1994; Mestel, 1996), сведения об участии белков в стабилизации водного обмена немногочисленны (Строганов, 1962; Чихачев, Цветненко 1979; Цветненко, 1986, 1989, 1990; Чалов, Лукьяненко, 1989), а систематических исследований способов организации и интеграции белков крови на рыбах не проводилось. Между тем, выявленные особенности организации геномов высших позвоночных и рыб (Volff, 2005) косвенно позволяют предположить существенные различия их белков, так как организация белковых систем отражает характер генома (Патрушев, 2004).
Изучение структурно-функциональных особенностей белков крови и других внеклеточных жидкостей рыб дополнит имеющиеся представления о способах организации и интеграции белков крови, а также их участии в стабилизации водного и пластического обмена как у рыб, так и у позвоночных в целом.
Постановка внутривидовых и межродовых скрещиваний леща, плотвы и синца
Постановка скрещиваний. Потомство первого поколения Fi получали путем внутривидовых скрещиваний леща Abramis brarna L., плотвы Rutilus rutilus L. и синца Abramis ballerus L. (Лещ x Лещ, Плотва x Плотва, Синец x Синец). Эксперименты по индивидуальному скрещиванию леща, плотвы и синца были осуществлены за весенне-летние периоды 1999-2006 г.г. (Табл.1). Для постановки скрещиваний из естественных водоемов отбирали половозрелые экземпляры плотвы, леща и синца V стадии зрелости гонад и в лотках доставляли на прудовую базу экспериментального научно-производственного стационара ИБВВ РАН. Производителей отлавливали в период нереста в районе Волжского плеса Рыбинского водохранилища. Внутривидовые индивидуальные скрещивания проводили сразу после доставки рыбы. Гонадотропная стимуляция не применялась. Оплодотворение проводили сухим способом по стандартной рыбоводной методике (Рябов, 1981; Слынько, 2000). В результате проведенных скрещиваний был получен материал по раннему развитию потомства F1 леща, плотвы и синца.
Оплодотворенную икру высевали в кристаллизаторы и инкубировали в условиях контроля водообмена, кислородного режима и рН воды при температуре, максимально приближенной к температуре природного водоема. После стадии массового выклева личинки высаживали в кристаллизаторы и отбирали необходимое количество для дальнейшего развития, из расчета 100 экземпляров на 0.1 га пруда. Отобранных личинок помещали в тазы и выдерживали до полного рассасывания желточного мешка и перехода на внешнее питание. Всех личинок содержали в условиях постоянного водообмена, контролируемых температурных и кислородных условиях. По достижению личинками этапа перехода на внешнее питание их помещали в выростные пруды с предварительной акклимацией по температурным и гидрохимическим показателям к условиям конкретного пруда. В конце сентября пруды спускали, проводили подсчет сеголетков. Выборки объемом 30-50 экз. отбирали для дальнейших исследований, остальную часть генерации помещали в зимовальные пруды.
Морфологический анализ потомства от индивидуальных скрещиваний рыб.. Контроль за ходом эмбриогенеза осуществляли, руководствуясь данными по эколого-морфологическим закономерностям развития рыб и методическими руководствами по изучению раннего развития рыб (Крыжановский 1949, 1968; Васнецов, 1953; Игнатьева, 1979; Ланге, Дмитриева, 1981; Макеева, 1992). Ход эмбриогенеза контролировали по следующим стадиям развития: 1 .образование перивителлинового пространства и бластодиска, 2.дробление, 3.бластула, 4.гаструляция, 5.начало сегментации, б.разгар сегментации тела, 7.у становление кровообращения и окончание сегментации, 8.начало выклева, массовый выклев, 9.этап «свободного эмбриона», Ю.этап смешанного питания, 11.этап полного рассасывания желточного мешка и перехода на внешнее питание, малек. Пробы отбирались индивидуально. В период 1999-2002гг. в пробах анализировали электрофоретические спектры общего белка. Для каждой полученной генерации плотвы, леща и синца анализировали спектры общего белка для 8 зародышей на каждой стадии эмбрионального развития. Микропрепарирование личинок с помощью микроинструментов на желточный мешок и бластодерму проводили используя методические рекомендации (Мет.биол.разв., 1974). Количество проанализированных проб зародышей и личинок леща за период с 1999 по 2002 г.г. составило 456 экземпляров, плотвы - 584 экземпляров, синца за 1999 и 2001 составило 144 экземпляров. Общая сумма проанализированных образцов зародышей и личинок в исследованных группах рыб за этот период составила составила 2624 экземпляров. В период 2004-2006гг. в пробах определяли гемоглобин по характеристическим спектрам. По наличию гемоглобина судили о наличии в крови и белков плазмы. Количество проанализированных проб зародышей и личинок леща за период с 2004 по 2006 г.г. составило 200 экземпляров, плотвы - 300 экземпляров.
Отбор проб крови. Пробы крови у крупных рыб отбирали из жаберных сосудов, у мелких - из хвостовых. У половозрелых экземпляров определяли вес, длину, пол и стадию зрелости гонад. Отбор проб на ранних стадиях развития (предличинки, личинки и малька) проводили индивидуально. Каждый зародыш (личинку, малька) помещали в отдельную лунку центрифужного стаканчика или микропробирки типа Eppendorf, давили стеклянной палочкой, заливали 70 мкл воды. Выдерживали для завершения гемолиза (на стадиях, имеющими клетки крови), центрифугировали и далее спектрофотометрировали. Наличие характеристических спектров гемоглобина свидетельствовало о наличии у зародыша белков крови. Для электрофоретического и спектрофотометрического анализа белков крови использовали водорастворимую фракцию. У личинок кровь получали с помощью микрокапилляра из хвостовой вены.
Получение гемоглобина из эритроцитов взрослых рыб и личинок. Для получения чистого гемоглобина кровь от взрослых рыб помещали в 0.5%-ный раствор антикоагулянта гепариноида в физиологическом растворе. Эритроциты отмывали от сывороточных белков 20-25-кратным объемом физиологического раствора с последующим центрифугированием при 3000 об/мин в течение 5-7 минут. Процедуру повторяли 5-6 раз. Гемолиз эритроцитов осуществляли 5-кратным объемом дистиллированной воды. Осадок удаляли центрифугированием при 8000 об/мин в течение 20-30 минут. Полученную надосадочную жидкость использовали в работе.
Липовителлин как резервный, структурный и пластический белок
Aat-1. Структурный ген Aat-І контролирует растворимую s-AAT, являющуюся димером с ММ 93 Ша (Корочкин и др., 1977). Для леща, плотвы и синца описаны три разных аллеля локуса Aat-І (Слынько, 1997, 2000). В проводимых скрещиваниях (Табл.2) родительские экземпляры синца были гомозиготами по медленному (slow) аллелю Aat-sl, леща - гомозиготами по быстрому (fast) аллелю Aat-f; соответствующие гомодимерные изоферменты мы обозначили как AAT-sl и AAT-f. У плотвы выявлен аллель Aat-med, продукт которого занимал на электрофореграмме промежуточное (media) положение между изозимами AAT-f и AAT-sl (Андреева, 2007). Родительские экземпляры плотвы, участвующие в скрещиваниях, были представлены в двух вариантах: гомозиготами по медленному аллелю Aat-sl и гетерозиготами по Aat-sl/med. Гетерозиготную плотву использовали в межродовом скрещивании Синец х Плотва (Табл.2).
Ldh-B, Ldh-A. LDH контролируется двумя генами Ldh-B и Ldh-A. LDH - тетрамер, состоящий из субъединиц 2 типов - А и В. В естественных популяциях для плотвы характерен полиморфизм по локусу Ldh-B, представленный двухаллельной системой; у леща крайне редко встречается полиморфизм по локусу Ldh-A, также представленный двухаллельной системой (Слынько, 1987; 1991; 1993; 1997). В проводимых нами скрещиваниях родительские особи леща и синца были гомозиготами по Ldh-A и Ldh-B; родительские особи плотвы были представлены гомозиготами как по быстрому (В), так и по медленному (В) аллелям локуса Ldh-B (соответственно родителей обозначили как П и П ). Теоретический расчет числа всех возможных В/В - изоферментов дает величину, равную 5 (В4, ВзВ , ВгВ 2, ВВ з, В 4).
fi-Est-1, 2, 3. P-EST-1, 2, 3 - белки-мономеры, контролируются 3 неаллельными генами (Корочкин и др., 1977). В популяциях плотвы из Рыбинского в/х имеет место полиморфизм по всем трем локусам P-Est-1, 2 и 3. Для локуса /З-Est-l выявлено 5 аллелей, для fi-Est-2 - 3 аллеля, для (3-Est-3 - 4 аллеля (Слынько, .1993). У синца и леща из Рыбинского водохранилища локусы P-Est-l и P-Est-З мономорфны, a fl-Est-2 имеет 2 аллеля (Слынько, 1993).
Мв-1, 2 (Mod-1, 2), Idh-1, 6-Pgd, Ahe. Растворимую малатдегидрогеназу-НАДФ-зависимую или малик-энзим мышей, являющийся тетрамерным белком, контролирует локус Mod-1 (Корочкин и др., 1977). У рыб фермент контролируется локусами Ме-1 и Ме-2 (Слынько, 1993) и является, вероятно, димерным белком. По локусу Ме-1 и Ме-2 лещ, плотва и синец были мономорфны, только у плотвы по локусу Ме-2 выявлено 2 аллеля (Слынько, 1993). Растворимая изоцитратдегидрогеназа является димером. Фермент контролируется парой кодоминантных аллелей аутосомного локуса Idh-1 (Корочкин и др., 1977). б-фосфоглюконатдегидрогеназа человека является димерным ферментом с ММ мономера около 47 kDa; контролируется множественными аллелями полиморфного локуса б-Pgd (Корочкин и др., 1977); у человека выявлены 3 фракции фермента. У леща и плотвы 6-PGD из белых мышц кодируется локусом, продукты которого имели видоспецифичные Rf. Ацетилхолинэстеразу из эритроцитов человека контролируют 2 аллеля аутосомного локуса фермента (Корочкин и др., 1977).
Нами проведена работа по анализу свойств внеклеточного белка зародыша - липовителлина. Представлены данные по идентификации этого белка в спектре водорастворимых белков зародыша, описаны его структурные и пластические свойства. Для аргументации нашего предположения о липовителлине как регуляторе раннего развития нами проведено 1) изучение биокаталитических свойств липовителлина, 2) изучение динамики деградации липовителлина как пластического и биокаталитического белка, 3) определение времени первого проявления зародышевых генов с разным временем активации в эмбриогенезе, 4) определение характера проявления родительских аллелей зародышевых генов гибридов и 5) анализ связи динамики деградации липовителлина с характером проявления зародышевых генов с разным временем активации. Для выполнения этих задач на первом этапе мы определяли время достижения каждой из стадий стадий от момента оплодотворения во всех экспериментальных группах зародышей (Табл. 3,4).
Причем, на долю оогенетической LDH, связанной с ЛВ, на стадии бластодиска приходилось до 69%, бластулы - 59,9-63%), гаструлы - до 47,6-50% от общей LDH-активности. По мере развития зародыша доля активности LDH в зоне подвижности ЛВ падала до этапа смешанного питания включительно (Рис. 8).
Распределение оогенетической LDH ( А ) между фракциями ферментов, связанных и не связанных ( ) с ЛВ. 1-7 -стадии развития соответственно: 2 бластомеров; бластулы; вылупления; 12, 36, 60, 108 часов после вылупления у гибридов Fi Плотва х Лещ.
Рост активности в зоне оогенетических ферментов, не связанных с ЛВ, объясняется ростом доли, а не абсолютных значений активности. У микропрепарированных личинок (до вылупления) LDH-активность в желточной фракции локализована в зоне ЛВ, а в зародышевой фракции - в зонах В 4 и В 3А. Таким образом, в неоплодотворенных икринках текучих самок и в зародышах до вылупления активность проявляли оогенетические изоферменты В 4 и В3А из цитоплазмы зародыша и оогенетическая LDH из ЛВ желтка. Фракционирование в градиенте ПААГ не привело к отделению желточной LDH от ЛВ, хотя ММ последнего значительно выше MM LDH. Этот факт свидетельствует о наличии связей между ЛВ и желточной LDH.
Анализ распределения активности (3-EST между оогенетическими и зародышевыми ферментами. У зародышей в зоне ЛВ активность эстеразы проявляется до гаструлы включительно, после чего исчезает из этой зоны подвижности (Рис. 9).
Структурно-функциональная организация альбуминов
Роль генетических и негенетических факторов формирования структурного разнообразия альбуминов пресноводных видов.
Альбумины пресноводных рыб включают низкомолекулярную фракцию НМФ и имеющий более высокие значения ММ белковый комплекс "челнок", присутствующий на электрофореграмме в виде «пятна» с расплывчатыми границами, и часто принимаемый за артефакт (Андреева, 1997, 1999). Такая структура альбуминового комплекса характерна и для сеголеток, и для молоди, и половозрелых рыб (Рис. 32).
В летне-осенний период альбумины имели на электрофореграмме максимальный уровень дифференциации по заряду, достигавший у леща 8, у судака 12 компонентов, у других исследованных видов число фракций составило от 1-2 до 6-8 (Рис. 32).
Рассмотрим структуру НМФ альбуминов на примере леща. НМФ леща в летний период дифференцирована на 5-6 компонентов, которые группировались в 3 фракции - А, В и С по 1-2 компонента в каждой (Рис. 33). Анализ характера их изменчивости и подвижности в ПААГе позволил предположить их ген-детерминацию тремя независимыми локусами {А, В, С) (Андреева, 1999). из «челнок»}« "1 МП її НМФ
На диск-электрофореграмме продукты локуса А часто были замаскированы "челноком", продукты локуса С чаще были инвариантны и представлены 1 полосой Ci , реже встречался менее подвижный продукт С2 другого аллеля локуса С или гетерозиготный спектр из Сі и С2; продукты локуса В различались по своей электрофоретическои подвижности и числу полос. По характеру изменчивости продукции локуса В мы предложили двухаллельную гипотезу ген-детерминации. Стандартная проверка гипотезы по соответствию распределению Харди-Вайнберга подтвердила ее справедливость (Андреева, 1999). Так, частота аллелей медленного и быстрого аллелей по локусу В для выборки из 19 экземпляров составила соответственно 0,61 и 0,39, отклонения по распределению практически не наблюдалось (%2 =0,002 х2СТт)- Количество и характер окрашивания полос у вероятных гетерозигот по локусу В свидетельствуют в пользу мономерной структуры альбумина, кодируемого локусом В.
Поскольку задачей данного исследования является изучение структурно-функциональных особенностей организации белков, касающихся уровня организации молекул (мономер/олигомер) и функции связывания некоторых лигандов (красители и железо-содержащие лиганды, выявление липо- и гликопротеидных комплексов), изучения генетической вариабельности по альбуминам не проводили. Однако, стоит отметить, что несмотря на то, что генетическая вариация по альбуминам описана для многих видов рыб, отмечается сложность в расшифровке электрофореграмм альбуминов в силу расплывчатости, нечеткости полос (Кирпичников, 1987). Понимание особенностей организации альбуминовой системы, возможно, поможет внести ясность в вопрос генетической интерпретации электрофоретических спектров.
ММ компонентов из НМФ В и С в неденатурирующих условиях не превышали у "летних" лещей соответственно 96 и 85 kDa, в денатурирующих условиях 54 kDa. В случае мономерной организации белков разницу в ММ нативных и денатурированных молекул можно объяснить, вероятно, большими количествами абсорбированных на поверхности белка углеводов и липидов, что подтверждалось положительным окрашиванием белков реактивом Шиффа и Суданом черным Б соответственно (Рис.34). Кроме альбуминов на гликопротеиды окрашивались все компоненты как на диск-, так и на и SDS-электрофореграммах, что свидетельствует о наличии в составе белков углеводов, ковалентно связанных с молекулой белка.
Фингерпринт сывороточных белков леща в неденатурирующих условиях градиента концентраций ПААГ (А) и денатурирующих условиях электрофореза с 8М мочевиной (11% ПААГ) (Б) и SDS-ПААГ (В). Горизонтальная стрелка указывает направление диск-, вертикальная - электрофореза в градиенте ПААГ (А), ПААГ с 8М мочевиной (Б) и SDS-ПААГ (В). Маленькая стрелка указывает дорожку «челнока».
В двухмерном электрофорезе в присутствии 8 М мочевины число цепей, на которые диссоциировал "челнок", достигало 10-12. В восстанавливающих условиях SDS-электрофореза количество цепей составило 11-13, цепи имели ММ от 18,5 до 73 kDa. Таким образом, можно полагать, что белки в составе «челнока» стабилизированы в основном нековалентными связями. Среди цепей по относительному содержанию выделялся макрокомпонент с ММ 67
Влияние экспериментальных дестабилизирующих факторов, моделирующих действие факторов внутренней и внешней среды на структурно-функциональные показатели гемоглобина
Для сравнения отметим, что в гемолизированных сыворотках (от 20 лещей) на Fe одновременно окрашивалось уже не 2-3, а 6-9 компонентов, среди которых помимо вышеперечисленных обнаружены дополнительные компоненты в зонах подвижности yL_ глобулинов и трансферрина. Предполагается, что этими дополнительными компонентами являются гемоглобин-, гемин- или Fe3+- связывающими белками. И, следовательно, можно ожидать выявления пероксидазной активности в указанных зонах подвижности белков.
С этой целью мы проанализировали более подробно отдельные белки и белковые комплексы в отношении их способности к связыванию железосодержащих лигандов и проявления пероксидазной активности.
Инкубирование визуально негемолизированных образцов сыворотки леща, содержащих один железосодержащий компонент в области аа- глобулинов (Rf 0.1-0.12), с избытком железосодержащей соли приводило к стабильному связыванию Fe3+ как трансферрином, так и челноком (Ch). В двух пробах из 20 удалось зафиксировать связывание железа альбуминами. Следовательно, наибольшее сродство к железу среди сывороточных белков негемолизированных сывороток имели трансферрин, челнок и альбумины. Однако пероксидазную активность проявлял только челнок.
Пероксидазная активность среди железосодержащих белков гемолизированных сывороток была выявлена в зонах подвижности уп_ глобулинов (Rf 0.02), угглобулинов (Rf 0.083-0.087), аг-глобулинов (Rf 0.1-0.12) и в зоне подвижности челнока (Rf 0.52-0.57). Данные белки имели в своей структуре гемин, что доказывалось выявлением последнего на границе Кольрауша в соответствующих участках двухмерных электрофореграмм в денатурирующих условиях.
Окрашивание бензидином области у; глобулинов (Rf 0.02) показало его случайный характер: одни и те же пробы сыворотки в идентичных условиях могли окрашиваться и не окрашиваться бензидином. Вероятно, это следствие случайного характера связывания уъ глобулинами гемоглобина. При наличии связывания, на двухмерных SDS-электрофореграммах в зоне подвижности уП- глобулинов выявлялась субъединица с подвижностью тропонина С, идентифицированная, как субъединица гемоглобина. Инкубирование с избытком гемоглобина (на 1 мл сыворотки 2, 3 и 5 мг гемоглобина) и различная экспозиция (12, 18, 24 часов) не приводили к нарушению случайного характера окрашивания этой зоны. По всей видимости, в образовании связей между yD_ глобулинами и гемоглобином принимают участие очень слабые нековалентные взаимодействия.
Следующая группа белков с пероксидазной активностью располагалась на электрофореграмме в зоне подвижности уг и а2-глобулинов (Rf 0.087 186 0.12) (рис.6). Эти белки стабильно окрашиваются бензидином во всех гемолизированных сыворотках. У 25% негемолизированных сывороток эта область не окрашивается бензидином и реактивом Мюллера.
Инкубирование таких сывороток с избытком нативного гемоглобина приводило к восстановлению пероксидазной активности в этой зоне (Rf ОЛ-0.12), что обусловлено наличием в ней гемоглобинсвязывающего белка. Дополнительным доказательством наличия связывания гемоглобина служит проявление в этой зоне на SDS-электрофореграммах структурных элементов гемоглобина в виде субъединиц с ММ около 18 Ша (Рис. 79 ).
При окрашивании же бензидином негемолизированных сывороток, относящимся к тем 75%, у которых область с Rf 0.087-0.12 проявляет пероксидазную активность, на второй и третий день после взятия крови на двухмерных электрофореграммах в денатурирующих условиях не всегда удавалось обнаружить гемин на границе Кольрауша, что вероятно вызвано процессами деструкции связанного гаптоглобинами гемоглобина. Таким образом, в зоне подвижности а2-глобулинов (Rf 0.1-0.12) у леща располагается специализированный белок гаптоглобин. Комплекс Нр-НЬ выявлялся бензидином только в первые сутки после взятия крови. Это может быть связано с крайней неустойчивостью гемоглобина по связи гем-глобин. Связывание Нр с НЬ происходит в области глобина последнего. Вероятно, у леща этот процесс сопровождается дополнительной дестабилизацией связи гем-глобин, которая, в отличие от свободного НЬ, уже через сутки, вместо двух, начинает разрушаться с освобождением гема. Комплекс Нр-НЬ теряет при этом пероксидазную активность. Инкубирование такой сыворотки с избытком нативного НЬ не приводило к восстановлению пероксидазной активности Нр, по причине, вероятно, более низкого сродства Нр к нативному гемопротеиду, чем к глобину деструктурированного гемоглобина.
У леща в зоне подвижности аг-глобулинов присутствуют также субъединицы с ММ около 24 кД и 46 кД (Рис. ). У человека в аналогичной зоне подвижности присутствуют а- и р- субъединицы Нр с ММ соответственно 19.8 и 42.6 кД. Таким образом, в сходных зонах подвижности у леща и человека наблюдается определенные сходство обозначенных субъединиц по параметру ММ. Следовательно, не исключено, что гаптоглобины человека и леща имеют сходные структурные элементы в виде а- и Р цепей.
