Клинические значение динамического определения уровня вируснойнагрузки у больных с различными вариантами хронической HBV - инфекции. Шутько Светлана Анатольевна

Содержание к диссертации

Введение

Часть 1. Обзор литературы 9 стр.

1.1. Вводная часть 9 стр.

1.2. Молекулярная биология и репликация вируса гепатита В 14 стр.

1.3. Естественное течение хронической HBV-инфекции 18 стр.

1.4. Лабораторная и инструментальная диагностика вирусного гепатита В 24 стр.

1.5. Влияние генотипа, уровня виремии HBV на течение и исходы вирусного гепатита В 33 стр.

1.6. Значение уровня виремии ДНК HBV в отборе кандидатов для противовирусного лечения и эволюция клинических рекомендаций

2004-2009гг 40 стр.

Часть 2. Собственные исследования 51 стр.

Глава 1. Материалы и методы 51 стр.

Глава 2. Результаты исследования 60 стр.

2.1 . Клиническая характеристика пациентов с хронической HBV- моноинфекцией 60 стр.

2.1.1. Неактивные носители вируса гепатита В 66 стр.

2.1.2. Характеристика пациентов с хроническим гепатитом В 69 стр.

2.1.2.1. Группа пациентов с хроническим гепатитом В, обследованных однократно 71 стр.

2.1.2.2. Группа пациентов с хроническим гепатитом В, обследованных двукратно 75 стр.

2.1.2.3. Группа пациентов с хроническим гепатитом В, обследованных трёхкратно 79 стр.

2.1.2.4. Результаты исследования морфологии печени у больных хроническим гепатитом В 87 стр.

2.1.2.5. Характеристика больных ХГВ, признанных кандидатами для назначения противовирусной терапии по данным трехкратного динамического обследования 91 стр.

2.1.3. Характеристика больных ХГВ с развитием неблагоприятных исходов 95 стр.

2.1.4. Клинические примеры 100 стр.

Глава 3. Обсуждение полученных результатов 111 стр.

Выводы 128 стр.

Практические рекомендации 130 стр.

Список использованной литературы

• Молекулярная биология и репликация вируса гепатита В
• Естественное течение хронической HBV-инфекции
• Клиническая характеристика пациентов с хронической HBV- моноинфекцией
• Группа пациентов с хроническим гепатитом В, обследованных однократно

Введение к работе

Актуальность проблемы.

Вирус гепатита В остается одним из основных этиологических факторов развития хронических заболеваний печени, в том числе, хронического гепатита, цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы. Актуальность изучения вирусного гепатита В связана с повсеместным его распространением, а также, преимущественно, с поражением лиц молодого возраста. В России, по-прежнему, несмотря на снижение заболеваемости острым гепатитом В высока частота регистрации хронического гепатита В, микст-инфекций вирусными гепатитами В, С, D.

На сегодняшний день среди существующих качественных и количественных методов определения ДНК вируса гепатита В в крови большое значение уделяется количественным методам генодиагностики. Среди методов генодиагностики наиболее широко для выявления вируса гепатита В используют метод амплификации матрицы (метод ПЦР) и метод амплификации сигнала (метод разветвленных цепей ДНК (b-DNA)) [5, 54]. В настоящее время определение уровня вирусной нагрузки HBV в крови с помощью генетических методов диагностики является одним из критериев для назначения противовирусной терапии больным хроническим вирусным гепатитом В.

За последние 5 лет в результате нескольких крупномасштабных проспективных исследований были получены данные о связи высокого уровня вирусной нагрузки (УВН) с развитием цирроза печени HBV-этиологии, гепатоцеллюлярной карциномы [27,81 ,130], а также показана связь уровня вирусной нагрузки со степенью выраженности некрозо-воспалительных изменений в ткани печени. Однако, большинство исследователей не выявило корреляции уровня вирусной нагрузки со стадией фиброза печени, что обосновывает необходимость дальнейшего изучения патогенетической связи активности репликации HBV и характером поражения печени.

Известно, что пациенты с хроническим вирусным гепатитом В лишь в 30-40% случаев, по данным разных авторов, отвечают на противовирусную терапию, а также, что в течение полугода после прекращения противовирусного лечения у 10-50% пациентов отмечается повышение ферментативной активности и определяется ДНК HBV в крови [84].

В настоящее время в России не разработаны рекомендации по тактике ведения пациентов с различными вариантами течения хронического гепатита В с учётом вирусной нагрузки. В связи с этим, наше исследование посвящено изучению динамики уровня вирусной нагрузки HBV в крови у больных с различными вариантами хронической HBV-инфекции в течение заболевания для выявления неактивных носителей HBsAg и кандидатов для назначения противовирусной терапии.

Цель исследования.

Цель настоящего исследования - оценка клинического значения уровня вирусной нагрузки при динамическом обследовании пациентов с хронической HBV-моноинфекцией для отбора кандидатов на противовирусную терапию и выявления доли «неактивных носителей» вируса гепатита В в популяции HBsAg-позитивных пациентов.

Задачи исследования:

1. определить соотношение больных ХГВ с постоянно высоким (>10⁵ копий/мл), волнообразным (10 -10 копий/ мл) и постоянно низким (<10³-10⁴ копий/ мл) УВН HBV в крови среди больных хронической HBV-моноинфекцией в целом и среди больных с прогрессирующим течением ХГВ;

2. сопоставить долю лиц с постоянно высокой вирусной нагрузкой среди больных ХГВ с повышенным (более 1,5N) и нормальным уровнем (менее 1,5N) АлАТ в крови при динамическом трехкратном обследовании с интервалом 6 месяцев;

3. оценить степень корреляции между уровнем активности АлАТ и уровнем вирусной нагрузки HBV в крови у больных хронической HBV-инфекцией;

4. выделить группу пациентов с показателями, удовлетворяющими критериям «неактивного носительства» вируса гепатита В среди больных хронической HBV-инфекцией;

5. оценить частоту HBeAg-позитивного хронического гепатита В и частоту HBeAg-сероконверсии в общей популяции пациентов с хронической HBV-моноинфекцией при динамическом наблюдении в течение 1,5-2 лет;

6. определить долю «абсолютных кандидатов» для назначения ПВТ среди пациентов с HBeAg-негативным и HBeAg-позитивным хроническим гепатитом В по результатам комплексного обследования, включающего уровень виремии и активность АлАТ с учетом данных морфологического исследования ткани печени.

Научная новизна исследования.

Впервые было установлено соотношение вариантов течения хронической HBV-моноинфекции в соответствии с динамическими показателями уровня виремии HBV в московской популяции, как среди группы больных хронической HBV-инфекции в целом, так и среди больных ХГВ со строгими показаниями к противовирусной терапии, в частности.

Впервые была установлена доля «неактивных носителей» вируса гепатита В в популяции пациентов с хронической HBV-моноинфекцией по результатам динамического комплексного обследования на протяжении 1,5-2 лет.

Впервые на основе комплексного динамического наблюдения больных хронической HBV-инфекцией показано, что группа больных ХГВ со строгими показаниями к лечению по данным морфологического

исследования биптата печени может иметь различные диапазоны колебания уровня виремии и АлАТ.

Практическая значимость работы.

Впервые была показана целесообразность динамического двукратного обследования больных хронической HBV-инфекцией с интервалом в 6 месяцев после получения первичного отрицательного результата на наличие ДНК HBV в крови для верификации диагноза «неактивное носительство» вируса гепатита В.

При наблюдении больных НВе-позитивным гепатитом В с постоянно высоким уровнем виремии и нормальной активностью АлАТ в крови дифференцировать хронический активный гепатит от иммунотолерантной фазы можно только по результатам морфологического исследования ткани печени.

Впервые установлено, что только комплексное обследование пациента (включающее динамику уровня виремии, активности АлАТ в крови и морфологическое исследование ткани печени) позволяет определить показания к противовирусной терапии и не позволяет необоснованно назначить противовирусное лечение, что обеспечит оптимизацию экономических затрат на лечение и наблюдение больных ХГВ.

Апробация диссертации.

Материалы диссертации доложены на: заседании кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии «МГМСУ Росздрава», VI научно-практической конференции «Инфекционные болезни и антимикробные средства» (Москва, 2008 год), на XXXI итоговой конференции молодых ученых «МГМСУ Росздрава» (25 марта 2009 г.).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ, в том числе 2 в журнале, рекомендованном ВАК РФ.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 144 листах машинописного текста, включает в себя введение, обзор литературы, несколько глав собственных исследований, обсуждения и выводы. Работа проиллюстрирована 41 таблицей и 7 рисунками. Обзор литературы составлен на основании анализа 11 источников на русском языке и 127 - на иностранном.

Часть I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. 1.1. Вводная часть.

Хронический гепатит В - хроническое воспалительное заболевание печени, обусловленное персистенцией в организме человека вируса гепатита В (HBV) в течение 6 и более месяцев. В мире, по данным ВОЗ, примерно 370-400 миллионов человек являются носителями вируса гепатита В и около миллиона ежегодно умирают от заболеваний, связанных с вирусным гепатитом В. Актуальность детального изучения особенностей течения острого и хронического гепатита В связывают с широким распространением HBV-инфекции, многообразием клинических форм, значительной частотой неблагоприятных исходов при формировании хронического гепатита, большим экономическим ущербом. В России за последние 15 лет происходили существенные изменения в динамике заболеваемости острым гепатитом В. В 1992 году заболеваемость составляла 18 на 100 тыс. населения, однако, в связи с увеличением доли лиц, использующих внутривенное введение наркотиков, происходил систематический рост заболеваемости и в 1999-2000 гг. она достигла пика (42,5 - 43,8 на 100 тыс.). Только с 2001 года уровень заболеваемости впервые снизился на 7% и составлял уже 35,3, в 2002 году — 19,8 и к 2003-2004 гг. снизился до 13,1 -14,9 на 100 тыс. населения. В 2005 году заболеваемость острым гепатитом В регистрировалась уже на уровне 8,56 на 100 тыс. населения, в 2006 году составляла 7,03 на 100 тыс. населения, 2007 год - менее 4 на 100 тысяч населения. Ежегодно доля лиц в возрасте 15-29 лет составляет 60-85% от общего числа больных острым гепатитом В, что связано с распространенностью инъекционной наркомании и рискованного сексуального поведения без применения барьерных методов контрацепции. Снижение заболеваемости острым гепатитом В в России за последние 5 лет, безусловно, связано с интенсификацией профилактических мер и введением в национальный календарь профилактических прививок обязательной вакцинации против гепатита В в соответствии с приказом Минздрава России от 27.06.2001 №229 «О

национальном календаре профилактических прививок и календаре профилактических прививок по эпидемическим показаниям».

Однако, эпидемиологическая ситуация на территории России по заболеваемости вирусным гепатитом В продолжает оставаться сложной, т.к. несмотря на снижение абсолютного числа вновь выявляемых случаев острого гепатита В стабильно высокими остаются показатели заболеваемости хроническими вирусными гепатитами. Абсолютные цифры и случаи на 100 тыс. населения за последние годы составляли: 2006 - 73871 (51,62 на 100 тыс.), 2007 г. - 74872 (52,55 на 100 тыс.). Необходимо учитывать, что отдельно регистрируются такие показатели, как впервые выявленный хронический гепатит и носительство вируса гепатита В. В 2006г в России зарегистрировано 20049 случаев (14 на 100 тыс. населения) вновь выявленного хронического гепатита В и 68241 (47,68 на 100 тыс.) носителей вируса гепатита В. В 2007г эти показатели составили 19953 (14 на ЮОтыс) и 60761 (42,66 на 100 тыс.), соответственно. Статистические показатели демонстрируют, что количество носителей вируса в 3-4 раза превышает количество больных хроническим гепатитом В, что говорит о недостаточном уровне диагностики, так как известно, что у большинства лиц с носительством вируса гепатита В при детальном обследовании выявляется хронический гепатит той или иной степени активности. Приведенные данные показывают, что необходимо внедрять в практическое здравоохранение четкие критерии диагноза хронического гепатита В и обновлять практические рекомендации для врачей по тактике обследования пациентов с хронической HBV-инфекцией. В ближайшие 5-10 лет возможен рост заболеваемости не только хроническим гепатитом В (как в виде моноинфекции, так и в виде микст-инфекции с вирусными гепатитами С, Д и ВИЧ-инфекцией), но и циррозом печени HBV-этиологии. Это обусловлено высокой заболеваемостью острыми вирусными гепатитами в 90-е годы и формированием хронической HBV-инфекции у значительной группы пациентов, перенесших вирусный гепатит В 10-15 лет назад.

Вирусный гепатит В представляет угрозу для здоровья населения всего мира. Это обусловлено повсеместным распространением, возможным развитием хронического гепатита В (включая бессимптомное течение у части пациентов), а также возможным прогрессированием заболевания до цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) с риском летальных исходов как от острых, так и от хронических форм инфекции [3, 117]. Среди пациентов с наличием маркеров инфицирования вирусом гепатита В также существует группа со скрытой HBV-инфекцией, которая еще недостаточно изучена [63].

Распространенность в мире HBV-инфекции на протяжении многих десятилетий стабильно неравномерна. В мире можно выделить 3 зоны с различной широтой распространения HBV-инфекции, показателями которой служит частота выявление таких маркёров как HBsAg и анти-HBcore IgG. Выделяют регионы с низкой частотой носительства HBsAg (менее 2% населения - Северная, Западная, Центральная Европа, Австралия, Северная Америка - США, Канада), со средней (от 2 до 8% населения - Южная и Восточная Европа, Япония, Юго-Запаадная Азия, Южная и Центральная Америка, Россия и др.) и высокой (от 8 до 20% населения - Юго-Восточная Азия, Азиатско-Тихоокеанский регион, Центральная, тропическая Африка и др.) [1,9, 36].

По данным ВОЗ, около 2 миллионов людей в мире имеют маркеры перенесенной инфекции. Ежегодно около 50 млн. человек в мире заболевают острым гепатитом В, а 300-400 (5-6%) миллионов человек в настоящее время больны хроническим гепатитом В различной степени активности, включая небольшую долю пациентов с неактивным носительством HBV с сохраняющимся риском реактивации инфекционного процесса и переходом в категорию больных хроническим гепатитом. От 25% до 40% (0,5- 1,2 миллиона в год) лиц с хроническим вирусным гепатитом В умирают от цирроза печени или гепатоцеллюлярной карциномы [104]. HBV-инфекция (в том числе, бессимптомная и без лабораторных признаков активности)

является фактором риска развития ГЦК в любом возрасте. Истинная распространенность HBV-инфекции превышает регистрируемую заболеваемость из-за возможности бессимптомного течения хронического гепатита [128].

Исходы острой HBV-инфекции зависят от работы иммунной системы пациента, а также возраста на момент инфицирования. Инфицирование в раннем возрасте остается основным фактором риска развития хронической HBV-инфекции. Дети, рожденные HBV-инфицированными женщинами, с 90% вероятностью становятся хроническими вирусоносителями в результате перинатального инфицирования. В дошкольном возрасте эта цифра снижается до 30%. В большинстве случаев острый вирусный гепатит В (ОВГВ) у взрослых в 90-95% заканчивается выздоровлением. В среднем, у 1% больных ОВГВ, по данным разных авторов, развивается фульминантная печеночная недостаточность, при этом в условиях отсутствия ортотопической трансплантации печени летальность достигает 80%. Известно, что фульминантный гепатит встречается чаще у лиц, инфицированных мутантными штаммами HBV и у лиц с микст-инфекцией (HBV+HDV, HBV+HCV) [1, 3, 23, 93, 120,136].

Благодаря эффективности профилактической вакцинации, использованию одноразового медицинского инструментария, тестированию крови на наличие маркёров HBV, наблюдается тенденция к снижению заболеваемости вирусным гепатитом В. Однако, до сих пор не во всех регионах мира внедрены программы по вакцинации против HBV, в результате чего остаются резервуары инфекции и распространение вируса продолжается.

Современной эпидемиологической особенностью гепатита В является активизация полового пути передачи и изменение возрастного состава заболевших: общее число больных приходится на долю лиц в возрасте 15-19 и 20-29 лет. Уровень заболеваемости в этих возрастных группах населения достигает 300-500 на 100 тыс. населения [9].

Известно, что у взрослых в 5-10-% случаев не происходит выздоровление от острого гепатита В и формируется хроническая HBV-инфекция, которая может протекать в различных клинико-иммунологических вариантах: хронический НВе-позитивный вирусный гепатит В; хронический НВе-негативный вирусный гепатит В; неактивное носительство вируса гепатита В.

1.2.Молекулярная биология и репликация вируса гепатита В.

Молекулярная биология вируса гепатита В. Вирус гепатита В - наименьший из всех существующих на сегодняшний день ДНК содержащих вирусов. Вирус гепатита В относится к семейству Hepadnaviridae, роду Orthohepadnavirus. Морфологически вирус гепатита В представляет собой сложную сферическую частицу (частица Дейна) диаметром 40-48 нм. Частица имеет внешнюю оболочку, которая состоит из поверхностного антигена (HBsAg), расположенного в липидном слое. Внутри оболочки размещается нуклеокапсид или ядро (core) диаметром 27 нм. В капсиде упакованы нуклеопротеиновый комплекс генома с вирусной ДНК-полимеразой, обратной транскриптазой. Нуклеокапсид HBV содержит антиген сердцевины, иммунологически идентифицируемые как соге-белок (HBcAg), [38] секретируемую растворимую часть HBcAg — так называемый «маркёр инфекционности» - (HBeAg); недостаточно изученный HBxAg; ДНК и ферменты - ДНК-полимеразу и протеинкиназу. Геном вируса гепатита В, состоящий из 3200 пар нуклеотидов (от 3020 до 3320), представлен кольцевой, частично двуцепочечной ДНК. Молекула ДНК состоит из полной, длинной минус-цепи, которая в своей двунитевой части на 5'-конце ковалентно связана с вирусной полимеразой (белковой молекулой нуклеокомплекса), и неполной, короткой плюс-цепи, на 5"-конце закреплен короткий РНК-олигомер. Кольцевая структура генома получатся благодаря спариванию комплементарных оснований нуклеотидов двух цепей. Короткая

плюс-цепь ДНК составляет 50-80% от длины минус-цепи. Размер плюс-цепи составляет от 1700 до 2800 нуклеотидов [74].

На рисунке 1 представлена геномная организация вируса гепатита В. Рисунокі. Геномная организация вируса гепатита В [13].

Геном HBV состоит из четырех генов:

S-ген - кодирует 226 аминокислотных остатков основного структурного белка оболочки - HBsAg. Состоит из трех зон Pre-Sl, Pre-S2 и S, кодируют три белка, составляющих наружную оболочку HBV: главный (малый SHBsAg - small HBsAg), средний (MHBsAg - middle HBsAg) и большой (LHBsAg-large HBsAg). В оболочке HBV HBsAg представлен комплексом всех трех белков, находящихся в соотношении 1:1:4. Каждый вирион содержит 300-400 молекул основного белка и по 40-80 молекул среднего и большого белков внешней оболочки. Белок Pre-S 1 прикрепляется к рецептору IgA на поверхности гепатоцита и способствует проникновению HBV в гепатоцит, белок Pre-S2 обеспечивает связь с поверхностным полимеризированным альбуминовым рецептором гепатоцита [59,52,117].

С-ген- - состоит из 183-185 аминокислотных остатка, кодирует негликозилированный белок нуклеокапсида (HBcAg), состоящий из

гидрофильных и заряженных аминокислот. Данный белок обладает способностью к самосборке в core-частицы, в которые по завершению цикла репликации упакована ДНК HBV. Core- ген состоит из Рге-Соге зоны, несущей информацию о секреторной форме HBcAg — HBeAg. Высокие титры HBeAg соответствуют высокой ДНК-полимеразной активности и всегда сочетаются с обнаружением полных частиц Дейна. Наличие HBeAg в крови говорит об активной репликации вируса. HBeAg не является структурным компонентом вируса. Мутации в Рге-Соге зоне приводят к снижению или полному прекращению продукции HBeAg [131].

Ген-Р - кодирует самую длинную последовательность, состоящую из 832-850 аминокислотных остатков, специфической ДНК-полимеразы, обратной транскриптазы, энхансера І. Ген Р перекрывает около 80% генома. ДНК - полимераза выполняет функцию обратной, поэтому HBV называют псевдоретровирусом. Клиническое значение мутации в Р-гене ДНК HBV, прежде всего, связано с резистентностью к лечению аналогами нуклеозидов хронического гепатита В [66].

Ген-Х - кодирует белок с небольшой молекулярной массой, состоящий из 154 аминокислотных остатков. До настоящего времени функции этого белка до конца не ясны. Вероятно, HBxAg является многофункциональным белком, принимающим участие в репликации вируса и во взаимодействии вируса с макроорганизмом. Установлено, что белок X играет также определенную роль в канцерогенезе и развитии первичного рака печени, активизирует репликацию других вирусов, в частности ВИЧ, что определяет ухудшение клинического течения у лиц с коинфекцией - гепатит В и ВИЧ-инфекция [11,16,133].

Репликация вируса гепатита В.

HBV, попадая в кровь, мигрирует в печень. Репликация HBV происходит, преимущественно, в клетках печени, однако, возможна и внепеченочная репликация вируса, но с меньшей интенсивностью (в лимфоцитах, мононуклеарах, клетках поджелудочной железы, почках,

селезенке, надпочечниках, коже, клетках центральной нервной системы).

При инфицировании HBV в гепатоцитах протекают параллельно два процесса: репликация вируса с экспрессией вирусных антигенов на поверхности гепатоцита, сборка и размножение новых вирионов, которые покидают клетку без ее разрушения; иммунно-опосредованное повреждение гепатоцитов. Цитолиз гепатоцитов при HBV-инфекции обусловлен не действием самого вируса, а факторами клеточного иммунитета, т.е., повреждение печени обусловлено иммунологическими реакциями макроорганизма, направленными против HBV-инфицированных клеток печени.

Адсорбция вируса к поверхности гепатоцита, происходит за счет рецепторов LHBsAg и клеточной мембраны гепатоцитов. После прикреплении вируса на поверхности гепатоцита происходит разрушение наружной оболочки вирусной частицы и нуклеокапсид проникает внутрь печеночной клетки и транспортирует ДНК HBV к ядру гепатоцита. В цитоплазме под действием ДНК-полимеразы происходит достройка одноцепочечного участка короткой плюс-цепи ДНК HBV, и к ядру «подходит» нуклеокапсид с полной 2-х цепочной ДНК. На поверхности ядерной мембраны происходит деструкция нуклеокапсида и проникновение ДНК HBV в ядро клетки. В ядре гепатоцита геном HBV под действием ферментов ядра трансформируется в ковалентно-замкнутую кольцевую ДНК (сссДНК), которая в дальнейшем служит матрицей для синтеза новых вирусных частиц. сссДНК служит матрицей для мРНК, образуется 4 копии мРНК различной длины, самая крупная - прегеномная РНК, которая отвечает за синтез HBeAg, HBcAg, ДНК-полимеразы. Кроме прегеномной РНК, в ядре происходит транскрипция коротких мРНК длиной 2,4; 2,1 и 0,7 тыс. нуклеотидов для обеспечения синтеза HBsAg в цитоплазме. Во временном капсиде, образованном под действием ДНК-полимеразы происходит обратная транскрипция мРНК с образованием минус-цепи ДНК. Затем минус-цепь выступает в роли матрицы для синтеза плюс-цепи, в результате

чего образуется частично 2-х цепочная ДНК. В области эндоплазматического ретикулума клетки нуклеокапсид нового упаковывается в наружную оболочку (HBsAg), образуя новые вирионы HBV. Окончательно собранный вирион транспортируется через мембрану и выходит из клетки [17,21,100].

1.3. Естественное течение хронической HBV-инфекции.

Хроническая HBV-инфекция характеризуется широким спектром клинических вариантов течения и исходов заболевания, что во многом определено взаимоотношениями иммунной системы организма и вируса.

Исследования по длительному наблюдению естественного течения хронического гепатита В показали, что после установления диагноза кумулятивная частота развития цирроза печени в течение ближайших 5 лет составляет от 8% до 20%, декомпенсация цирроза печени в последующие 5 лет — 20%, а вероятность выживаемости больного компенсированным циррозом печени в течение 5 лет — 80-86%. У пациентов с декомпенсированным циррозом печени прогноз выживаемости в течение 5 лет крайне неблагоприятен и составляет 14-35%. Ежегодная заболеваемость гепатоцеллюлярной карциномой у больных с установленным диагнозом цирроза печени в исходе хронического гепатита В составляет 2-5% и различна в ряде географических районов [43,44].

В ходе естественного течения хронической HBV-инфекции выделяют несколько фаз необязательно последовательно сменяющих друг друга. Фазы заболевания характеризуются присутствием или отсутствием в крови больного HBeAg (НВе-позитивный и НВе-негативный варианты хронического гепатита В), степенью активности АлАТ и уровнем виремии, а так же гистологической картиной заболевания: фаза иммунной толерантности, иммунноактивная фаза, состояние неактивного носительства и фаза реактивации.

Фаза иммунной толерантности регистрируемая, как правило, у молодых, инфицированных в детстве людей и длящаяся, в среднем, до 20-30-

летнего возраста. У таких пациентов обнаруживаются HBeAg, HBsAg и высокий уровень ДНК HBV в сыворотке крови. При этом отсутствуют клинические симптомы заболевания, сохраняется нормальная активность АлАТ, минимальная гистологическая активность [61, 24, 83].

Фаза иммунной толерантности, переходит в иммунноактивную фазу хронического НВе-позитивного гепатита В, который, в свою очередь, может развиваться по трем сценариям.

Первый - спонтанная сероконверсия, регистрируемая у 25-50% пациентов до 40 лет и переход инфекционного процесса в фазу неактивного носительства вируса гепатита В.

Второй - продолжающееся течение хронического НВе-позитивного гепатита с высоким риском развития цирроза печени.

Третий - трансформация НВе-позитивного гепатита В в НВе-негативный хронический гепатит В вследствие развития мутаций в зоне core HBV, последующего прекращения продукции «классического HBeAg», постепенного увеличение в популяции мутантных форм HBV с последующим полным преобладанием данного варианта вируса [107].

Соответственно фазам течения хронической HBV-инфекции, формулируется диагноз у пациента в конкретный момент времени, однако необходимо учитывать, что одна фаза заболевания может переходить в другую.

В таблице №1 представлены опорные лабораторные и морфологические характеристики, позволяющие диагностировать фазу течения хронической HBV-инфекции и вариант хронического гепатита В.

Таблица №1.

Лабораторные показатели и морфологическая характеристика хронической HBV-инфекции в зависимости от фазы течения заболевания и

НВе-статуса пациента.

Критерии диагноза при наличии у пациента хронической HBV-инфекции. Согласно современным представлениям:

критериями бессимптомного носительства вируса гепатита В

является сочетание ряда признаков: персистенция HBsAg в течение 6 месяцев и более при отсутствие серологических маркеров репликации

HBV (HBeAg, анти-НВсоге IgM), нормальные показатели печеночных трансаминаз, отсутствие гистологических изменений в печени или картина хронического гепатита с минимальной некрозо-воспалительной активностью (ИГА 0-3) и уровень ДНК HBV <10⁴ копий/мл);

критериями хронического гепатита В являются три основных показателя: морфология печени (индекс гистологической активности 4 и более баллов по Knodell), уровень АлАТ более нормы или волнообразно повышенный, уровень вирусной нагрузки от 10⁴ копий/мл и выше;

критериями наличия цирроза печени в исходе ХГВ является морфологическая характеристика биоптата печени (фиброз 4 стадии) или клинико-лабораторная картина цирроза печени (наличие вторичных печеночных знаков, тромбоцитопения, активность АсАТ превышающая АлАТ, снижение альбумина крови менее нормы), наличие портальной гипертензии, подтвержденной данными УЗИ (расширение портальной или селезеночной вены) и ЭГДС (варикозное расширение вен пищевода) [39,86].

Внесение уровня вирусной нагрузки HBV в критерии диагноза у больных
хронической HBV-инфекцией обусловлено многочисленными

исследованиями, продемонстрировавшими, что, как правило, низкий уровень виремии коррелирует с нормальными или незначительно измененными показателями гистологии печени и, напротив, у пациентов с уровнем виремии >10⁴ копий/мл редко регистрируется гепатит минимальной активности, как необходимое условие диагноза «неактивное носительство HBV». Примером таких исследований может служить работа Zacharakis GH. с соавторами (2005 г.) по долгосрочному наблюдению HBsAg-позитивных лиц в популяции северной Греции. Под наблюдением находилось 263 пациента в возрасте от 20 до 65 лет (средний возраст — 34 года) в течение 2-12 лет (в среднем, 5 лет). Биопсия печени выполнялась в начале

исследования и затем каждые 2-4 года. Уровень виремии определялся каждые 12 месяцев, а активность АлАТ каждые 6 месяцев. HBeAg-негативные пациенты составляли 94,7%. Неактивные носители HBsAg составили 50,3% пациентов исследуемой когорты, средний уровень виремии в данной группе - 2.6 х 10 копий/мл. У 97% неактивных носителей HBsAg, у которых по результатам биопсии печени отсутствовали или были минимальными гистологические изменения, сохранялись постоянно нормальные показатели АлАТ, уровень вирусной нагрузки регистрировался ниже 10⁴ копий/мл, на протяжении всего периода наблюдения (от 4 до 12 лет). У 2% неактивных носителей HBsAg регистрировалась реактивация процесса (у всех уровень виремии был 10 копий/мл перед включением в исследование) [138].

Как известно, сочетание ряда факторов — неопределяемый уровнь виремии, нормальные показатели АлАТ, а также минимальная активность гепатита, позволяет считать пациента неактивным носителем вируса гепатита В [39,84,86]

В исследовании Hsu Y S. et al. было показано, что для неактивных носителей HBsAg в отличие от пациентов с активной репликацией вируса гепатита В не характерно прогрессирующее поражение печени. В исследование было включено 283 неактивных носителя HBsAg. В течение 9 летнего периода наблюдения у 189 (67%) сохранялась постоянно нормальная активность трансаминаз в биохимическом анализе крови и лишь у одного пациента за этот период наблюдения сформировался цирроз печени. У 94 (33%) пациентов отмечено повышение уровня АлАТ больше двух норм, обусловленное у 4% пациентов реверсией анти-НВе/HBeAg, у 24% человек повышение уровня АлАТ обусловлено HBeAg-негативным ХГВ и у 5% пациентов причина была неясна [62].

Под воздействием иммуносупрессии пациент из статуса неактивного носительства HBsAg может перейти в фазу реактивации HBV-инфекции и в этом случае вновь будет диагностирован хронический НВе-негативный

гепатит В с высоким уровнем виремии, повышенной активностью АлАТ и гистологически подтвержденным активным гепатитом. В отдельных случаях возможна реверсия анти-HBe/HBeAg и диагноз больного будет вновь формулироваться как НВе-позитивный гепатит В.

В течении ХГВ возможно как спонтанное, так и обусловленное лечением прекращение продукции HBeAg и вслед за этим стойко регистрируемое наличие антител к HBeAg (анти-НВе), что диагностируется как «сероконверсия по HBeAg». Спонтанная или обусловленная лечением сероконверсия HBeAg/анти-НВе обычно приводит к снижению уровня ДНК HBV в крови до минимальных значений или даже до неопределяемого уровня (<60 МЕ/мл или <300 копий/мл), как у лиц, находившихся в иммунотолерантной фазе, так и у больных ХГВ, нормализации активности АлАт и АсАТ, значительному улучшению показателей гистологии ткани печени (если пациент находился иммунноактивной фазе НВе-позитивного гепатита В). Спонтанное прекращение активной репликации вируса, сопровождающееся сероконверсией по HBeAg, происходит с частотой 5-20% в год, преимущественно, у молодых людей до 30 лет [60,82,95, 114].

В исследовании, проведенном на территории Аляски, из 1536 пациентов, инфицированных в зрелом возрасте, у 70% наблюдалась спонтанная HBeAg сероконверсия в течение 10-летнего периода наблюдения [95].

Факторами, связанными с более высокой скоростью спонтанной сероконверсии являются возраст, высокие показатели аминотрансфераз, генотип вируса [35,68,78,137].

Для больных ХГВ, у которых не произошло HBeAg сероконверсии характерно течение хронического HBeAg-позитивного гепатита с высоким риском развития цирроза печени в 12%-20% случаев в течение 5 лет [37,43,76].

Исчезновение HBsAg и сероконверсия с наличием анти-HBs в крови может происходить спонтанно в 0,5 - 2% случаев в год в западных странах, и

гораздо реже - в странах Азии (0,1 - 0,8% случаев в год), обычно после нескольких лет постоянно отрицательного теста на наличие ДНК HBV в крови [12, 77].

1.4.Лабораторная и инструментальная диагностика вирусного

гепатита В.

Лабораторная диагностика вирусного гепатита В.

У пациентов с хронической HBV-инфекцией обязательным является определение активности сывороточных трансаминаз (АлАТ, АсАТ), уровень которых подвержен широким колебаниям. У пациентов с постоянно нормальным уровнем АлАТ менее выражены (минимальные) воспалительные изменения в биоптате печени, чем у пациентов с повышенным уровнем АлАТ. Известно, что пациенты с постоянно нормальным уровнем АлАТ хуже отвечают на противовирусную терапию и часто не рассматриваются как кандидаты на лечение. Однако, некоторые пациенты с нормальным уровнем АлАТ, высоким уровнем ДНК HBV в крови имеют выраженные некрозо-воспалительные изменения и фиброз по данным биопсии печени. В ряде работ, опубликованных в 2005 - 2006 гг., было показано, что у пациентов с постоянно нормальным уровнем АлАТ в крови в возрасте старше 40 - 45 лет в 12 - 43% по данным гистологического исследования ткани печени была стадия фиброза 2 и более [41,75,101].

Лабораторная серологическая диагностика гепатита В основана на определении маркеров HBV-инфекции с помощью иммуноферментного анализа. К использованию рекомендуются тест-системы, имеющие аналитическую чувствительность не ниже 0,1 нг/мл.

HBsAg является первым маркером, который появляется в крови при остром гепатите В, его обнаружение в крови более 6 месяцев говорит о хронической HBV- инфекции. Антитела к HBsAg являются маркером иммунного ответа и выздоровления. Уровень анти-HBs определяют для

оценки эффективности вакцинации гепатита В. Иногда HBsAg и анти-HBs одновременно обнаруживаются у пациентов с ХГВ.

С 2003 гогда в соответствии с национальными критериями чувствительности и специфичности для тест-систем, определяющих наличие HBsAg в крови, установлена чувствительность 0,1 МЕ/мл. Однако, в ряде случаев - коинфекция вирусов гепатита В и С, В и дельта-агента, В и ВИЧ, в инкубационный период, при скрытой форме хронического вирусного гепатита В, при наличии мутаций в вирусном геноме, концентрация HBsAg в крови может быть ниже этой величины. В связи с этим, была разработана тест-система « ДС-ИФА- HBsAg - 0,01», чувствительность которой превосходит регламентируемую в 10 раз, что составляет 0,01 МЕ/мл, преимуществом новой системы также является высокая специфичность (99,6 %) [4,7].

Анти-HBs - показатель перенесенной ранее инфекции или поствакцинального иммунитета.

HBeAg является маркером активной репликации, однако, отсутствие HBeAg в крови нельзя принимать как отсутствие репликации, т.к. HBeAg не обнаруживается у пациентов с HBeAg-негативной (рге-соге и соге-мутациями) HBV-инфекцией.

Наличие анти-НВе в крови указывает на HBeAg- сероконверсию, хотя они также обнаруживаются у пациентов HBeAg-негативной хронической HBV-инфекцией. Сероконверсия HBeAg/анти-НВе является конечной точкой противовирусной терапии пациентов с HBeAg-позитивным гепатитом В [41].

Анти-HBcore IgM - маркер острого процесса или косвенный показатель активной репликации вируса гепатита В при хронической форме инфекции.

Анти-HBcore суммарный - как правило, определяются при всех формах HBV-инфекции и только при поствакцинальном иммунитете их нельзя обнаружить.

Разработаны и внедрены в клиническую практику надежные молекулярно-биологические методы, в частности, ГЩР-исследование, позволяющее выявить ДНК HBV в крови, в ткани печени и в других тканях организма. Наличие ДНК вируса гепатита В в сыворотке крови, лимфоцитах, клетках печени указывает на репликацию HBV, являясь иногда единственным маркером в случае ее особой формы - скрытой HBV-инфекции [53, 115].

Индикация ДНК HBV также позволяет диагностировать гепатит, вызванный мутантными штаммами HBV, при которых не выявляются другие маркеры - НВе-антиген, HBs-антиген и т.д. Исследование крови на наличие антигенов и антител HBV в сочетании с молекулярно генетическими методами в динамике болезни позволяет не только констатировать наличие HBV-инфекции, но и различать острую инфекцию (HBsAg в сочетании с анти-НВс IgM) от хронической (HBsAg в сочетании с анти-НВс IgG), судить о выздоровлении и сформировавшемся протективном иммунитете (анти-HBs более 10 МЕ/л), регистрировать сероконверсию - НВе/анти-НВе), выявлять виремию (наличие ДНК HBV в крови), определять форму хронического гепатита В (НВе-негативный или НВе-позитивный), судить об эффективности проводимой терапии.

Первые сообщения о применении ДНК/ДНК-гибридизации

нуклеиновых кислот со специфическими зондами появились в середине 70-х годов и достаточно быстро вошли в практику диагностической лабораторной службы многих стран. Вместе с тем, на первых этапах широкое применение ДНК-зондов сдерживалось необходимостью использовать в работе фенол и другие токсические органические соединения, а также - радиоактивные материалы для детекции результатов [5].

В значительной степени эти проблемы были преодолены к началу 80-х годов и на рынке диагностических средств появились первые тест-системы, которые использовали методы нерадиоактивной детекции результатов, не требующие применения токсических органических соединений. Эти системы

обладают высокой специфичностью, хорошей воспроизводимостью, но относительно низкой чувствительностьюм- 10⁶-10⁷копий/мл [33].

Логическим развитием методов ДНК/ДНК гибридизации стали методики, суть которых состоит в амплификации (многократное умножение) сигнала. Методы выявления нуклеиновых кислот разделяются на две группы: основанные на амплификации сигнала и на амплификации участка-мишени ДНК. В целом, менее чувствительными, но более воспроизводимыми являются методы ампификации сигнала. Более чувствительными, но при этом более «капризными», являются методы амплификаци матрицы. Наиболее распространенным представителем первой группы является метод разветвленных цепей ДНК (b-DNA), вторую группу представляет полимеразная цепная реакция - ПЦР [54].

Метод b-DNA основан на серии гибридизационных реакций и хемилюминисцентной детекции гибридизованных зондов в 96-луночном планшете. Стенки лунок планшета покрыты зондами, комплементарными анализируемой нуклеиновой кислоте, которая специфически связывается с ними. Следующая серия комплементарых ДНК-зондов связывает анализируемую нуклеиновую кислоту с синтетическими молекулами разветвленной ДНК, каждая из которых несет повторяющиеся нуклеотидные последовательности для связывания с мечеными щелочной фосфотазой зондами, что приводит к последующему усилению сигнала [8].

В настоящее время ПЦР является далеко не единственным методом в перечне амплификационных технологий. Другими методами являются: SDA-амплификация со сдвигом цепи, NASBA-амплификация с использованием транскрипции, LCR-лигазной цепной реакции. Тем не менее, ПЦР остается наиболее распространенной и динамично развивающейся технологией. Метод ПЦР представляет собой многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического участка ДНК, ограниченного праймерами, катализируемое ферментом ДНК-зависимой ДНК-полимеразой [5, 122].

В 2006 г. Ozdarendeli A. et al. провели работу по сравнительной оценке 2-х методв b-DNA и ПЦР у больных HBeAg-позитивным ХГВ. В исследование было включено 67 пациентов с HBeAg-позитивным ХГВ. В результате исследования было показано, что фактически с одинаковой частотой выявлялась ДНК HBV в крови, как при использовании метода Ь-DNA, так и ПЦР. На основании полученных данных они пришли к выводу: целесообразно использование b-DNA исследования для обнаружения ДНК HBV в крови у пациентов с HBeAg-позитивным ХГВ и, лишь, при получении отрицательных результатов использовать ПЦР-метод [110].

В связи с высокой чувствительностью при использовании метода ПЦР высока возможность контаминации и, как следствие, появления ложноположительных результатов. На современном этапе для выявления ДНК HBV в крови наиболее перспективным является использование тест-систем на основе ПНР с детекцией сигнала в режиме реального времени (Real-time PCR). Такие тест — системы, как правило, обладают оптимальными аналитическими характеристиками: наиболее широким линейным диапазоном измерений (для количественной оценки вирусной нагрузки) от 10-100 МЕ/мл до 10⁸-10¹⁰ МЕ/мл, высокой аналитической чувствительностью (10-100 МЕ/мл) и специфичностью. В отличие от других методов количественного определения ДНК матрицы в пробе, ПЦР в реальном времени не требует дополнительных манипуляций, связанных с раститровкой ДНК исследуемой пробы или полученных в ходе ПЦР ампликонов, которые усложняют постановку анализа и могут приводить к появлению ложноположительных результатов. Подобный подход позволяет отказаться от стадии электрофореза, что ведет к резкому уменьшению вероятности контаминации исследуемых проб продуктами амплификации, а так же позволяет снизить требования, предъявляемые к ПЦР лаборатории [32,122].

Стандартизация количественных методов определения ДНК HBV в сыворотке крови привела к появлению Международных Единиц (ME). ME не отражают истинного количества вирусных частиц (копий ДНК) в образце

плазмы крови. В зависимости от используемой тест-системы 1 МЕ/мл соответствует различному содержанию вирусных частиц (2-7 копий/мл). Если соотношение копии/МЕ для тест-системы не определено, для ориентировочного пересчета принято использовать усредненный коэффициент, равный 5 (1 ME = 5 копий вирусной ДНК). Таким образом, 100 000 копий/мл (10⁵ копий/мл) равняются приблизительно 20 000 МЕ/мл (2х10⁴МЕ/мл) [13].

В таблице №2 представлены тест-системы разных производителей, отличающиеся диапазонами количественного измерения ДНК HBV [13,41].

Таблица №2. Тест-системы разных производителей, отличающиеся диапазонами

количественного измерения ДНК HBV.

Морфологические исследования ткани печени. В настоящее время наиболее точным и чувствительным методом оценки степени поражения печени является пункционная биопсия печени (ПБП). Одной из основных задач при морфологической диагностике вирусных гепатитов является установление степени активности (индекс гистологической активности - ИГА) и стадии фиброза печени (F). Большое

значение морфологическим исследованиям уделяется в связи с тем, что не всегда клинико-лабораторные показатели отражают и характеризуют реальную картину патологического процесса в печени.

В 2005 году рядом авторов была опубликована работа, которая показала, что по данным ПБП у больных ХГВ с нормальным уровнем АлАТ в крови в 77% случаев выявляется фиброз печени, из них - у 46% выраженный фиброз, что свидетельствует о необходимости расширения показаний для выполнения ПБП с целью выявления лиц с выраженным фиброзом для назначения противовирусной терапии [18].

Yang L.M. et al. в 2002 году опубликовали работу, посвященную оценке клинического значения биопсии печени у больных хроническим вирусным гепатитом В с постоянно нормальным уровнем АлАТ и АсАТ в крови. В исследование было включено 452 HBsAg-позитивных пациента, которым была выполнена ПБП. Результаты ПБП оценивались опытным морфологом. Пациенты были разделены на 4 группы: А и В - больные HBeAg-позитивным и HBeAg-негативным хроническим гепатитом В с постоянно нормальной активностью трансаминаз (ПЛАТ), соответственно, С и Д - больные HBeAg-позитивным и HBeAg-негативным хроническим гепатитом В с повышенным уровнем трансаминаз. У больных ХГВ с повышенным уровнем трансаминаз по результатам ПБП более выражены степень фиброза и некрозо-воспалительные изменения, чем у пациентов с ПНАТ. Однако, у больных HBeAg-негативным ХГВ с ПНАТ степень фиброза печени была более выражена, чем у пациентов с HBeAg-позитивным гепатитом В. Выраженные гистологические изменения в ткани печени были отмечены как у пациентов с повышенным уровнем трансаминаз, так и среди пациентов с ПНАТ. Таким образом, проведение ПБП у пациентов с ХГВ позволяет наиболее точно отразить степень некрозо-воспалительных изменений и степень выраженности фиброза печени, являясь ключевым звеном в решении вопроса о необходимости назначения ПВТ [131].

В 2008 году группой авторов была опубликована работа, посвященная оценке вирусологических и гистологических особенностей у пациентов с постоянно нормальным уровнем АлАТ в крови и бессимптомным течением хронической HBV-инфекции. В данной работе было показано, что использование лишь определения уровня ДНК HBV и уровня АлАТ в сыворотке крови без выполнения ПБП для выявления неактивных носителей HBV в группе пациентов с HBeAg-негативным гепатитом В с ПНАТ может привести к упущению выраженных гистологических изменений в ткани печени у пациента [72].

В связи с тем, что пункционная биопсия печени — это, прежде всего, инвазивныи метод исследования, к которому существует ряд абсолютных (тяжелая коагулопатия, тромбоцитопения, увеличение времени кровотечения, наличие гемангиом и опухолей в печени) и относительных (асцит, правосторонний плеврит, холангит) противопоказаний, а также могут быть осложнения при ее проведении (гемоперитонеум, билиарный перитонит, пневмоторакс, ложная пункция - пункция других органов), в последнее время большое внимание уделяется изучению неинвазивных методов диагностики фиброза печени. К ним относятся: определение сывороточных маркеров фиброгенеза и фибринолиза, оценка степени выраженности фибротических изменений в печени с использованием магнитно-резонансной фиброэластографии и аппарата «ФиброСкан», принцип работы которых основан на оценке степени выраженности фиброза с помощью измерения эластичности печени.

При накоплении фиброзной ткани в печени изменяются ее физические свойства, в связи с чем для клинического применения наиболее перспективными являются методы определения плотности и эластичности печеночной ткани, которые можно разделить на косвенные (определение скорости кровотока в портальной системе, зависящая от плотности печеночной ткани) и прямые (магнитно-резонансная эластография и ультразвуковая эластография).

Магнитно-резонансная эластография - безопасный, неинвазивный метод оценки фиброза печени, которую можно проводить с использованием стандартного магнитно-резонансного томогрофа с послойным исследованием целиком всей печени, а не маленького участка, как при пункционной биопсии печени и при эластографии. МРЭ дает хорошие результаты при необходимости отличить нормальную ткань печени от умеренного фиброза и умеренный фиброз от выраженного. У здоровых лиц результаты измерения плотности печени с использованием данного метода характеризуются высокой однородностью [96].

В последнее время для неинвазивной диагностики фиброза печени чаще используется транзиентная фиброэластография, с помощью аппарата «ФиброСкан». Основной рабочей частью аппарата «ФиброСкан» является ультразвуковой преобразовательный датчик, в который встроен источник колебаний средней амплитуды и низкой частоты. Колебания передаются на исследуемые ткани печени и создают упругие волны, скорость распространения которых зависит от эластичности печеночной ткани. Т.о., в результате исследования определяется эластичность ткани печени, которая выражается в кило Паскалях (кПа) [2].

Результаты фиброэластографии коррелируют со стадиями фиброза печени, оцененными при гистологическом исследовании. Так, по данным Miereen Friedrich-Rust и соавторов, 2007 г., коэффициент корреляции показателей эластичности печени со степенью выраженности фиброза по шкале METAVIR составил: 0,75 для пациентов со стадией фиброза печени F >2, 0, 73 - для пациентов с F >3 и 0,69 - для цирроза печени [50].

В работе Foucher J. и соавторов, 2005 г., было обследовано 711 пациентов с хроническими заболеваниями печени различной этиологии -ХГС, ХГВ, алкогольная болезнь печени и др. В результате данного исследования коэффициент корреляции показателей эластичности печени со степенью выраженности фиброза по шкале METAVIR составил 0,80 для

пациентов со стадией фиброза печени F2; 0,90 - у пациентов с F3 и 0,96 у пациентов с циррозом печени [51].

В работе, опубликованной в 2008 г., было показано, что транзиентная фиброэластография является приемлемым неинвазивным методом, заменяющим ПБП, среди пациентов с минимальной и выраженной стадиями фиброза печени [29].

Marcellin P., Ziol М. и соавторы, 2008г., провели исследование, посвященное оценке эффективности использования фиброэластографии, для определения выраженности фиброза печени у пациентов с хронической HBV-инфекцией. В исследование было включено 202 пациента с хроническим вирусным гепатитом В, которым была выполнена ПБП. Полученные результаты оценивались двумя морфологами по шкалам Ishak и Metavir. Результаты фиброэластографии коррелировали с результатами ПБП по Ishak и по Metavir — г=0,65. Коэффициент корреляции составил 0,81 для стадии фиброза печени F>2, 0,93 - для F>3 и 0,93 - для F4. Средний диапазон показателей эластичности составил 7,2 кПа для F>2 и 11 кПа - у пациентов с F4 [92].

1.5.Влияние генотипа, уровня виремии HBV на течение и исходы

вирусного гепатита В. Влияние генотипа HBVна естественное течение гепатита В.

В настоящее время все большее внимание уделяется распространенности и клиническому значению генотипов вируса гепатита В. К 1988 году было идентифицировано 6 генотипов вируса, обозначенных латинскими буквами от А до F, в 2000 году был описан новый генотип HBV -G [118]. Современная классификация выделяет 8 основных генотипов HBV (А-Н), различающихся по длине генома. Генотипы HBV имеют определенное географическое распространение [13, 70, 71].

Генотипы А и D о бнаруживаются во всем мире, но преобладают в странах Южной Европы и США; генотипы В и С выявляются у больных в странах Юго-Восточной Азии. Генотип Е встречается в Западной Африке, а

генотип F только в Центральной и Южной Америке. Генотип G впервые был обнаружен во Франции. Генотип Н был описан недавно в Центральной Америке, Мексике и Калифорнии. В России преобладает генотип D [15,70].

Показана возможность одновременного инфицирования несколькими генотипами. Так, рекомбинации HBV между генотипами В и С (В/С) часто встречается в Юго-Восточной Азии, рекомбинации A/D описаны в Италии и Южной Африке. Рекомбинации между генотипами С и D HBV (C/D) регистрируются в Тибете, рекомбинации А/С описаны во Вьетнаме (по данным различных авторов).

Генотипы по-разному влияют на течение хронического гепатита В и обладают разной чувствительностью к лечению ИФН [71]. Было показано, что пациенты с генотипом D и С HBV хуже отвечают на ИФН-терапию, чем пациенты с А и В [69,109].

При генотипе D HBV чаще развивается фульминантный гепатит. Исследования, проводимые в Азии, показали, что при генотипе В HBV сероконверсия HBeAg/анти-НВе возникает в более молодом возрасте, для генотипа В HBV характерна более стойкая ремиссия после HBeAg-сероконверсии, менее выражены некрозо-воспалительные изменения в печени [34, 35,44].

Для генотипа A HBV характерны более высокие показатели элиминации HBsAg и менее тяжелое поражение печени, а также лучший ответ на ИФН - терапию, чем у пациентов с генотипом D HBV [41,57,67]. Уровень вирусной нагрузки HBVв крови и другие факторы,

влияющие на неблагоприятные исходы хронического гепатита В.

Известными факторами прогрессирующего варианта течения ХГВ являются: возраст старше 40 лет, мужской пол, повышенный уровень АлАТ, HBeAg-позитивный гепатит В, высокий уровень вирусной нагрузки HBV, стадия фиброза печени (F2 и больше) выявленная при первичном обращении больного. Существует и ряд факторов, нуждающихся в дополнительном

изучении, такие как, генетические факторы риска, стеатоз печени, диабет, ожирение.

В 2006 и 2007 годах Iloeje U.H. и Као J.H. были опубликованы результаты многолетнего наблюдения больных хронической HBV-инфекцией, показавшие связь высокого УВН HBV в крови и риска развития цирроза печени. В исследование Iloeje U.H. было включено 3582 пациента с ХГВ, не получавших лечения противовирусными препаратами, со сроком наблюдения 11 лет, средний возраст, включенных в исследование больных, составил 45 лет. В данной работе было показано, что число случаев цирроза печени возрастало с увеличением УВН HBV в крови (4,5% у больных с УВН HBV <300 копий/мл и 36,2% у больных при УВН HBV > 10⁶ копий/мл). Таким образом, авторами был сделан вывод о том, что уровень ДНК HBV > 10⁶ копий/мл является важным критерием прогрессии заболевания. Кроме УВН HBV в крови, в данном исследовании факторами прогрессии были определены: HBeAg-статус (чаще ЦП формировался у пациентов с HBeAg-позитивным ХГВ), повышение уровня АлАТ в биохимическом анализе крови, мужской пол и старший возраст [64,69].

В 2006 году были подведены итоги многолетнего исследования Chen C.J. с соавторами, показавшие связь между уровнем ДНК HBV в крови и риском развития гепатоцеллюлярной карциномы. В исследуемую группу лиц вошло 3653 HBsAg-позитивных, анти-НСУ-негативных пациента, не получавших противовирусную терапию в период наблюдения, средний возраст составил 30- 65 лет. Набор пациентов проходил по скрининговой программе, начатой в Тайване с 1991-1992 гг. Средний срок наблюдения составил 11,4 года. В ходе этого исследования было показано, что повышение уровня ДНК HBV в сыворотке крови > 10,000 копий/мл является предвестником развития гепатоцеллюлярной карциномы независимо от HBeAg, уровня активности АлАТ и наличия цирроза печени [31]. В последующем результаты данного исследования подверглись более детальной статистической обработке и вновь были подтверждены [30].

УВН HBV в сыворотке крови является важным фактором риска прогрессии заболевания у больных ХГВ: постоянно высокий уровень ДНК HBV в сыворотке крови является неблагоприятным прогностическим маркером повышенного риска развития ЦП и ГЦК. Исследование, результаты которого опубликованы группой под руководством Iloeje U.H. в 2007 году, демонстрируют, что группа HBV-инфицированных лиц имеет более высокий риск смертности, чем здоровые люди и данный риск тем выше, чем выше уровень виремии HBV. Так, по данным указанного исследования смертность от рака печени увеличивалась с 72,8 на 100,000 населения в год для лиц с уровнем ДНК HBV в крови меньше, чем 300 копий/мл, до 815,6 на 100,000 населения в год для лиц с уровнем ДНК HBV в крови от 1 миллиона копий/мл и более. Регистрация серьезного поражения печени и смерти от цирроза печени увеличивалась от 9,1 до 267,4 на 100,000 населения в год [65].

В 2008 году был опубликован целый ряд работ, посвященных корреляции между высоким уровнем ДНК HBV в сыворотке крови и риском развития ГЦК.

В работе Liu ТТ. с соавторами было показано, что риск развития ГЦК увеличивается у пациентов с волнообразным уровнем ДНК HBV в крови -10⁴ — 10⁷ копий/мл [81].

В работе Chan HL., Tse СН. et al. был осуществлен многофакторный анализ факторов риска ГЦК и в результате проведенного исследования было показано, что высокий уровень ДНК HBV в крови, генотип вируса (С), наличие ЦП, мужской пол, старший возраст пациента, снижение уровня альбумина являются независимыми факторами риска развития ГЦК у больных ХГВ [27].

В 2009 году были опубликованы новые результаты исследований, посвященных изучению риска развития ГЦК у больных ХГВ с высоким УВН HBV в крови, которые подтверждают ранее полученные данные. В исследование Chan HL. было включено 506 больных ХГВ, находящихся под

наблюдением с 1997 года. У 41 пациента в течение наблюдения диагностирована ГЦК. Средний возраст пациентов к моменту выявления ГЦК составил 55±9 лет. У 66% (27/41) пациентов с ГЦК уровень ДНК HBV в крови был >10⁵ копий/мл [28].

Большинство работ по изучению риска развития ГЦК у больных ХГВ выполнено на азиатской популяции пациентов, у которой риск развития рака печени в целом выше, чем у европейцев. Ярким примером высокой частоты формирования ГЦК у больных ХГВ с высоким уровнем виремии демонстрирует работа японских авторов (Ohata К. с соавторами, 2004). В исследовании, включающем результаты 19-летнего наблюдения 73-х пациентов с хронической HBV-инфекцией, на основании мультивариантного анализа показано, что высокий уровень виремии, возраст пациента и выраженный фиброз печени при исходной биопсии являются независимыми факторами риска ГЦК. Кумулятивная частота развития ГЦК была крайне высокой и составила14%, 29% и 48% через 5, 10 и 15 лет после первичной биопсии печени, соответственно [105].

В работе Yang HI., опубликованной в 2002 году, было показано, что риск развития ГЦК выше у HBsAg- и HBeAg-позитивных пациентов мужского пола, по сравнению с HBsAg-позитивными и HBeAg-негативными больными, и значительно выше, чем у HBsAg-негативных и HBeAg-негативных пациентов. Всего в исследование было включено 11893 мужчин в возрасте от 30 до 65 лет, срок наблюдения составил 8,5 лет [130].

Рядом авторов установлено, что снижение УВН HBV в крови в процессе естественного течения ХГВ коррелирует с улучшением гистологической картины печени, однако, данное положение нуждается в подтверждении многолетними наблюдениями на больших группах пациентов [113].

Коинфекция вирусами гепатитов дельта, С и ВИЧ-инфекцией значительно увеличивает риск развития ЦП у больных ХГВ [45, 58, 122,131]. В исследовании, проведенном в Тайване, было показано, что вероятность

развития цирроза печени в течение 10 лет у пациентов с коинфекцией HBV+HCV составила 48%, у пациентов с суперинфекцией вирусом гепатита дельта - 21% и только у 9% у больных с хронической HBV-моноинфекцией [79, 134].

По данным литературы также известно, что ЦП чаще формируется при генотипе С HBV, чем при генотипе В HBV, а при генотипе D HBV чаще, чем в случае инфицирования генотипом A HBV. Для генотипа В HBV характерна более медленная прогрессия заболевания к циррозу печени и гепатоцеллюлярной карциноме по сравнению с генотипом С. Генотип С HBV характеризуется высокой частотой мутаций в core-зоне и является независимым фактором риска развития ГЦК [26,34,48,57,123].

Существуют единичные исследования по изучению взаимосвязи генотипа HBV и уровня виремии. Oommen РТ. с соавторами приводят сведения о такой взаимосвязи у детей с хронической HBV-инфекцией. В исследование было включено 162 мальчика и 87 девочек (средний возраст -7,2 года). Генотип A HBV диагностирован у 32,5 % детей, генотип D HBV -у 63,5%. По сравнению с детьми, инфицированными генотипом A HBV, у детей инфицированных генотипом D HBV отмечали достоверно более высокий уровень виремии [109].

К существенным факторам риска развития ЦП и ГЦК относится употребление алкоголя в дозе более 50 гр. этанола в сутки [106]. В целом, риск развития ГЦК у пациентов с хронической HBV-инфекцией в 100 раз выше, чем у пациентов без HBV-инфекции.

Важным фактором риска развития ГЦК является уже сформировавшийся цирроз печени [31]. Однако, важно отметить, что несмотря на то, что ГЦК наиболее часто встречается у пациентов с циррозом печени, в 30-50% случаев ГЦК, ассоциированная с вирусом гепатита В, развивается в отсутствии цирроза печени [20,96].

В целях раннего выявления ГЦК у больных хроническим вирусным гепатитом В с исходом в ЦП большинством экспертов рекомендуется каждые

6 месяцев выполнение УЗИ органов брюшной полости и определение содержания альфа-фетопротеина в крови. Также пациентам с циррозом печени HBV-этиологии по данным УЗИ органов брюшной полости рекомендуется выполнение наиболее информативных методов обследования: магнитно-ядерный резонанс и компьютерная томография печени.

В настоящее время одним из важнейших вопросов в области лечения хронического гепатита В является вопрос о возможности предотвращения развития ГЦК на фоне ХГВ проведением противовирусной терапии. В 2009 году получены результаты по изучению уровня виремии у больных ХГВ с различными исходами на фоне противовирусной терапии. Всего под наблюдением с 1997 года находилось 506 пациентов с хронической HBV-инфекцией, из них у 41 развилась ГЦК. Средний возраст больных с диагностированной ГЦК составил 55±9 лет. Сорок процентов пациентов в течение периода наблюдения получали противовирусную терапию. В целом, уровень виремии был выше у пациентов с ГЦК, не получавших лечение, по сравнению с больными без ГЦК, не получавших лечение (5,7±1,4 log копий/мл и 3,2±1,3 log копий/мл, соответственно Р<0,0001), в то время как, среди больных, которым противовирусная терапия проводилась, разница в уровне виремии между теми у кого развилась ГЦК и не диагностирована ГЦК была не существенной (3,0 ±1,4 log копий/мл у больных ГЦК и 2,5±0,9 log копий/мл у больных контрольной группы, Р = 0,38). В целом, по результатам исследования уровень виремии оказался независимым фактором риска формирования ГЦК, однако, вопрос о том, в какой мере противовирусная терапия позволяет предотвратить ГЦК остается открытым [28]. Уровень виремии, который удалось достигнуть на фоне лечения, был низким, однако, результаты исследования демонстрируют, что это не помешало развитию ГЦК.

В то же время, в другой публикации 2008 года, где описаны результаты наблюдения 2874 HBsAg-позитивных жителей Тайваня в течении 16 лет получены данные что уровень виремии <4,39 log копий/мл ассоциируется со

стойко нормальными показателями АлАТ и низким риском формирования ГЦК [127].

І.б.Значение уровня виремии ДНК HBV в отборе кандидатов для противовирусного лечения и эволюция клинических рекомендаций

2004-2009гг. Уровень вирусной нагрузки HBV, степень поражения ткани печени, активность АлАТ и показания к противовирусной терапии.

В настоящее время большое значение уделяется уровню вирусной нагрузки (УВН) не только при оценке прогноза течения и исходов заболевания, но также при отборе кандидатов для противовирусной терапии, оценке эффективности противовирусной терапии, вероятности развития резистентности к лечению нуклеозидными аналогами. Большинство экспертов считает, что УВН HBV в крови является важным критерием в уточнении диагноза [111]. Эти положения основаны на данных многочисленных исследований по сравнительному изучению уровня виремии, фиброза печени и активности АлАТ у больных ХГВ. И, как правило, у пациентов с повышенным уровнем АлАТ и высоким уровнем виремии диагностируется выраженная активность гепатита и выраженный фиброз печени, вследствие чего они расцениваются как кандидаты для лечения [112].

Часть исследований, выполненных на европейской популяции, демонстрируют, что значительную часть больных ХГВ составляют лица с постоянно низким уровнем виремии HBV и такие пациенты не рассматриваются как кандидаты для лечения. Так, исследование проведенное в Греции на группе, состоящей из 26746 HBsAg-позитивных женщин, показало, что у 42,8% женщин детородного возраста регистрируется УВН HBV в крови в пределах 1500 и 40,000 копий/мл. Авторы отмечают, что в 28,6% образцах крови, полученных от исследуемой группы, регистрировался неопределяемый уровень виремии (<200 копий/мл) и в 15,9% образцов регистрировали крайне низкий уровень виремии HBV в крови (<400

копий/мл) [42]. Данные результаты не исключают необходимости тщательного мониторинга HBsAg-позитивных пациентов в течение жизни, несмотря на стойко нормальные показатели АлАТ и низкого уровня виремии.

В 2007 году опубликована работа, посвященная уровню АлАТ и уровню ДНК HBV в крови у неактивных носителей HBsAg. В результате исследовании было показано, что, несмотря на постоянно нормальный уровень активности АлАТ, при динамическом обследовании пациентов с HBeAg-негативным гепатитом В в течение года, ДНК HBV в крови может периодически определяться, что подтверждает необходимость систематического мониторинга двух этих показателей, чтобы не пропустить обострение процесса [108].

В то же время, у части пациентов с HBeAg-позитивным гепатитом В наблюдается относительно низкий уровень виремии, и в таком случае возможно отложить на время решение о лечении, если степень поражения печени незначительна и, кроме того, существует возможность спонтанной сероконверсии. В работе Man-Fung Yuen et al. было показано, что уровень ДНК HBV в крови <10⁵ копий/мл у большинства анти-НВе-позитивных пациентов с хроническим гепатитом В коррелирует с незначительно измененной гистологической картиной ткани печени (минимальные некрозо-воспалительные изменении и отсутствие фиброза) [91].

Большой интерес представляют исследования по изучению связи уровня виремии с выраженностью фиброза печени. Существующие данные о клинической роли вирусной нагрузки во многом противоречивы: в ряде работ не получено данных о взаимосвязи УВН HBV в крови и степени повреждения ткани печени. В 2002 году опубликован обзор 26 проспективных исследований, в ходе которых была показана корреляция между уровнем вирусной нагрузки HBV в крови и индексом гистологической активности процесса в печени, биохимическими показателями крови, однако, однозначной связи уровня виремии и степени фиброза выявлено не было [97].

В 2007 году были опубликованы результаты исследования, проведенного в Бангладеш, в ходе которого было показано, что не выявлено корреляции между высоким уровнем ДНК HBV в сыворотке крови, ИГА и выраженностью стадии фиброза печени у пациентов как с HBeAg-позитивным, так и с HBeAg-негативным ХГВ [89].

Большинство исследований последних пяти лет демонстрируют, что низкий уровень виремии HBV в сыворотке крови не исключает тяжелого поражения печени. Так, в исследовании Nabuco LC, выполненном в Бразилии в 2007 году, показана прямая корреляционная зависимость между уровнем виремии, индексом гистологической активности и стадией фиброза печени, однако, у 25% больных с относительно низким уровнем виремии (менее 30,000 копий/мл) диагностировано значительное повреждение печени [102].

Уровень ДНК HBV в крови 2,5 х 10⁴ копий/мл предлагается рядом авторов для разграничения неактивного носительства HBV от хронического гепатита В [22]. Поскольку большинство исследований демонстрирует, что уровень виремии, превышающий указанный выше УВН HBV в крови, коррелирует со степенью воспаления, стадией фиброза и уровнем Ал AT [88, 132].

В то же время, в части исследований не получено статистически значимой связи уровня виремии и степени повреждения печени, однако, получена корреляция с уровнем АлАТ и другими рутинными биохимическими тестами [129].

В исследовании, проведенном в Тайване, было включено 2874 HBsAg-позитивных мужчин в возрасте старше 30 лет. В результате данной работы было показано, что снижение УВН HBV в крови <4 log копий/мл коррелирует с нормализацией АлАТ и снижением риска развития ГЦК [127]. При долгосрочной терапии энтекавиром больных ХГВ получены данные по полной регрессии фиброза печени у пациентов с длительной (более 5 лет) авиремией [87]. Указанные работы, анализирующие клиническое значение

снижения уровня виремии в процессе естественного течения хронического гепатита В или в результате противовирусного лечения, представляют особый интерес, поскольку работы такого рода позволяют обосновать целесообразность противовирусной терапии, даже если ее результатом не является элиминация HBsAg, а только снижение уровня виремии до неопределяемого уровня.

Значение уровня виремии ДНКНВУ в отборе кандидатов для ПВТ и эволюгщя клинических рекомендаций 2004 - 2009гг.

За последние годы было принято несколько согласительных документов, регламентирующих показания к лечению хронического гепатита В. Основной целью противовирусной терапии больного хроническим гепатитом В является предотвращение неблагоприятных исходов заболевания (прогрессии заболевания в ЦП печени и ГЦК). Т.к. большинство исследований продемонстрировало, что активная репликация HBV является причиной этих основных неблагоприятных исходов заболевания, главной задачей лечения считается уменьшение уровня ДНК HBV в крови до самых минимальных значений, нормализация активности АлАТ и АсАТ, уменьшение некрозо-воспалительной активности гепатита и уменьшение степени выраженности фиброза печени.

В настоящий момент для лечения ХГВ в России зарегистрированы препараты стандартного интерферона-сс и пегилированного интерферон-а («Пегасис», «Пег-Интрон»), а также пероральные аналоги нуктеоти(зи)дов: ламивудин («зеффикс») и два современных пероральных нуклеозидных аналога - энтекавир («бараклюд») и телбивудин («себиво»), зарегистрированные в России в 2007 году.

Далее рассмотрим основные этапы создания алгоритма ведения больных хроническим гепатитом В в Европе и США. Т.к. ранее определение уровня вирусной нагрузки гепатита В осуществлялось с использованием методов гибридизации с пороговым уровнем чувствительности 10⁵ копий/мл, то все рекомендации по лечению пациентов с хронической HBV- инфекцией

изначально основывались на этом уровне. В 2003 гоуд Manesis E.R. et al. для дифференцировки HBeAg-негативного хронического гепатита В и неактивного носительства HBsAg предложили новый пороговый уровень ДНК HBV в сыворотке крови (чувствительным количественным методом ПЦР). Разграничивающий уровень ДНК HBV в крови должен быть 30 000 копий/мл в отличие от предлагаемого ранее УВН HBV в крови - 100 000 копий/мл [90].

В 2004 году эксперты медицинского центра Аляски предложили следующие рекомендации по лечению ХГВ. У пациентов с HBeAg-позитивным ХГВ вирусная нагрузка на назначение терапии не влияет, основной акцент сделан на результатах пункционной биопсии печени. Терапия показана при повышении уровня АлАТ в сыворотке крови более 2 норм и выявлении при гистологическом исследовании клинически значимого поражения печени. Пациенты с HBeAg- позитивным ХГВ и нормальным уровнем АлАТ в крови в лечении не нуждаются, за исключением тех случаев, когда по данным биопсии печени обнаруживаются выраженные некрозо-воспалительные изменения. Т.о. у пациентов с HBeAg —позитивным ХГВ назначение терапии обосновывалось на данных ПБП. При HBeAg-негативном ХГВ, кроме ПБП, критерием для назначения терапии является уровень ДНК HBV в крови, т.е., пациенты с HBeAg-негативным ХГВ, уровнем ДНК HBV в сыворотке крови >10⁵ копий/мл, АлАТ более 2 норм и средней/тяжелой степени активности гепатита по данным биопсии печени нуждаются в противовирусной терапии. Неактивным носителям HBsAg противовирусная терапия не показана [85]. Таким образом, первый раз уровень вирусной нагрузки ДНК HBV в крови стал критерием отбора для лечения.

Также в 2004 году группой канадских экспертов были опубликованы рекомендации по диагностике и лечению ХГВ. Критерием к назначению противовирусной терапии, как и в 2002 году был уровень ДНК HBV в сыворотке крови > 10⁵ копий/мл (как для пациентов с HBeAg-позитивным,

так и для HBeAg-негативным гепатитом В). Количественное определение ДНК HBV в сыворотке крови и выполнение пункционной биопсии печени рекомендовалось пациентам с повышенным уровнем АлАТ. Противовирусную терапию было решено считать эффективной, если достигалось снижение ДНК HBV < 10⁵ копий/мл [99].

По рекомендациям группы американских экспертов от 2004 года, терапия рекомендована пациентам с HBeAg-позитивным ХГВ с уровнем ДНК HBV >10⁵ копий/мл. А пациентам с HBeAg-негативным ХГВ и компенсированным циррозом печени показанием к назначению терапии был установлен уровень ДНК HBV >10⁴ копий/мл. Пациенты с декомпенсированным ЦП HBV-этиологии должны быть включены в лист ожидания трансплантации печени [40].

По данным Азиатско-Тихоокеанского консенсусного документа по тактике ведения больных ХГВ от 2005 года, пациенты с HBeAg- позитивным и HBeAg-негативным ХГВ с уровнем АлАТ менее 2 норм в терапии не нуждались, мониторинг за такими больными необходим каждые 3 месяца в течение первого года, в последующем - каждые 6 месяцев.

Пациентам с HBeAg-позитивным и HBeAg-негативным ХГВ с уровнем ДНК HBV в крови >10⁵ копий/мл, активностью АлАТ более 2 норм, рекомендовалось проведение пункционной биопсии печени с последующим назначением противовирусной терапии, если выявлено существенное поражение печени [80].

В 2006 и 2007 гг. в США советом экспертов в области изучения заболеваний печени обновлены рекомендации практическим врачам по тактике ведения пациентов с хронической HBV-инфекцией. Так по данным американского консенсусного документа от 2006 года, исследователи ориентируются на более низкий уровень ДНК HBV в крови при назначении терапии по сравнению с предыдущими документами.

В соответствии с обновленными рекомендациям, пациенты с HBeAg-позитивным гепатитом В с уровнем ДНК HBV в крови < 20,000 МЕ/мл,

нормальным уровнем АлАТ (30 МЕ/мл для мужчин и 19 МЕ/мл для женщин) в противовирусной терапии не нуждаются. Мониторинг таких пациентов осуществляется каждые 6-12 месяцев. Пациентам с HBeAg-позитивным ХГВ, старше 35-40 лет, с нормальным уровнем АлАТ выполняется пункционная биопсия печени и в зависимости от ее результатов решается вопрос о назначении противовирусной терапии. Противовирусная терапия без пункционной биопсии печени по рекомендациям американских экспертов показана HBeAg-позитивным больным ХГВ с уровнем ДНК HBVb крови > 20,000 МЕ/мл и повышенным уровнем АлАТ. В случае HBeAg-негативного ХГВ противовирусная терапия показана пациентам с уровнем ДНК HBV > 2000 МЕ/мл и повышенным уровнем АлАТ в крови. Пациентам с нормальными биохимическими показателями крови рекомендована ПБП и при выявлении морфологических признаков активного гепатита или фиброза 2 стадии и более также назначается терапия. Пациентов с HBeAg-негативным ХГВ с уровнем ДНК HBV в крови < 2000 МЕ/мл рекомендовано динамическое наблюдение каждые 6-12 месяцев.

Пациентам с компенсированным циррозам печени противовирусную терапию назначают при УВН HBV в крови > 2000 МЕ/мл, у пациентов с уровнем ДНК HBV в крови < 2000 МЕ/мл допустим выбор: лечить или наблюдать. Пациентам с декомпенсированным как HBeAg-негативным, так и с HBeAg-позитивным циррозом печени независимо от уровня ДНК HBV в сыворотке крови показана длительная терапия нуклеозидными аналогами. Такие пациенты должны быть внесены в лист ожидания для проведения трансплантации печени [41].

В 2007 году опубликованы очередные обновленные рекомендации по ведению больных хроническим гепатитом В (AASLD и Рабочей группы Национального института здоровья США), в которых эксперты так же при назначении терапии ориентируются на уровень ДНК HBV в крови > 20,000 МЕ/мл при HBeAg-позитивном и ДНК HBV в крови > 2000 МЕ/мл при HBeAg-негативном гепатите В. Т.е. противовирусная терапия показана

пациентам с HBeAg-позитивным гепатитом В с уровнем ДНК HBV в крови > 20,000 МЕ/мл, пациентам с HBeAg-негативным гепатитом В с уровнем ДНК HBV в крови > 2000 МЕ/мл при повышении АлАТ > 2-х норм (норма - 30 МЕ/мл для мужчин и 19 МЕ/мл для женщин). Если показатели АлАТ не превышают 1-2 нормы, а так же при наличии семейного анамнеза по ГЦК рекомендовано выполнение биопсии печени. Если по результатам морфологического исследования есть признаки активного гепатита или стадия фиброза соответствует 2 и более, также назначается терапия. Рекомендовано продолжить терапию нуклеозидными аналогами в течение 6 месяцев после HBeAg-сероконверсии (консолидирующая терапия). В случае компенсированного, как HBeAg-негативного, так и HBeAg-позитивного цирроза печени терапия показана при УВН HBV в крови > 2000 МЕ/мл независимо от уровня АлАТ; если УВН HBV в крови < 2000 МЕ/мл терапия, то таким пациентам противовирусное лечение назначается при условии повышения активности АлАТ в крови.

Пациентам с дскомпенсированным (как HBeAg-негативным, так и HBeAg-позитивным) циррозом печени независимо от уровня ДНК HBV в сыворотке крови показана длительная терапия. Эти пациенты должны быть включены в лист ожидания на трансплантацию печени.

У больных циррозом печени должны применяться нуклеозидные аналоги с низком риском развития резистентности (энтекавир). Применение препаратов с высоким риском развития резистентности опасно в отношении декомпенсации цирроза при реактивации вирусной репликации вследствие резистентности [14].

Американские рекомендации 2008 года почти полностью повторяют рекомендации 2007 года. В соответствии с ними противовирусная терапия показана HBeAg-позитивным и HBeAg-негативным пациентам с УВН HBV >20,000 МЕ/мл и повышенным уровнем АлАТ (больше 2-х норм) в крови. В случае нормальных биохимических показателей и УВН HBV >20,000 МЕ/мл в крови при HBeAg-позитивном и УВН HBV > 2,000 МЕ/мл при HBeAg-

негативном (у пациентов старше 40 лет, а так же - с семейным анамнезом по ГЦК) рекомендуется выполнение ПБП, по результатам которой решается вопрос о необходимости назначения противовирусной терапии. Противовирусная терапия показана пациентам с компенсированным циррозом печени при уровне ДНК HBV в крови >2,000МЕ/мл и пациентам с декомпенсированным циррозом печени и определяемым УВН HBV в крови [58].

Европейские рекомендации 2009 года, принятые на согласительной конференции Европейского общества по изучению заболеваний печени (EASL), включают несколько иные принципы тактики ведения больных ХГВ. Показания к лечению основываются на сочетании трех критериев: УВН HBV, активности АлАТ в крови и результатов ПБП (степень активности и стадия фиброза). Пациенту рекомендуется противовирусная терапия при следующих условиях: уровень ДНК HBV > 2,000 МЕ/мл (10 000 копий/мл) и/или активность АлАТ в крови выше верхней границы нормы (30 МЕ/мл для мужчин и 19 МЕ/мл для женщин) и/или по результатам ПБП по шкале METAVIR диагностирована высокая активность гепатита и/или значительно выраженный фиброз (А2 или F2).

Противовирусная терапия не показана пациентам в иммунотолерантной фазе (молодые люди до 30 лет с постоянно нормальным уровнем АлАТ и высоким УВН в крови (>10 копий/мл без семейного анамнеза по ГЦК и ЦП), а также - неактивным носителям HBsAg.

Лечение HBeAg-позитивного хронического гепатита В возможно как препаратами пегилированного интерферона, так и нуклеозидными аналогами.

Длительность лечения нуклеозидными аналогами хронического HBeAg-позитивного хронического гепатита В определяется достижением или отсутствием HBeAg-сероконверсии. В том случае, если удалось достигнуть HBeAg-сероконверсии, рекомендуется после ее наступления продолжить лечение в течение 24 недель и затем возможна отмена препарата, если

сохраняется неопределяемый уровень виремии. Если не удается достигнуть сероконверсии, но сохраняется неопределяемый уровень виремии, лечение рекомендуется продлить на неопределенно долгий период, так как отмена препарата может привести к обострению заболевания.

Основной целью терапии HBeAg-негативного гепатита В признан клиренс ДНК HBV до неопределяемого уровня и нормализация активности АлАТ (критерии эффективности терапии).

Пациентам с декомпенсированным как HBeAg-негативным, так и HBeAg-позитивным циррозом печени независимо от уровня ДНК HBV в сыворотке крови показана противовирусная терапия [39].

По последним практическим рекомендациям американской ассоциации по изучению печени (AASLD Practice Guigelines, 2009 г.) в показаниях к назначению противовирусной терапии эксперты вновь ориентируются на уровень ДНК HBV в крови > 20,000 МЕ/мл. Так, в соответствии с их рекомендациями противовирусная терапия показана пациентам с HBeAg-позитивным, HBeAg-негативным ХГВ с УВН HBV > 20,000 МЕ/мл и уровнем АлАТ > 2 норм. Пациентам с HBeAg-позитивным ХГВ в возрасте старше 40 лет в случае, если их биохимические показатели не превышают 2 норм, а уровень ДНК HBV в крови > 20,000 МЕ/мл, для решения вопроса о необходимости противовирусной терапии рекомендуется выполнение ПБП. Пациентам с HBeAg-негативным гепатитом В в диапазоне виремии 2,000 -20,000 МЕ/мл с уровнем АлАТ < 2 норм для решения вопроса о необходимости противовирусной терапии также рекомендуется выполнение ПБП.

Пациенты с HBeAg-негативным ХГВ, нормальным уровнем АлАТ и уровнем ДНК HBV < 2000 МЕ/мл в крови должны каждые 3 месяца в течение первого года, а затем - каждые 6 месяцев сдавать биохимический анализ крови, для выявления неактивных носителей HBsAg [86].

В настоящее время нет единых рекомендаций по тактике ведения пациентов с различными вариантами хронической HBV-инфекции. Так,

европейские эксперты показания к противовирусной терапии более склонны определять по результатам ПБП, а американские эксперты в большей степени ориентируются на УВН HBV в крови и активность АлАТ. Кроме того, до сих пор нет единого критерия диагноза неактивного носительства HBV (неопределяемый уровень виремии или УВН HBV в крови < 10⁴ копий/мл).

Отсутствуют также четкие представления о роли выявления низких концентраций HBV в крови и волнообразного уровня ДНК HBV в крови в степени поражении печени и риске развития неблагоприятных исходов.

В связи с этим необходимы дальнейшие исследования по изучению течения хронической HBV-инфекцией у лиц с различными динамическими характеристиками уровня виремии и их корреляции с активностью АлАТ, морфологией печени, скоростью прогрессии заболевания и формированием неблагоприятных исходов заболевания. Такие исследования помогут в большей степени усовершенствовать тактику ведения пациентов, повысить эффективность противовирусной терапии и снизить риски неблагоприятных исходов хронической HBV-инфекции. Дальнейшие исследования позволят уточнить особенности течения хронического гепатита В у лиц европейской этнической принадлежности.

ЧАСТЬ П. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ. ГЛАВА 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. 1.1. Общая характеристика исследуемой группы.

Среди 205 обследованных HBsAg-позитивных пациентов в исследование был включен 171 больной хронической HBV-моноинфекцией, которые на основании полученных в ходе исследования данных были разделены на 3 группы:

1. группа № 1 - «неактивные носители» вируса гепатита В (п=16).

2. группа № 2 - больные ХГВ (п=149); в зависимости от наличия HBeAg в сыворотке крови в группе ХГВ были выделены 2 подгруппы: 2а - 13 больных хроническим вирусным HBeAg-позитивным гепатитом В и 26 -136 пациентов с хроническим вирусным HBeAg-негативным гепатитом В.

3. группа № 3 - больные ХГВ с развитием неблагоприятных исходов (п=6), среди них цирроз печени - у 5 человек (у одного пациента в сочетании с ГЦК), ГЦК - у 1 пациента.

При обследовании у 34 из 205 HBsAg-позитивных пациентов, диагностирован ХВГ смешанной этиологии (у 18 (53 %) человек -хронический гепатит В (ХГВ) с дельта-агентом, у 13 (38,2%) пациентов -ХГВ+ХГС и у 3 (8,8%) пациентов одновременно выявлялась HBV-, HDV- и HCV-инфекции).

Контрольную группу (группа №4) составили практически здоровые лица - 56 человек, из них 22 (39,3%) женщины и 34 (60,7%) мужчины. Средний возраст пациентов данной группы составил 63,9+1,9 лет. У всех лиц контрольной группы отсутствовали HBsAg, анти-HCV в крови по дпнным метода ИФА и ДНК HBV в крови по данным метода ПЦР.

Критериями включения HBsAg-позитивных пациентов в исследование являлись: выявление HBsAg в течение 6 мес. и более перед включением в исследование, возможность наблюдения за пациентом в динамике в течение полутора - двух лет, письменное информированное согласие пациента на

участие в исследовании, отсутствие онкологических и психических заболеваний, а так же отсутствие HCV-, HDV- и ВИЧ-инфекции.

В качестве основных методов обследования больных применены:

1. Метод клинико-эпидемиологического обследования пациентов: сбор
анамнеза, оценка состояния и жалоб пациента, физикальный осмотр;

2. Стандартные лабораторные методы: общеклинический и биохимический анализ крови;

3. Серологический метод: определение маркеров вирусных гепатитов В, С и D методом ИФА;

4. Молекулярно-биологический метод: колличественное определение ДНК HBV в сыворотке крови методом ГЩР в режиме реального времени (PCR real time);

5. Инструментальные методы:

1. УЗИ органов брюшной полости;

2. пункционная биопсия печени с последующим морфологическим исследованием пунктата;

3. транзиентная фиброэластография;

6. Статистический.

Таблица 1

Характеристика исследовательских выборок, методы исследования

1.2. Критерии диагноза.

Диагноз «неактивное носительство вируса гепатита В» устанавливали на основании отсутствия жалоб у пациентов при динамическом наблюдении, постоянно нормального уровня аминотрансфераз (АлАТ/АсАТ) в биохимическом анализе крови, персистенции HBsAg в течение 6 месяцев и более, отсутствия ДНК HBV и других маркеров репликации HBV в сыворотке крови при трехкратном обследовании с интервалом 6 мес.

Критериями ХГВ были персистенция HBsAg у больного в течение 6 месяцев и более, обнаружение ДНК HBV в сыворотке крови, постоянно нормальный, волнообразный или повышенный уровень АлАТ/АсАТ в сыворотке крови, гистологическая картина хронического гепатита (индекс

гистологической активности > 4 и стадия фиброза печени F > 1) по данным ПБП и/или транзиентной фиброэластографии.

Диагноз ЦП и ГЦК устанавливали на основании как клинических данных (астенический и диспепсический синдромы, гепатоспленомегалия, асцит), так и лабораторных: повышение активности аминотрансфераз, снижение протромбинового индекса, альбумина сыворотки крови и тромбоцитов. Для выявления признаков портальной гипертензии использовались инструментальные методы обследования (УЗИ органов брюшной полости с определением состояния сосудов печени, ЭГДС с оценкой состояния вен пищевода). Диагноза ГЦК подтверждался высокими показателями уровня альфа-фетопротеина в сыворотке крови и результатами компьютерной томографии органов брюшной полости.

1.3. Характеристика методов обследования пациентов, включенных в исследование.

Всем пациентам, включенным в исследование, было проведено стандартное клинико-эпидемиологическое обследование: сбор анамнеза, оценка жалоб, данные физикального осмотра; лабораторные методы обследования (общий анализ крови, определение биохимических показателей с интервалом в 6 мес, серологическое исследование для определения маркеров вирусных гепатитов методом ИФА, определение уровня ДНК вируса гепатита В в сыворотке крови с интервалом 6 месяцев количественным методом (ПЦР в режиме реального времени). Большинству пациентов проводилось обследование инструментальными методами: УЗИ органов брюшной полости (72,5%, 124/171). Из 171-го больного ХГВ 35-ти пациентам была выполнена ПБП и 47-ми транзиентная фиброэластография с помощью аппарата «ФиброСкан» для уточнения, как степени активности гепатита, так и стадии фиброза печени. Для сравнительной оценки стадии фиброза, диагностированной методом ПБП и фиброэластографии, 14

больным ХГВ была выполнено исследование ткани печени двумя указанными методами.

1.3.1. Биохимический анализ крови.

У пациентов во всех группах, включенных в исследование, проводили следующие биохимические исследования сывороток крови:

- определение активности ферментов на автоматическом биохимическом
анализаторе «Cobas Integra 400 Plus» фирмы «Hoffmann La-Roshe»
(Швейцария):

аспартатаминотрансферазы (АсАТ) - норма до 40 мкмоль/мин.л;

аланинаминотрансферазы (АлАТ) — норма до 40 мкмоль/мин.л;

щелочной фосфотазы (ЩФ) — норма до 100 мкмоль/мин.л;

гамма-глутамилтранспептидазы (ГГТП) - норма до 40 мкмоль/мин.л; фракционное количественное определение уровня билирубина

модифицированным методом Иендрашика (норма до 20 мкмоль/л) на автоматическом биохимическом анализаторе «Cobas Integra 400 Plus» фирмы «Hoffmann La-Roshe» (Швейцария);

- определение тимоловой пробы модифицированным методом по Макглану -
норма до 9 единиц;

определение протромбинового индекса на полуавтоматическом коагулометре — норма 90-100%;

- определение общего белка и белковых фракций методом электрофореза.

1.3.2. Определение маркеров вирусных гепатитов В, С и D методом ИФА.

Все пациенты, включенные в исследование, были обследованы на наличие в крови маркеров вирусных гепатитов с помощью коммерческих тест-систем с использованием не только метода ИФА, но и современной хемилюминесценции:

1. иммунохимический автоматический анализатор «Architect і 2000 SR», «Abbott» (Германия) с хемилюминесцентной технологией;

2. иммунохимический автоматический анализатор «Elecsys 2010» «Hoffmann La- Roche» (Швейцария) с электрохемилюминесцентной технологией.

У пациентов, включенных в исследование, определялись нижеперечисленные маркеры:

HbsAg, HbeAg, анти-НВ core Ig М, анти-НВ core IgG, анти-НВе, анти-HCV-«Architect і 2000 SR», «Abbott» (Германия) с хемилюминесцентной технологией;

анти-HDV Ig М - «Вектоген Д - IgM», ЗАО «Вектор Бест», г. Новосибирск, метод ИФА;

- анти-HDV Ig G - «Вектоген Д - антитела-стрип», ЗАО «Вектор Бест»,
г.Новосибирск, метод ИФА;

1.3.3. Определение ДНК HBV в сыворотке крови методом ПЦР в режиме реального времени (PCR real time).

Определение ДНК HBV в сыворотке крови пациентов, включенных в исследование, проводилось с использованием наборов реагентов для выявления ДНК возбудителей инфекции методом ПЦР с детекцией результатов в режиме «реального времени».

В основе метода ПЦР лежит выявление специфического фрагмента ДНК путем накопления (амплификации) специфических фрагментов. В результате многократно повторяющихся циклов синтеза новых цепей ДНК, гомологичной специфической области ДНК-мишени, происходит накопление фрагментов ДНК в количестве, достаточном для детекции, с использованием флуорометрии в режиме реального времени. Детекция продуктов амплификации проводится в реакционном растворе за счет специфической гибридизации ампликонов с олигонуклеотидным зондом, несущем флуоресцентную метку. В ходе последующей полимеразной реакции происходит разрушение зонда и высвобождение флуоресцентной метки в раствор, что делает возможным её регистрацию на флуоресцентном детекторе. По нарастанию интенсивности флуоресцентного сигнала

программное обеспечение, прилагаемое к флуоресцентному детектору или амплификатору, позволяет проводить корректную обработку данных для выявления ДНК HBV. Чувствительность метода - < 10³ копий/мл.

Количественное определение вирусной нагрузки проводилось с помощью программного обеспечения «ABI Prism 7000 SDS Software vl.O» («Applied Biosystems») на основании полученной в ходе реакции калибровочной кривой.

1.3.4. Инструментальные методы исследования.

Пациентам с различными вариантами хронической HBV-инфекции проводилось ультразвуковое исследование органов брюшной полости на аппарате «ALOKA SSD-630» (Япония) и ЭГДС аппаратом «Fujinon», модель FG-1Z (Япония). При УЗИ органов брюшной полости у пациентов оценивались эхогенность, эхоструктура, размеры печени и селезенки, диаметры воротной и селезеночной вен, при проведении ЭГДС определялось наличие или отсутствие варикозного расширения вен пищевода и желудка.

Пункционная биопсия печени (ПБП) была выполнена 35 пациентам и

проводилась с учетом показаний и противопоказаний к проведению данной

процедуры. Противопоказания к проведению ПБП:

протромбиновый индекс крови менее 70%;

снижение количества тромбоцитов менее 120x10⁹/л;

повышение активности АлАТ и АсАТ больше 300-400 мкмоль/мин.л;

повышение уровня билирубина более 60 мкмоль/л;

расширение желчных протоков и наличие очаговых процессов в печени при УЗИ органов брюшной полости;

- время свертываемости менее 4 минут и время кровотечения больше 3
минут.

Для оценки степени активности процесса и стадии фиброза печени использовались следующие системы подсчета: шкалы Knodell (1981г.) и METAVIR (1994г.). Индекс гистологической активности (ИГА) процесса в

печени по критериям Knodell определяют с помощью балльной системы. Составными компонентами ИГА являются:

1 - перипортальный некроз с наличием мостовидных некрозов или без них (от О до 10 баллов);

2. интралобулярная дегенерация и фокальный некроз (от 0 до 4 баллов);

3. портальное воспаление (от 0 до 4 баллов);

4. фиброз (диапазон цифровой оценки составляет от 0 до 4 баллов).

По сумме первых трех компонентов ИГА (от 0 до 18 баллов) определяется степень активности гепатита: 1-3 балла - минимальная степень активности; 4-8 баллов - слабовыраженная степень активности гепатита; 9-12 баллов - умеренно выраженная; 13-18 баллов — выраженная.

Стадию хронического гепатита определяли по степени выраженности фиброза и оценивают в баллах от 0 до 4 по Knodell:

1. нет фиброза;

2. слабовыраженный перипортальный фиброз;

3. умеренный фиброз с порто-портальными трактами;

4. выраженный фиброз;

5. цирроз печени.

Для сопоставления индекса фиброза (ИФ) по шкале Knodell и METAVIR существует коэффициент пересчета: (ИФ в баллах по Knodell х 0,8780) + 0,2775 = ИФ по METAVIR.

Неинвазивное измерение степени фиброза печени 54 пациентам с различными вариантами хронической HBV-инфекции проводилось с использованием прибора «FibroScan» («Ehochosens», Франция). Аппарат представлен ультразвуковым преобразовательным датчиком, в который установлен источник колебаний средней амплитуды и низкой частоты. Генерируемые датчиком колебания передаются на исследуемые ткани печени и создают упругие волны. Эластичность печеночной ткани и определяется

скоростью распространения упругих волн. Общий объем ткани, подвергающейся исследованию, в среднем составляет 6 см³. Исследование на аппарате «FibroScan» проводится в положении пациента на спине с максимально отведенной правой рукой. Ультразвуковой трансдуцер датчика устанавливается в 6-8 межреберье по средне-подмышечной линии в проекции правой доли печени. Для исследования с помощью окна ультразвуковой визуализации выбирается однородный участок печени диаметром более 5 мм без сосудов. После установки датчика выполняется 10 замеров, по результатам которых программа вычисляет величину эластичности печени. Полученная величина выражается в килопаскалях (кПа). Имеются определенные значения эластичности в кПа, которые позволяют разделить пациентов по стадиям выраженности фиброза от F0 до F4 в соответствии с системой METAVIR: F0 - средний показатель эластичности печени - 3,5 кПа (диапазон 1,5-5,8 кПа); F1 - средний показатель эластичности печени - 6,5 кПа (диапазон 5,9-7,2 кПа); F2- средний показатель эластичности печени - 8,3 КПа (диапазон 7,3-9,5 кПа); F3- средний показатель эластичности печени - 11 кПа (диапазон 9,6-12,5 кПа); F4- средний показатель эластичности печени - 24 кПа (> 12,5 кПа).

1.3.5. Статистическая обработка данных.

Статистическая обработка результатов проводилась с помощью программ «Microsoft Excel» («Microsoft Office 2007»), «STATISTICA 6.0». Определены процентное содержание ряда полученных данных (%), средняя арифметическая (М), средняя ошибка средней арифметической (т). Статистический анализ результатов клинических исследований проводился методом оценки доверительного коэффициента Стьюдента - L Различия считались достоверными при t=2-2,5 (р<0,05), высоко достоверными при t=>2,5 (р < 0,01) и недостоверными при t = <2 (р > 0,05). Корреляционный анализ осуществлен с использованием коэффициента корреляции Спирмена, математическая обработка данных проводилась с помощью пакета статистических программ SPSS 17.0 (допустимая ошибка Е=5%).

Молекулярная биология и репликация вируса гепатита В

Молекулярная биология вируса гепатита В. Вирус гепатита В - наименьший из всех существующих на сегодняшний день ДНК содержащих вирусов. Вирус гепатита В относится к семейству Hepadnaviridae, роду Orthohepadnavirus. Морфологически вирус гепатита В представляет собой сложную сферическую частицу (частица Дейна) диаметром 40-48 нм. Частица имеет внешнюю оболочку, которая состоит из поверхностного антигена (HBsAg), расположенного в липидном слое. Внутри оболочки размещается нуклеокапсид или ядро (core) диаметром 27 нм. В капсиде упакованы нуклеопротеиновый комплекс генома с вирусной ДНК-полимеразой, обратной транскриптазой. Нуклеокапсид HBV содержит антиген сердцевины, иммунологически идентифицируемые как соге-белок (HBcAg), [38] секретируемую растворимую часть HBcAg — так называемый «маркёр инфекционности» - (HBeAg); недостаточно изученный HBxAg; ДНК и ферменты - ДНК-полимеразу и протеинкиназу. Геном вируса гепатита В, состоящий из 3200 пар нуклеотидов (от 3020 до 3320), представлен кольцевой, частично двуцепочечной ДНК. Молекула ДНК состоит из полной, длинной минус-цепи, которая в своей двунитевой части на 5 -конце ковалентно связана с вирусной полимеразой (белковой молекулой нуклеокомплекса), и неполной, короткой плюс-цепи, на 5"-конце закреплен короткий РНК-олигомер. Кольцевая структура генома получатся благодаря спариванию комплементарных оснований нуклеотидов двух цепей. Короткая плюс-цепь ДНК составляет 50-80% от длины минус-цепи. Размер плюс-цепи составляет от 1700 до 2800 нуклеотидов [74].

С-ген- - состоит из 183-185 аминокислотных остатка, кодирует негликозилированный белок нуклеокапсида (HBcAg), состоящий из гидрофильных и заряженных аминокислот. Данный белок обладает способностью к самосборке в core-частицы, в которые по завершению цикла репликации упакована ДНК HBV. Core- ген состоит из Рге-Соге зоны, несущей информацию о секреторной форме HBcAg — HBeAg. Высокие титры HBeAg соответствуют высокой ДНК-полимеразной активности и всегда сочетаются с обнаружением полных частиц Дейна. Наличие HBeAg в крови говорит об активной репликации вируса. HBeAg не является структурным компонентом вируса. Мутации в Рге-Соге зоне приводят к снижению или полному прекращению продукции HBeAg [131].

Ген-Р - кодирует самую длинную последовательность, состоящую из 832-850 аминокислотных остатков, специфической ДНК-полимеразы, обратной транскриптазы, энхансера І. Ген Р перекрывает около 80% генома. ДНК - полимераза выполняет функцию обратной, поэтому HBV называют псевдоретровирусом. Клиническое значение мутации в Р-гене ДНК HBV, прежде всего, связано с резистентностью к лечению аналогами нуклеозидов хронического гепатита В [66].

Ген-Х - кодирует белок с небольшой молекулярной массой, состоящий из 154 аминокислотных остатков. До настоящего времени функции этого белка до конца не ясны. Вероятно, HBxAg является многофункциональным белком, принимающим участие в репликации вируса и во взаимодействии вируса с макроорганизмом. Установлено, что белок X играет также определенную роль в канцерогенезе и развитии первичного рака печени, активизирует репликацию других вирусов, в частности ВИЧ, что определяет ухудшение клинического течения у лиц с коинфекцией - гепатит В и ВИЧ-инфекция [11,16,133].

Репликация вируса гепатита В. HBV, попадая в кровь, мигрирует в печень. Репликация HBV происходит, преимущественно, в клетках печени, однако, возможна и внепеченочная репликация вируса, но с меньшей интенсивностью (в лимфоцитах, мононуклеарах, клетках поджелудочной железы, почках, селезенке, надпочечниках, коже, клетках центральной нервной системы).

При инфицировании HBV в гепатоцитах протекают параллельно два процесса: репликация вируса с экспрессией вирусных антигенов на поверхности гепатоцита, сборка и размножение новых вирионов, которые покидают клетку без ее разрушения; иммунно-опосредованное повреждение гепатоцитов. Цитолиз гепатоцитов при HBV-инфекции обусловлен не действием самого вируса, а факторами клеточного иммунитета, т.е., повреждение печени обусловлено иммунологическими реакциями макроорганизма, направленными против HBV-инфицированных клеток печени.

Адсорбция вируса к поверхности гепатоцита, происходит за счет рецепторов LHBsAg и клеточной мембраны гепатоцитов. После прикреплении вируса на поверхности гепатоцита происходит разрушение наружной оболочки вирусной частицы и нуклеокапсид проникает внутрь печеночной клетки и транспортирует ДНК HBV к ядру гепатоцита. В цитоплазме под действием ДНК-полимеразы происходит достройка одноцепочечного участка короткой плюс-цепи ДНК HBV, и к ядру «подходит» нуклеокапсид с полной 2-х цепочной ДНК. На поверхности ядерной мембраны происходит деструкция нуклеокапсида и проникновение ДНК HBV в ядро клетки. В ядре гепатоцита геном HBV под действием ферментов ядра трансформируется в ковалентно-замкнутую кольцевую ДНК (сссДНК), которая в дальнейшем служит матрицей для синтеза новых вирусных частиц. сссДНК служит матрицей для мРНК, образуется 4 копии мРНК различной длины, самая крупная - прегеномная РНК, которая отвечает за синтез HBeAg, HBcAg, ДНК-полимеразы. Кроме прегеномной РНК, в ядре происходит транскрипция коротких мРНК длиной 2,4; 2,1 и 0,7 тыс. нуклеотидов для обеспечения синтеза HBsAg в цитоплазме. Во временном капсиде, образованном под действием ДНК-полимеразы происходит обратная транскрипция мРНК с образованием минус-цепи ДНК. Затем минус-цепь выступает в роли матрицы для синтеза плюс-цепи, в результате чего образуется частично 2-х цепочная ДНК. В области эндоплазматического ретикулума клетки нуклеокапсид нового упаковывается в наружную оболочку (HBsAg), образуя новые вирионы HBV. Окончательно собранный вирион транспортируется через мембрану и выходит из клетки [17,21,100].

Естественное течение хронической HBV-инфекции

Хроническая HBV-инфекция характеризуется широким спектром клинических вариантов течения и исходов заболевания, что во многом определено взаимоотношениями иммунной системы организма и вируса.

Исследования по длительному наблюдению естественного течения хронического гепатита В показали, что после установления диагноза кумулятивная частота развития цирроза печени в течение ближайших 5 лет составляет от 8% до 20%, декомпенсация цирроза печени в последующие 5 лет — 20%, а вероятность выживаемости больного компенсированным циррозом печени в течение 5 лет — 80-86%. У пациентов с декомпенсированным циррозом печени прогноз выживаемости в течение 5 лет крайне неблагоприятен и составляет 14-35%. Ежегодная заболеваемость гепатоцеллюлярной карциномой у больных с установленным диагнозом цирроза печени в исходе хронического гепатита В составляет 2-5% и различна в ряде географических районов [43,44].

В ходе естественного течения хронической HBV-инфекции выделяют несколько фаз необязательно последовательно сменяющих друг друга. Фазы заболевания характеризуются присутствием или отсутствием в крови больного HBeAg (НВе-позитивный и НВе-негативный варианты хронического гепатита В), степенью активности АлАТ и уровнем виремии, а так же гистологической картиной заболевания: фаза иммунной толерантности, иммунноактивная фаза, состояние неактивного носительства и фаза реактивации.

Фаза иммунной толерантности регистрируемая, как правило, у молодых, инфицированных в детстве людей и длящаяся, в среднем, до 20-30 летнего возраста. У таких пациентов обнаруживаются HBeAg, HBsAg и высокий уровень ДНК HBV в сыворотке крови. При этом отсутствуют клинические симптомы заболевания, сохраняется нормальная активность АлАТ, минимальная гистологическая активность [61, 24, 83].

Фаза иммунной толерантности, переходит в иммунноактивную фазу хронического НВе-позитивного гепатита В, который, в свою очередь, может развиваться по трем сценариям.

Первый - спонтанная сероконверсия, регистрируемая у 25-50% пациентов до 40 лет и переход инфекционного процесса в фазу неактивного носительства вируса гепатита В.

Второй - продолжающееся течение хронического НВе-позитивного гепатита с высоким риском развития цирроза печени.

Третий - трансформация НВе-позитивного гепатита В в НВе-негативный хронический гепатит В вследствие развития мутаций в зоне core HBV, последующего прекращения продукции «классического HBeAg», постепенного увеличение в популяции мутантных форм HBV с последующим полным преобладанием данного варианта вируса [107].

Соответственно фазам течения хронической HBV-инфекции, формулируется диагноз у пациента в конкретный момент времени, однако необходимо учитывать, что одна фаза заболевания может переходить в другую.

В таблице №1 представлены опорные лабораторные и морфологические характеристики, позволяющие диагностировать фазу течения хронической HBV-инфекции и вариант хронического гепатита В. Таблица №1. Лабораторные показатели и морфологическая характеристика хронической HBV-инфекции в зависимости от фазы течения заболевания и НВе-статуса пациента. ФазахроническойHBV-инфекции Активность АлАТ Гистология печени Уровень ДНКВГВ HBeAg HBsAg Иммунно-толерантнаяфаза Норма илиминимальноповышена Минимальная активность, минимальный фиброз Высокий (108- 10п) копий/мл) + + HBeAg-позитивныйхроническийгв Повышена Степень активности гепатита выше минимальной с различной степенью выраженности фиброза Высокий (106- 1010 копий/мл) + + HBeAg-негативныйХГВ Повышена постоянно или носитволнообразный характер Степень активности гепатита выше минимальной с различной степенью выраженности фиброза Средний, часто волнообразный (103-1010 копий/мл) + Нактивное носительствовируса гепатита В Норма Минимальная активность гепатита или ее отсутствие, минимальный фиброз Низкий или неопределяемый + Критерии диагноза при наличии у пациента хронической HBV-инфекции. Согласно современным представлениям: критериями бессимптомного носительства вируса гепатита В является сочетание ряда признаков: персистенция HBsAg в течение 6 месяцев и более при отсутствие серологических маркеров репликации HBV (HBeAg, анти-НВсоге IgM), нормальные показатели печеночных трансаминаз, отсутствие гистологических изменений в печени или картина хронического гепатита с минимальной некрозо-воспалительной активностью (ИГА 0-3) и уровень ДНК HBV 104 копий/мл); критериями хронического гепатита В являются три основных показателя: морфология печени (индекс гистологической активности 4 и более баллов по Knodell), уровень АлАТ более нормы или волнообразно повышенный, уровень вирусной нагрузки от 104 копий/мл и выше; критериями наличия цирроза печени в исходе ХГВ является морфологическая характеристика биоптата печени (фиброз 4 стадии) или клинико-лабораторная картина цирроза печени (наличие вторичных печеночных знаков, тромбоцитопения, активность АсАТ превышающая АлАТ, снижение альбумина крови менее нормы), наличие портальной гипертензии, подтвержденной данными УЗИ (расширение портальной или селезеночной вены) и ЭГДС (варикозное расширение вен пищевода) [39,86]. Внесение уровня вирусной нагрузки HBV в критерии диагноза у больных хронической HBV-инфекцией обусловлено многочисленными исследованиями, продемонстрировавшими, что, как правило, низкий уровень виремии коррелирует с нормальными или незначительно измененными показателями гистологии печени и, напротив, у пациентов с уровнем виремии 104 копий/мл редко регистрируется гепатит минимальной активности, как необходимое условие диагноза «неактивное носительство HBV». Примером таких исследований может служить работа Zacharakis GH. с соавторами (2005 г.) по долгосрочному наблюдению HBsAg-позитивных лиц в популяции северной Греции. Под наблюдением находилось 263 пациента в возрасте от 20 до 65 лет (средний возраст — 34 года) в течение 2-12 лет (в среднем, 5 лет). Биопсия печени выполнялась в начале исследования и затем каждые 2-4 года. Уровень виремии определялся каждые 12 месяцев, а активность АлАТ каждые 6 месяцев. HBeAg-негативные пациенты составляли 94,7%. Неактивные носители HBsAg составили 50,3% пациентов исследуемой когорты, средний уровень виремии в данной группе - 2.6 х 10 копий/мл. У 97% неактивных носителей HBsAg, у которых по результатам биопсии печени отсутствовали или были минимальными гистологические изменения, сохранялись постоянно нормальные показатели АлАТ, уровень вирусной нагрузки регистрировался ниже 104 копий/мл, на протяжении всего периода наблюдения (от 4 до 12 лет). У 2% неактивных носителей HBsAg регистрировалась реактивация процесса (у всех уровень виремии был 10 копий/мл перед включением в исследование) [138].

Как известно, сочетание ряда факторов — неопределяемый уровнь виремии, нормальные показатели АлАТ, а также минимальная активность гепатита, позволяет считать пациента неактивным носителем вируса гепатита В [39,84,86]

В исследовании Hsu Y S. et al. было показано, что для неактивных носителей HBsAg в отличие от пациентов с активной репликацией вируса гепатита В не характерно прогрессирующее поражение печени. В исследование было включено 283 неактивных носителя HBsAg. В течение 9 летнего периода наблюдения у 189 (67%) сохранялась постоянно нормальная активность трансаминаз в биохимическом анализе крови и лишь у одного пациента за этот период наблюдения сформировался цирроз печени. У 94 (33%) пациентов отмечено повышение уровня АлАТ больше двух норм, обусловленное у 4% пациентов реверсией анти-НВе/HBeAg, у 24% человек повышение уровня АлАТ обусловлено HBeAg-негативным ХГВ и у 5% пациентов причина была неясна [62].

Под воздействием иммуносупрессии пациент из статуса неактивного носительства HBsAg может перейти в фазу реактивации HBV-инфекции и в этом случае вновь будет диагностирован хронический НВе-негативный гепатит В с высоким уровнем виремии, повышенной активностью АлАТ и гистологически подтвержденным активным гепатитом. В отдельных случаях возможна реверсия анти-HBe/HBeAg и диагноз больного будет вновь формулироваться как НВе-позитивный гепатит В.

Клиническая характеристика пациентов с хронической HBV- моноинфекцией

Как видно из таблицы 1, среди пациентов преобладали лица в возрасте до 30 лет (40,3%) и старше 50 лет (32,7%). При анализе эпидемиологического анамнеза пациентов были получены следующие данные: - 36 пациента (21%) указывали на наличие в анамнезе медицинских парентеральных манипуляций (оперативные вмешательства, эндоскопические методы обследования); - 7 больных (4,1%) указывали на переливание крови в анамнезе; - у 13 (7,6%о) пациентов HBsAg в крови выявлен при обследовании по контакту с HBsAg-позитивными родственниками (братом, мамой, женой); - у 10 (5,9%) пациентов был профессиональный контакт с кровью; - у 1 (0,6%) из 171 пациентов в анамнезе в/в употребление наркотических средств; - у 104 (60,8%) из 171 пациента в течение жизни не было хирургических, эндоскопических методов обследования, однако, какие-либо малоинвазивные парентеральные манипуляции в течение жизни отмечали все пациенты. Данные эпидемиологического анамнеза пациентов с хронической HBV моноинфекцией представлены на рисунке 1. ? в/в введение наркотиков ? оперативные вмешательства, эндоскопические методы обследования ? гемотрансфузии внутрисемейные контакты с инфицированными лицами мелкие парентеральные манипуляции 2 профессиональный контакт с кровью

Из 171-го пациента с хронической HBV-моноинфекцией длительность заболевания была точно известна у 8 (4,7%) больных, перенесших острый вирусный гепатит В в различном возрасте от первого года жизни до 44 лет. У 163 (95,3%) пациентов HBsAg в сыворотке крови выявлен при амбулаторном и стационарном обследовании по поводу заболеваний, не связанных с патологией печени, в женской консультации (во время беременности), при прохождении диспансеризации, при обследовании доноров крови, а также при появлении тяжести в правом подреберье. Длительность обнаружения HBsAg в крови у пациентов с хронической HBV-моноинфекцией на момент включения в исследование представлена в таблице 2.

Как видно из представленной таблицы, подавляющее большинство пациентов (141/171, 82,4%) с хронической HBV-моноинфекцией составили лица с давностью выявления HBsAg в крови от года до 10 лет, среди них преобладали пациенты с давностью выявления HBsAg в крови до 5 лет (90/141,63,8%).

Сопутствующие заболевания регистрировались у 99 (57,9%) из 171 пациента с хронической HBV-моноинфекцией, среди них у 49 (49/99, 49,5%) человек выявлено более одного сопутствующего заболевания. Два (1,2%) пациента из 171 указывали на злоупотребление алкоголем в прошлом.

Данные о сопутствующих заболеваниях 99 пациентов с хронической HBV-моноинфекцией представлены в таблице 3. Таблица З Сопутствующие заболевания у пациентов с хронической HBV-инфекцией.

Заболевания Количество пациентов(п) Пищеварительной системы: хронический гастрит, хронический гастродуоденит, язвенная болезнь 12 перстной кишки, хронический колит, синдром Жильбера, дискинезия желчевыводящих путей, ахолазия пищевода, резекция желудка. 54

Сердечно-сосудистой системы: ИБС, атеросклеротический кардиосклероз, постинфарктный кардиосклероз, полная поперечная блокада (установлен кардиостимулятор), артериальная гипертензия, пролапс митрального и трикуспидального клапана 1 ст. без регургитации, нарушение ритма, варикозная болезнь вен нижних конечностей. 34

Мочеполовой системы: мочекаменная болезнь, хронический простатит, нефрит, гломерулонефрит, хронический пиелонефрит, аднексит, хронический сальпингоофори т, миома матки, бесплодие,эндометриоз. 26

Дыхательной системы и ЛОР-органов: хронический бронхит, хронический тонзиллит, хронический синусит, искривление носовой перегородки, тугоухость 3-4 ст., бронхиальная астма, инфекционно-зависимая форма. 9

Эндокринной системы: сахарный диабет 2 типа, диабетическая полинейропатия, узел правой доли щитовидной железы, ожирение, диффузный токсический зоб. 15

Нервной системы: синдром дисфункции вегетативной нервной системы, вегето-сосудистая дистония, эпилепсия. 6

Опорно-двигателыюй системы: остеохондроз, ревматоидный артрит. 9 Кожи: дерматит 1 Клинические проявления вирусного гепатита В у больных хронической HBV-моноинфекцией были весьма скудными. При первичном обращении в гепатологическии центр и в стационар состояние всех пациентов данных групп было удовлетворительным.

Жалобы на момент первичного выявления HBsAg в крови были у 12,3% (21/171) пациентов. Среди жалоб у 62% (13/21) больных с ХГВ преобладали проявления диспепсического синдрома, из них у 2 (15,4%) человек - тошнота, у 4 (30,8%) - дискомфорт в эпигастрии, у 7 (53,8%) -тяжесть и дискомфорт в правом подреберье; слабость и быстрая утомляемость - у 6 (28,6%) пациентов, артралгии - у 2 (9,5%) больных. У 9 (69,2%) из 13 пациентов с проявлениями диспепсического синдрома (тошнота, дискомфорт в эпигастрии, тяжесть и дискомфорт в правом подреберье) были сопутствующие заболевания, связанные с патологией пищеварительной системы (хронический гастрит, хронический гастродуоденит, язвенная болезнь 12-перстной кишки), которыми могли быть обусловлены вышеперечисленные жалобы. Боли в суставах у одного пациента были связаны с сопутствующим ревматоидным артритом. При сборе анамнеза два пациента указали на злоупотребление алкоголем.

Жалобы на момент включения в исследование регистрировались у 9,9% (17/171) пациентов: у 8 (47%) пациентов слабость, у 6 (35,3%) -проявления диспепсического синдрома (ноющие боли и тяжесть в правом подреберье, снижение аппетита, периодически вздутие живота), у одного (5,9%о) - артралгии, у 2-х (11,8%) больных - сухость и зуд кожи.

Среди пациентов, у которых при динамическом обследовании в нашем исследовании диагностирован ХГВ с исходом в цирроз печени, у 2-х человек были проявления отечно-асцитического и астенического синдрома, в связи с чем в состоянии средней тяжести они были госпитализированы для последующего стационарного лечения.

Группа пациентов с хроническим гепатитом В, обследованных однократно

Среди пациентов, включенных в исследование, 94 (57%) из 165 человек были обследованы в динамике заболевания трёхкратно с интервалом 6 месяцев, среди них - 78 больных ХГВ и 16 «неактивных носителей» вируса гепатита В.

Среди пациентов, обследованных трехкратно, 9 из 94 (9,6%) человек за несколько лет (от 2 до 15 лет) до включения в исследование получали противовирусную терапию. У 2 (22,2%) из 9 пациентов на фоне терапии (препаратами ИФН-ряда и аналогами нуклеозидов) достигнут биохимический и вирусологический ответ, что так же подтверждается результатами трехкратного динамического обследования с интервалом 6 месяцев, выполненного в рамках настоящего исследования. У остальных 7 (77,8%о) из 9 пациентов противовирусная терапия не позволила достичь авиремии и нормальных биохимических показателей крови. Из 7 пациентов, не ответивших на противовирусное лечение, три человека последовательно получали препараты ИФН-ряда и аналоги нуклеозидов, 4-м пациентам проводилась терапия реафероном. В процессе настоящего исследования 5,3% пациентам (5/94), обследованных трехкратно, противовирусная терапия была назначена после первичного обследования на УВН HBV в крови, по результатам нескольких биохимических анализов крови, УЗИ печени, ПБП и/или транзиентной фиброэластографии при включении в настоящее исследование. Средний возраст пациентов составил 46+5,2 лет (30-56 лет), преобладали мужчины -80% (4/5). Критерии для назначения противовирусной терапии у 5 больных ХГВ, которым лечение было назначено после однократного обследования, были следующими: повышение АлАТ в биохимическом анализе крови (среднее значение АлАТ - 147,2±45 мкмоль/мин.л (колебания от 46 до 240 мкмоль/мин.л)); высокий УВН НВV в крови (ДНК НВV 105 копий/мл); гистологическая картина активного гепатита (у одного пациента была выполнена ПБП (ИГА 8 баллов, F=2 по METAVIR). У 3-х пациентов с уровнем АлАТ 119,66±73Д8 мкмоль/л.мин. (от 46 до 238 мкмоль/л.мин.)) была выполнена транзиентная фиброэластография печени (средние показатели фиброэластографии составили 7,93 кПа (7,1-8,9 кПа), что соответствует F-2 по METAVIR).

В целом, трехкратно с интервалом 6 месяцев, без учета 2-х больных, ответивших на противовирусное лечение, проводимое за несколько лет до включения в исследование, и пяти пациентов, которым лечение было назначено после получения результатов однократного исследования, было обследовано 87 человек. Из них, как было сказано выше, на основании клинико-лабораторных данных была выделена группа неактивных носителей вируса гепатита В (18,4%, 16/87). На рисунке 6 представлена доля лиц с неопределяемым УВН HBV в крови среди больных ХГВ (2 группа) и доля лиц, у которых результаты трехкратного клинико-лабораторного обследования позволили диагностировать «неактивное носительство» вируса гепатит В.

Дальнейший анализ клинико-лабораторных данных выполнялся на группе из 71 больного ХГВ (после исключения «неактивных носителей» вируса гепатита В, 87-16=71). Среди них было 36 (50,7%) мужчин и 35 (49,3%о) женщин, средний возраст пациентов данной подгруппы составил 40,2Ш,89 лет (от 17 до 70 лет).

Среди больных ХГВ, обследованных трехкратно, при включении в исследование преобладали (91,5%, 65/71) больные HBeAg-негативным хроническим гепатитом В и лишь у 6 (8,5%) человек диагностирован HBeAg-позитивный ХГВ. Среди больных HBeAg-позитивным ХГВ у 3-х (50%) пациентов при динамическом обследовании определялся HBeAg в крови, у 2-х (33,3%) пациентов произошла спонтанная сероконверсия HBeAg-/aHra-НВе+, нормализовались показатели АлАТ и АсАТ в крови, ДНК HBV в крови не определялась. У одной (16,7%, 1/6) пациентки HBeAg-позитивный ХГВ трансформировался в HBeAg-негативный ХГВ, с постоянно высоким УВН HBV в крови (далее результаты исследования данной пациентки учитывались в группе больных НВе-негативным ХГВ (65+1=66)). Среди HBeAg-позитивных больных ХГВ у 2-х пациентов был постоянно высокий УВН HBV в крови ( 105 копий/мл), у одного пациента - волнообразный УВН HBV в крови (колебания в пределах 104 -1010 копий/мл).

Как видно из представленной таблицы, среди пациентов с HBeAg-негативным ХГВ, обследованных трехкратно, фактически с одинаковой частотой встречались больные с неопределяемым и постоянно низким УВН HBV в крови (59,8%) и пациенты с волнообразным и постоянно высоким УВН HBV в крови (40,9%). Доля пациентов с HBeAg-негативным ХГВ с постоянно высоким УВН ДНК HBV в сыворотке крови составила лишь 10,6%, (7 из 66), в 86% (6/7) случаев постоянно высокий УВН регистрировался на фоне повышенной активности АлАТ.

Был осуществлен корреляционный анализ активности АлАТ и УВН ДНК HBV в образцах крови с максимальным уровнем виремии. Анализ сопоставления результатов выявления УВН ДНК HBV в крови и активности АлАТ у больных ХГВ, обследованных трехкратно, показал, что существует прямая корреляционная зависимость между уровнем АлАТ и уровнем виремии HBV (г=0,385, р=0,008).

Похожие диссертации на Клинические значение динамического определения уровня вируснойнагрузки у больных с различными вариантами хронической HBV - инфекции.

Клинико-эпидемиологические и иммунологические особенности различных вариантов течения HBV-инфекцииОсиновец Ольга Юрьевна

Клиническое значение определения уровня оксида азота в выдыхаемом воздухе при бронхиальной астме у детейЦыпленкова Светлана Эвальдовна

Хроническая HBV-инфекция: молекулярно-генетические методы диагностики, оптимизирующие тактику ведения пациентовДудина, Кристина Рубеновна

Клинико-лабораторная характеристика естественного течения неактивной формы хронической HBV-инфекцииБешимова Диляра Тальгатовна

Эффективность профилактики HBV-инфекции у детей с первичным хроническим гломерулонефритомЗробок Ольга Исофатовна

Профилактика и лечение возвратных вирусных инфекций после ортотопической аллотрансплантации печени у больных циррозом печени HBV- и HCV-этиологииКозлова, Алевтина Владимировна

Клиническое значение вирусных инфекций в развитии тубулоинтерстициальных нефропатий у детейАнтонова, Елена Борисовна

Ротавирусная инфекция у детей: значение изменений маркеров метаболической активности анаэробной микрофлоры кишечникаКоган Наталья Васильевна

Характеристика иммунного ответа у больных с герпетической инфекцией и ее значение в прогнозировании течения болезниСвинцова, Татьяна Александровна

Патогенетическое значение персистирующей вирусной инфекции при гломерулонефрите у детей в обосновании противовирусной и иммуномодулирующей терапииДлин, Владимир Викторович