Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1. Общая характеристика, особенности клинико-гематологических проявлений, принципы диагностики и прогностические критерии гемобластозов у детей 12
1.2. Патогенез гемобластозов 16
1.3. Система детоксикации ксенобиотиков как фактор инициации и промоции опухолевого процесса 18
1.4. Генетические основы прогрессии опухолевого роста при гемобластозах 25
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 36
2.1. Объект исследования 36
2.2. Методы исследования 38
2.3. Статистическая обработка результатов 44
ГЛАВА 3. Результаты исследования и обсуждение
3.1. Клинико-гематологическая характеристика больных гемобластозами 46
3.2. Полиморфизм генов системы детоксикации ксенобиотиков у больных гемобластозами 55
3.2.1. Изучение полиморфизма генов системы цитохрома Р450 55
3.2.2. Изучение полиморфизмов гена микросомальной эпоксигидролазы 64
3.2.3. Анализ полиморфизмов генов глутатион-8-трансфераз 73
3.2.4. Анализ полиморфизмов гена N-ацетилтрансферазы 2 85
3.2.5. Изучение полиморфизма гена множественной лекарственной резистентности 95
3.2.6. Изучение комбинаций генотипов генов системы детоксикации ксенобиотиков у больных гемобластозами 101
3.3. Оценка степени метилирования генов-супрессоров опухолевого роста р15 и ріб у больных гемобластозами 104
3.4. Полиморфизм генов цитокинов у больных гемобластозами 109
3.4.1. Анализ промоторного полиморфизма гена интерлейкина 6 109
3.4.2. Изучение полиморфизмов генов семейства фактора некроза опухолей 113
Заключение 122
Выводы 130
Практические рекомендации 132
Список литературы 133
- Общая характеристика, особенности клинико-гематологических проявлений, принципы диагностики и прогностические критерии гемобластозов у детей
- Генетические основы прогрессии опухолевого роста при гемобластозах
- Изучение полиморфизма генов системы цитохрома Р450
- Оценка степени метилирования генов-супрессоров опухолевого роста р15 и ріб у больных гемобластозами
Введение к работе
Актуальность темы. В последние годы во всем мире наблюдается рост заболеваемости злокачественными новообразованиями, одной из причин которого является загрязнение окружающей среды. Результаты корреляционного анализ "і связи между количественными показателями внешнесредового загрязнения и распространенности онкозаболеваний, проведенного в 84 городах Российской Федерации (РФ), позволили установить, что увеличение загрязнения атмосферного воздуха на 100 мкг/м сопровождается увеличением заболеваемости злокачественными новообразованиями (ЗНО) почти на 20% [Гичев Ю.П., 2002]. В 1990 году заболеваемость ЗНО в детском возрасте в РФ составляла 8,5 на 100 000 населения, тогда как в 1999 заболеваемость возросла до 10,9 на 100 000 [Трапезников Н.Н. и др., 2001]. В детском возрасте к наиболее распространенным онкологическим заболеваниям относятся гемобластозы (ГБ) - группа злокачественных новообразований клеток системы кроветворения, на долю которых приходится до 45%) всей онкопатологии в возрастной группе до 14 лет.
В Республике Башкортостан (РБ) в 1999 году заболеваемость ЗНО в детском возрасте составила 12,3 на 100 000, а заболеваемость ГБ - 5,0 на 100 000 детского населения [Трапезников Н.Н. и др., 2001].
В структуре детской смертности в РФ новообразования и болезни крови и кроветворных органов занимают 6 место после несчастных случаев, отдельных состояний перинатального периода, врожденных пороков развития, болезней органов дыхания и инфекционных заболеваний. Абсолютное число детей, умерших от злокачественных новообразований, в 1999 году в РФ составило 1451, среди которых на долю заболеваний лимфатической и кроветворной тканей пришлось 42% (610 детей). Важно отметить тенденцию к снижению смертности от ГБ с 3,5 до 2,3 на 100 000 за последние 10 лет.
7 Снижение смертности от ГБ связано с применением современных программ полихимиотерапии. В настоящее время при остром лимфобластном лейкозе (ОЛЛ) выздоравливает 70-75% детей, при остром миелобластном лейкозе (ОМЛ) - 40-50% детей, а при неходжкинских лимфомах (НХЛ) выживаемость у детей составляет более 75% [Алексеев Н.А, 1998]. Однако, терапия ГБ остается серьезной проблемой педиатрии и гематологии. Повышение ее эффективности связывают с ранней диагностикой заболевания, назначением индивидуально подобранных максимально переносимых доз цитостатических препаратов, адекватной сопроводительной терапией, направленной на коррекцию токсического действия препаратов, подавлением первичной и вторичной резистентности опухолевых клеток к химиотерапии и поиском новых путей противоопухолевой терапии. Решение этих проблем невозможно без детального изучения патогенеза ГБ.
Наиболее эффективно организм функционирует при сопряженном, гармоничном действии ферментов системы детоксикации экзогенных и эндогенных ксенобиотиков, репарации повреждений ДНК, апоптоза, пролиферации и дифференцировки клеток [Perera F.P., 1996]. Отмена или ослабление механизмов негативного контроля пролиферации, активация и превалирование влияния факторов положительного контроля роста в сочетании с отменой апоптоза в ДНК поврежденных клеток приводит к иммортализации и усиленной пролиферации неотрансформированных клеток [Perera F.P., 1996; Баранов B.C. и др., 2000; Новик А.А. и др., 2001].
Известно, что канцерогенез является результатом действия многих факторов, среди которых немаловажную роль играет генетическая предрасположенность. Известно, что дети с врожденными хромосомными аномалиями относятся к группе лиц с повышенным риском развития ГБ, так, например, у детей с синдромом Дауна риск развития острого лейкоза повышен в 10-20 раз [Plowman P.N. et al., 1992]. Среди генов-кандидатов патогенеза ЗНО основное значение отводится онкогенам и генам-супрессорам опухолевого
8 роста, тогда как другие генные системы, в том числе гены детоксикации и гены цитокинов, играют роль модификаторов функции главных генов [Баранов B.C. и др., 2000; Владимирская Е.Б., 2001; Назаров П.Г., 2001].
В этой связи, наряду с изучением генов-кандидатов ЗНО, в последние годы все шире изучается вклад многокомпонентной системы детоксикации ксенобиотиков, генов цитокинов и супрессоров опухолевого на предрасположенность к развитию, тяжесть течения и индивидуальную чувствительность к применяемым цитостатическим препаратам. Однако в литературе опубликованы единичные исследования по изучению полиморфных вариантов генов системы детоксикации ксенобиотиков, цитокинов и метилирования генов-супрессоров опухолевого роста и оценке их прогностической значимости при гемобластозах в детском возрасте, в связи с чем, актуальным является изучение ассоциации полиморфных вариантов генов указанных систем с предрасположенностью к развитию и тяжестью течения гемобластозов у детей [Canalle R., 2004; Davies S.M., 2000; Krajinovic М., 1999; OkudaT., 1995].
Цель настоящего исследования: выявление клинико-генетических ассоциаций генов детоксикации ксенобиотиков, супрессоров опухолевого роста и цитокинов при гемобластозах у детей и определение их значимости в оценке риска развития и прогноза течения заболевания.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
Оценить клинико-гематологические особенности и показатель выживаемости у детей с гемобластозами в Республике Башкортостан.
Определить частоту аллельных и генотипических вариантов генов системы детоксикации ксенобиотиков, цитокинов и частоту метилирования генов супрессоров опухолевого роста при гемобластозах у детей.
Выявить генотипы, играющие протективную роль в развитии гемобластозов у детей, установить генотипы повышенного риска развития гемобластозов в
9 детском возрасте, а также генотипы, ассоциированные с неблагоприятным исходом гемобластозов у детей.
4. Разработать подходы к оценке риска развития заболевания и прогноза течения гемобластозов у детей.
Научная новизна работы. Проведено изучение структуры заболеваемости гемобластозами с учетом линейной принадлежности опухолевых клеток. Дана оценка клинических и гематологических особенностей гемобластозов в детском возрасте. Проанализированы показатели выживаемости при различных вариантах гемобластозов у детей. Проведен комплексный молекулярно-генетический анализ полиморфных вариантов генов детоксикации ксенобиотиков, цитокинов и супрессоров опухолевого роста при ГБ у детей. Выявлено, что мутантный аллель Val гена первой фазы детоксикации ксенобиотиков CYP1A1 и медленный генотип *5*5*6 гена второй фазы детоксикации ксенобиотиков NAT2 ассоциированы с повышенным риском развития гемобластозов в детском возрасте. Показано, что комбинация генотипов CYPlAl*IleVal/CYP2El*ClC2, определяющих повышение активности цитохромов Р-450 и активная форма микросомальной ЕРНХ1 ассоциированы с писком развития неходжкинских лимфом в детском возрасте. Установлено, что генотип, определяющий повышение активности микросомальной ЕРНХ1, ассоциирован с риском развития острых лимфобластных лейкозов у детей. Показана роль подавления активности гена-супрессора опухолевого роста р16 путем гиперметилирования промотора в развитии острых лимфобластных лейкозов у детей. Выявлено, что функционально активный ген второй фазы детоксикации GSTT1 ассоциирован с риском развития острого миелобластного лейкоза у детей в РБ. Выявлены комбинации генотипов генов детоксикации ксенобиотиков повышенного риска развития гемобластозов, с характеризованы сочетания протективных генотипов генов детоксикации ксенобиотиков. Установлено, что генотип TNF*GA гена
10 фактора некроза опухолей ассоциирован с риском развития В-клеточных гемобластозов у детей в РБ.
Практическая значимость. Выявление полиморфных вариантов гена системы детоксикации ксенобиотиков NAT2, гена CYP1А1 и его комбинации с генами ЕРНХ1, GSTT1 MDR1 позволяет проводить оценку предрасположенности к развитию гемобластозов в детском возрасте. Тестирование промежуточного фенотипа гена первой фазы детоксикации ксенобиотиков ЕРНХ1 может использоваться в качестве прогностического маркера неблагоприятного исхода терапии рецидива гемобластозов в детском возрасте.
Результаты работы могут быть использованы при разработке основ и медико-генетического консультирования.
Внедрение в практику. Выявленные генетические маркеры используются для прогнозирования течения гемобластозов у детей в онкогематологическом центре Республиканской детской клинической больницы.
Материалы исследования внедрены в педагогический процесс на кафедре госпитальной педиатрии с курсом поликлинической педиатрии и кафедре биологии Башкирского государственного медицинского университета.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 157 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 22 таблицей и 30 рисунками. Список литературы включает 221 источника, в том числе 35 публикации отечественных и 186 иностранных авторов.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. В структуре гемобластозов у детей преобладают острые лимфобластные лейкозы, реже встречаются острые миелобластные лейкозы и неходжкинские лимфомы. На долю В-клеточных гемобластозов приходится 71,43%, Т- линейный вариант заболевания диагностируется в 28,57% случаев. При остром лимфобластном лейкозе общая двухлетняя выживаемость составляет 78,84±4,71%, четырехлетняя - 58,82±7,32%. При остром миелобластном лейкозе общая выживаемость за 12 месяцев составляет 3 7,5 0± 14,07%), при неходжкинских лимфомах общая выживаемость за 15 месяцев наблюдения составляет 61,54±16,64%.
Повышенный риск развития гемобластозов у детей ассоциирован с мутантным аллелем гена первой фазы детоксикации ксенобиотиков CYP1A1 и его комбинациями с генотипами генов ЕРНХ1, GSTT1.
С неблагоприятным прогнозом рецидива гемобластозов ассоциирован промежуточный фенотипический вариант гена первой фазы детоксикации ксенобиотиков ЕРНХ1, что можно использовать в качестве критерия риска при проведении терапии заболевания.
Проте ктивную роль при развитии гемобластозов в детском возрасте играют генотип Пе/Пе гена CYP1A1, аллель Не гена CYP1A1, генотип NAT2*74 (BamHl) и аллель NAT2*7 гена N-ацетилтрансферазы 2, комбинации генотипов генов детоксикации ксенобиотиков CYPlAl*IleIle/EPHXl*S-фенотип/GSTTl* 1, CYP1 Al*IleIle/GSTTl*0/MDRl*СТ.
Повышенный риск развития острого лимфобластного лейкоза у детей связан с метилированием промоторной области гена р16. Ассоциации метилирования промоторной области гена р16 с тяжестью течения заболевания не выявлено.
6. Полученные результаты позволяют прогнозировать риск развития заболевания гемобластозами в группе детей, предрасположенных к развитию злокачественных новообразований, и оптимизировать проведение цитостатической терапии.
Общая характеристика, особенности клинико-гематологических проявлений, принципы диагностики и прогностические критерии гемобластозов у детей
Гемобластозы - группа злокачественных новообразований клеток системы кроветворения. ГБ относятся к наиболее распространенным онкологическим заболеваниям в детском возрасте, на долю которых приходится 45,00% всей онкопатологии в возрастной группе до 14 лет [Трапезников Н.Н. и др., 2001]. В структуре заболеваемости ГБ у детей первое место занимают острые лимфобластные лейкозы (ОЛЛ), встречающиеся с частотой 49,00%, остальное число случаев представлено лимфосаркомами -19,00%, ходжкинскими лимфомами - 15,00%, острым миелобластным лейкозом (ОМЛ) - 5,50% и другими - 11,50% [Павлова М.П., 1996; Алексеев Н.А., 1998; Владимирская Е.Б., 2001].
В соответствии с франко-американо-британской (FAB) классификацией, основанной на морфологических признаках бластных клеток, выделяют 3 типа ОЛЛ: LI, L2, L3 [Волкова М.А., 2001; Воробьев А.И., 2002]. Применение иммунофенотипических методов исследования лимфобластных клеток в группе ОЛЛ позволяет выделить Т- и В-клеточные лейкозы [Волкова М.А., 2001; Воробьев А.И., 2002]. В группу ОМЛ объединяют гемобластозы из клеток-предшественниц миелопоэза: острый миелобластный, промиелоцитарный, миеломонобластный, моноцитарный лейкозы, эритромиелоз и др. [Павлова М.П., 1996; Алексеев Н.А., 1998; Волкова М.А., 2001; Воробьев А.И., 2002]. Среди лимфосарком в детском возрасте наиболее часто встречаются неходжкинские лимфомы (НХЛ), как правило, являющиеся опухолями высокой степени злокачественности и имеющие диффузную гистологическую структуру [Беликова Л.Ю., 1994]. Согласно классификации «Working Formulation» Национального института рака (США), предложенной в 1982 году, выделяют три большие группы детских НХЛ: лимфобластные (Т-клеточные и В-клеточные), беркитоподобные и крупноклеточные лимфомы. Основную часть НХЛ составляют Т-клеточные опухоли (80%), при которых отмечается склонность к развитию массивных опухолей в медиастинальном пространстве, лейкемическая трансформация костного мозга по типу острых лейкозов и поражение ЦНС [Беликова Л.Ю., 1994] .
В течении ГБ выделяют развернутый период (манифестация), ремиссию, рецидив и терминальную стадию заболевания [Павлова М.П., 1996; Алексеев Н.А., 1998]. Развернутый период характеризуется выраженным угнетением нормального кроветворения, связанного с лейкемической инфильтрацией костного мозга. Как следствие этого развивается геморрагический синдром и различные инфекционные осложнения. Частичная ремиссия характеризуется гематологическим улучшением, уменьшением бластных клеток в костном мозге и спинномозговой жидкости, отсутствием клинических признаков нейролейкоза при подавлении очагов лейкозной инфильтрации в других органах. К полной ремиссии относятся состояния, при которых в пунктате костного мозга обнаруживается не более 5% бластных клеток или общее количество лимфоидных клеток менее 30%, из них бластных клеток менее 5% [Алексеев Н.А., 1998]. Однако даже при полной клинико-гематологической ремиссии у больных могут оставаться до 10 остаточных опухолевых клеток. Этот феномен получил название минимальная остаточная болезнь (MRD). В соответствии с критерием MRD в практику введено понятие цитогенетической и молекулярной ремиссии. Диагностика MRD открывает новые возможности оценки проведенной терапии и идентификации группы пациентов, имеющих повышенный риск развития рецидива [Cave Н.С. et al, 1998; Новик А.А., 2001]. Выздоровление от ГБ диагностируется при продолжительности полной ремиссии на протяжении 5 и более лет. Рецидив ГБ может быть костномозговым (появление более 5% бластных клеток в пунктате) или местным - внекостномозговым, с любой локализацией лейкемической инфильтрации. Терминальная стадия развивается при неэффективности цитостатической терапии, прогрессировании процесса, нарастании гранулоцитопении, тромбоцитопени, появлении некрозов мягких тканей и спонтанных кровотечений. Диагностика ГБ включает исследование периферической крови, костного мозга и проведение трепанобиопсии [Павлова М.П., 1996; Вуд М., 1997; Дурнов Л.А. и др., 1997; Алексеев Н.А., 1998; Pui С.-Н. et al., 1998; McKenna R.W., 2000; Pui С.-Н., 2000; Волкова М.А, 2001; Воробьев А.И., 2002; Афанасьева Б.А. и др., 2002; Черствой Е.Д. и др., 2002]. Анемия, тромбоцитопения и нейтропения являются характерными признаками, выявляющимися при постановке диагноза. Пунктат костного мозга характеризуется бластной метаплазией (более 20%), нормальные ростки гемопоэза сужены. Определение варианта ГБ проводится на основании данных иммунофенотипирования бластных клеток и морфоцитохимического исследования. При рентгенологическом исследовании грудной клетки у 5-10% больных определяется увеличение средостения за счет увеличения внутригрудных лимфатических узлов и/или вилочковой железы. При ультразвуковом исследовании может быть выявлено увеличение печени, селезенки и лимфатических узлов брюшной полости и забрюшинного пространства. При выполнении диагностической люмбальной пункции у 3-5% больных в цереброспинальной жидкости обнаруживаются лейкемические клетки, что свидетельствует об исходном вовлечении в процесс центральной нервной системы (нейролейкемия)., К моменту диагностирования ГБ опухоль уже достаточно велика и достигает, как правило, 1x1012 клеток на 1 м2 поверхности тела, что составляет около 3-4% его массы. Важно подчеркнуть, что опухолевые клетки при ГБ распространяются по системе кроветворения в самом начале заболевания, что обуславливает первоначально системный характер поражения. Положение о прогностических факторах при ГБ возникло с момента появления адекватной химиотерапии, поскольку только использование стандартных программ позволяет выделить больных с определенными клиническими, морфологическими, цитогенетическими, иммунофенотипическими характеристиками, у которых удается или не удается добиться эффекта [Павлова М.П., 1996; Friedmann H.J. et al., 2000; Волкова M.A., 2001; Воробьев А.И., 2002]. При остром лимфобластном лейкозе наиболее значимым фактором прогноза считается число лейкоцитов в момент диагностики. Существует обратная линейная зависимость между числом лейкоцитов в гемограмме и продолжительностью ремиссии. Результаты лечения больных с лейкоцитозом более 100x10 /л пессимистичны [Алексеев Н.А., 1998].
Генетические основы прогрессии опухолевого роста при гемобластозах
Возникновение соматических мутаций клеток-предшественниц кроветворной или лимфоидной ткани под воздействием эндогенных и экзогенных канцерогенных веществ приводит к формированию клона леикозных клеток. Прогрессия опухолевого клона находиться под контролем белков-супрессоров опухолевого роста и цитокинов. Инактивация генов 26 супрессоров опухолевого роста и повышение экспрессии генов цитокинов приводит к преимущественной пролиферации злокачественно трансформированных клеток.
Прогрессия опухоли - это процессы размножения, инвазии и метастазирования малигнизированных клеток. Бесконтрольная пролиферация опухолевых клеток при новообразованиях является результатом дисрегуляции двух основных путей контроля клеточного цикла: р53/р21 и pl6/pRb [Smith-Sorensen В. et al., 1996; Esteller M. et al., 2000].
В регуляции пролиферации гемопоэтических клеток важная роль принадлежит pl6/Rb контролю клеточного цикла. Фосфорилирование белка ретинобластомы (pRb) комплексом циклин - циклин-зависимые киназы (ЦЗК) ведет к освобождению активатора транскрипции E2F в результате распада неактивного комплекса pRb-E2F, что приводит к вхождению клетки в синтетическую фазу клеточного цикла [Esteller М. et al., 2000]. Продукты генов-супрессоров опухолевого роста pl5INK4b и pl6INK4a работают как негативные регуляторы клеточной пролиферации, взаимодействуя с ЦЗК4 и подавляя ее киназную активность. В нормальных клетках эти молекулы действуют скоординировано в ответ на сигналы остановки клеточного цикла, что приводит к задержке клетки в Go-фазе для репарации повреждений ДНК. В опухолевых клетках гены-супрессоры опухолевого роста часто бывают мутационно повреждены, а циклиновые комплексы разрушены [Esteller М. et al, 1999]. В результате этого опухолевые клетки проходят через стадии клеточного цикла без репарации генетических повреждений.
В основе инактивации генов-супрессоров опухолей и селективного роста злокачественно измененных клеток лежат генетические и эпигенетические повреждения [Herman J. et al., 2003]. Генетические изменения включают точковые мутации, делеции, перестройки, тогда как эпигенетические изменения (метилирование) влияют на временной и пространственный контроль экспрессии гена без изменения в последовательности ДНК. Метилирование (энзиматическое присоединение метильной группы к цитозину, расположенному в 5лСрО-Зл динуклеотидах) регуляторных элементов генома, таких как промотор, энхансер, инсулятор и репрессор, подавляет их функциональную активность, в результате эффективность генной экспрессии уменьшается, а нередко экспрессия гена вообще не определяется [Сингер М. и др., 1998; Rothenburg S. et al.,2001; Garinis G. et al., 2002].
Существует два ключевых механизма блокировки транскрипции путем метилирования генома. В одном случае метилирование подавляет связывание транскрипционных факторов с регуляторными элементами гена, во втором -белковые комплексы (МеСР2), связанные с метилированными CpG-динуклеотидами, ограничивают доступ активаторов транскрипции к регуляторным элементам [Baylin S. et al., 2001; Bird А., 2002]. Метилированние CpG-динуклеотидов способствует процессу деацетилирования гистонов, что приводит к формированию транскрипционно неактивного хроматина [Costello J. et al, 2001; Herman J. et al, 2003].
Известно, что плотность метилирования CpG-динуклеотидов играет важную роль в подавлении активности гена. В работе Cameron Е. et al, 1999 было определено, что плотность метилирования в размере 6-8% от общего числа CpG-динуклеотидов CpG-островка промотора гена р15 является пороговой для инактивации транскрипции гена [Cameron Е. et al, 1999]. Уровень метилирования 30% и больше от общего числа CpG-динуклеотидов островка полностью блокирует транскрипцию гена [Cameron Е. et al, 1999; Baylin S. et al, 2001; Galm O. et al, 2001].
Одним из важных аспектов метилирования является то, что это состояние является ранним при развитии опухолевого процесса и сохраняется в ряду многих поколений клеток [Сингер М. и др, 1998].
Патологическое метилирование генов р15 и р16 описано при опухолях легких, головы, шеи, глиомах, карциноме молочной железы, это довольно частое событие при лимфомах, множественной миеломе, плазмобластных лейкозах [Ng М. et al., 19974 Toyota М. et al., 2000; Esteller M. et al., 2001].
Исследования метилирования CpG динуклеотидов генов, вовлеченных в канцерогенез, можно проводить на образцах ДНК, полученных из первичных опухолевых тканей, сыворотки крови, мочи, мокроты, что особенно важно для ранней диагностики опухоли [Smith-Sorensen В. et al., 1996; Baylin S. et al., 2001].
Важно также отметить, что метилирование генов р16 и р15 ассоциировано с агрессивной формой опухоли и прогрессией заболевания [Ваш A. et al., 1999; Child F. et al., 2000; Esteller M. et al., 2000; Garinis G.et al, 2002]. Гиперметилирование генов, потеря функции которых приводит к повышению метастатического потенциала, коррелирует с агрессивностью течения карциномы легкого, тогда как гиперметилирование гена, связанного с репарацией ДНК при опухоли мозга, ассоциировано с ответом на химиотерапию с применением алкилирующих агентов [Omura-Minamisawa М. et al., 2000]. Поэтому определение степени метилирования генов-супрессоров опухолевого роста может служить ранним маркером агрессивности опухолевого процесса.
Изучение полиморфизма генов системы цитохрома Р450
Когда больные были разделены на группы с учетом клинического диагноза заболевания, генотип GG был выявлен только в группе детей с ОЛЛ (8,33%, против 2,78% в контроле) (р=0,058). Среди больных ОМЛ и НХЛ гомозигот по мутантному аллелю выявлено не было. Гомозиготы по дикому аллелю LTA AA преобладали в группе детей с НХЛ - 81,82% по сравнению с 54,17% в контроле (р 0,05).
В работе Бакирова Б.А. с соавт. 2003, по изучению ассоциации полиморфизма A+252G гена LTA с предрасположенностью к развитию ХЛЛ показано, что генотип LTA GG в группе больных с ХЛЛ встречался в три раза чаще по сравнению с контролем (9,0% против 3,0%) [Бакиров Б.А. и др., 2003].
При анализе распределения генотипов гена LTA с учетом линии дифференцировки лимфобластов показана тенденция к повышению частоты генотипа LTA AG в группе В-клеточных ГБ до 35,00% по сравнению с группой Т-клеточных ГБ, в которой LTA AG-генотип встречался в 18,75% случаев (р 0,05).
Анализ ассоциации генотипов гена LTA с уровнем лейкоцитоза в период постановки диагноза показал тенденцию к повышению частоты генотипов LTA AG и LTA GG до 42,86% и 7,14%, соответственно, в группе детей с количеством лейкоцитов более 20,00x109/л в период диагностики заболевания по сравнению с группой детей с количеством лейкоцитов менее 20,00x10 /л (33,33% и 4,76%) (р 0,05).
Анализ распределения генотипов гена LTA с учетом эффективности терапии и исхода заболевания показал снижение частоты LTA AA генотипа (58,33% против 61,84%) и повышение LTA AG генотипа (33,33%) против 31,58%) в группе детей с рецидивом заболевания по сравнению с детьми в стойкой ремиссии (р 0,05). В работе Stanulla М. et al., 2001 получены сходные результаты, но различия между частотами генотипов более выражены (39,1% против 46,9% и 50,0% против 35,9% , соответственно) [Stanulla М. et al., 2001].
Частота генотипа AG и аллеля G гена LTA была выше в группе детей, умерших в период первой презентации заболевания - 60,00% и 35,00% , соответственно, по сравнению с соответствующими частотами в группе детей, достигших стойкой ремиссии (31,58%) и 22,37%) (р 0,05).
Литературные данные по распределению полиморфизмов генов TNF и LTA при гемобластозах ограничены. Stanulla М. et al., 2001 в своей работе не обнаружили ассоциации -308TNF и +252LTA полиморфизмов с риском развития рецидива ОЛЛ у детей [Stanulla М. et al., 2001]. Zhao Н. et al., 2003 в своей работе также показали, что -308TNF и +252LTA полиморфизмы не играют роли в патогенезе, течении и исходе ОЛЛ [Zhao Н. et al., 2003]. Хотя в работе Warzocha К. et al. 1998 было показано, что TNF A и LTA G аллели ассоциируются с повышенным уровнем TNF в плазме крови у пациентов с НХЛ в период презентации заболевания [Warzocha К. et al., 1998]. Анализ ассоциации» комбинаций генотипов по локусам TNF и LTA показал отсутствие достоверных различий в распределении комбинаций генотипов между изученными группами. Гаплотипы высокого риска, характеризующиеся присутствием двух и более аллелей, ассоциированных с повышенным уровнем экспрессии генов, в группе больных ГБ выявлены с частотой 24,17% по сравнению с 25,37% в контроле (р 0,05).
Как показано в исследовании Warzocha К. et al., 1998 TNF G аллель и LTA A аллель находятся в неравновесии по сцеплению, утверждение справедливо также и для TNF A и LTA G аллелей [Warzocha К. et al., 1998].
При анализе характера сцепления между аллелями генов TNF и LTA, различий между группой больных ГБ и контролем обнаружено не было (58,33%) против 50,74%о, соответственно). Полученные нами результаты согласуются с данными Takeuchi S. et al., 2002 [Takeuchi S. et al., 2002]. Авторы не обнаружили статистически значимых различий между гаплотипами высоко и низкого риска и клиническими характеристиками, такими как количество лейкоцитов во время презентации заболевания, иммунофенотипом бластных клеток, нейролейкемией и ответом на проводимую химиотерапию. В работе Warzocha К. et al., 1998 было показано, что у пациентов с НХЛ гаплотипы высокого риска генов TNF и LTA ассоциированы с неблагоприятным прогнозом терапии заболевания, коротким безрецидивным периодом и повышенным уровнем общей смертности больных) [Warzocha К. et al., 1998].
Поскольку различия, полученные в результате нашего исследования, не достигают статистически значимых значений, вероятно, что полиморфные варианты генов TNF и LTA не ассоциированы с риском развития и эффективностью терапии ГБ у детей. Однако нами показана ассоциация TNF GA-reHOTHna с В-клеточными ГБ (Х =6,63; р=0,01), также выявлена тенденция к повышению LTA GG генотипа у детей с ОЛЛ (р=0,06).
Оценка степени метилирования генов-супрессоров опухолевого роста р15 и ріб у больных гемобластозами
В последние годы во всем мире наблюдается рост заболеваемости злокачественными новообразованиями. В Республике Башкортостан заболеваемость ЗНО составляет 12,3 на 100 000 населения [Трапезников Н.Н. и др., 2001].
Гемобластозы - группа злокачественных новообразований клеток системы кроветворения. ГБ относятся к наиболее распространенным онкологическим заболеваниям в детском возрасте, на долю которых приходится 45% всей онкопатологии в возрастной группе до 14 лет.
Известно, что канцерогенез является результатом действия многих генов, так называемой, генной сети, в которой онкогенам и генам-супрессорам опухолевого роста отводится главная роль, а другим генам, в том числе генам детоксикации и генам цитокинов - роль модификаторов функции главных генов [Баранов B.C. и др., 2000; Владимирская Е.Б., 2001; Назаров П.Г., 2001].
Поэтому актуальным представляется изучение вклада многокомпонентной системы детоксикации ксенобиотиков, генов цитокинов и супрессоров опухолевого роста на предрасположенность к развитию, тяжесть течения и индивидуальную чувствительность к применяемым цитостатическим препаратам.
Цель настоящего исследования заключалась в выявлении клинико-генетических ассоциаций генов детоксикации ксенобиотиков, супрессоров опухолевого роста и цитокинов при гемобластозах у детей и определении их значимости в оценке риска развития и прогноза течения заболевания.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи: оценить клинико-гематологические особенности и показатель выживаемости при гемобластозах у детей в Республике Башкортостан, определить частоту аллельных и генотипических вариантов генов системы детоксикации ксенобиотиков, цитокинов и частоту метилирования генов-супрессоров
123 опухолевого роста при гемобластозах у детей, выявить протективные генотипы и генотипы повышенного риска развития гемобластозов в детском возрасте, установить генотипы, ассоциированные с неблагоприятным исходом гемобластозов у детей и разработать подходы к оценке риска и прогноза течения гемобластозов у детей.
Материалом исследования служили образцы ДНК, полученные от 120 детей больных гемобластозами, в возрасте от нескольких месяцев до 15 лет, находившихся на стационарном лечении в онкогематологическом отделении Республиканской детской клинической больницы г. Уфы в период с 2001 года по 2003 год. Группу сравнения составили 226 доноров, проживающих на территории РБ, подобранных по полу и этнической принадлежности.
Диагноз подтверждался морфологическим, цитохимическим, иммунофенотипическим исследованием костного мозга, гистологическим анализом трепанобиоптата крыла подвздошной кости, диагноз нейролейкоза устанавливался на основании морфологического исследования спинномозговой жидкости.
ДНК выделяли из лимфоцитов периферической венозной крови методом фенольно-хлороформной экстракции [Mathew С.С, 1984]. Анализ полиморфных вариантов генов проводили методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК и рестрикционного анализа. Метилирование CpG-островков генов р15 и р16 определяли с помощью метилчувствительной ПЦР.
На основании полученных результатов, можно заключить, что в Республике Башкортостан в структуре гемобластозов у детей преобладают острые лимфобластные лейкозы (80,00%), реже встречаются острые миелобластные лейкозы (10,83%) и неходжкинские лимфомы (9,17%). На долю В-клеточных гемобластозов приходится 71,43%, Т-линейный вариант заболевания диагностируется в 28,57% случаев. На основании этого можно заключить, что на территории РБ повышена частота случаев Т-клеточных лейкозов, что является региональной особенностью края. Высокая частота
124 отсроченной диагностики (более 1 месяца с начала заболевания) может свидетельствовать о низком уровне «онкологической настороженности» врачей общего профиля. Среди клинических признаков развернутой стадии заболевания выявлено преобладание симптомов общей интоксикации, лимфопролиферативного и геморрагического синдромов.
Лейкозное поражение нервной системы (нейролейкоз) диагностировано в 19,16%. Анализ количества лейкоцитов периферической крови показал, что у 17,86% случаев дебют заболевания характеризовался лейкопенией, в 36,6% отмечался гиперлейкоцитоз, в том числе в 10,71%) количество лейкоцитов в период развернутой стадии заболевания превышало 100x107л. В 66,97% случаев в развернутой стадии заболевания определялось наличие бластных клеток в периферической крови, в 33,03%) диагностирован алейкемический вариант картины периферической крови.
Анализ клеточного состава костного мозга в развернутой стадии заболевания показал, что в группе обследованных больных в преобладающем большинстве случаев в миелограмме обнаружено более 80% бластных клеток -(86,67%)) и только в 2,50%о в пунктате костного мозга определено менее 50% бластных клеток.
Анализ общей выживаемости, проведенный с использованием метода множительных оценок Каплана-Мейера, показал, что при остром лимфобластном лейкозе общая двухлетняя выживаемость составляет 78,84±4,71% , четырехлетняя выживаемость равна 58,82±7,32% . При остром миелобластном лейкозе общая выживаемость за 12 месяцев составляет 37,50±14,07% , при неходжкинских лимфомах общая выживаемость за 15 месяцев наблюдения составляет 61,54±16,64% .
