Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные подходы к диагностике и коррекции врожденной дисфункции коры надпочечников (обзор литературы) 18
1.1. Роль скрининговых программ в изучении эпидемиологии наследственных заболеваний. Скрининг на врожденную дисфункцию коры надпочечников 19
1.2. Стероидный биосинтез в женском организме. Клинико-гормональная и молекулярно-генетическая диагностика недостаточности 21-гидроксилазы 26
1.3. Значение адреналовой гиперандрогении в формировании репродуктивных нарушений у женщин 32
1.4. Особенности метаболизма андрогенов в период гестации. Терапевтическая коррекция гиперандрогении у беременных 36
1.5. Влияние глюкокортикоидной терапии в период гестации на психо-соматическое здоровье детей 41
Глава 2. Клиническая характеристика групп пациентов, методы исследования 47
2.1. Дизайн и построение исследования 47
2.2. Методы исследования 59
2.3. Методы статистического анализа 65
Глава 3. Эффективность программы массового скрининга новорожденных в изучении эпидемиологии дефицита 21 -гидроксилазы 67
3.1. Неонатальный скрининг на классическую форму недостаточности 21-гидроксилазы 68
3.2. Особенности развития детей первого года жизни с транзиторным повышением неонатального 17-гидроксипрогестерона 75
Глава 4. Эффективность программы селективного скрининга беременных в изучении эпидемиологии дефицита 21-гидроксилазы 85
4.1 .Особенности метаболизма дегидроэпиандростерон-сульфата у беременных женщин 85
4.2. Особенности метаболизма 17-гидроксипрогестерона у беременных женщин 94
4.3. Предикторная роль метаболитов стероидного синтеза в формировании андрогензависмых осложнений беременности 100
4.3.1. Оценка влияния высоких концентраций ДГЭА-С на течение беременности 101
4.3.2. Оценка влияния высоких концентраций 17-ОНР на течение беременности 105
Глава 5. Оценка нормативных значений маркеров гиперандрогении надпочечникового генеза у лиц женской популяции 111
5.1. Возрастная динамика секреции ДГЭА-С в женской популяции 114
5.2. Особенности циклической секреции 17-ОНР у лиц женской популяции 120
Глава 6. Дифференциальная диагностика адреналовои гиперандрогении в популяции беременных 125
6.1. Определение нормативных значений 17-ОНР и ДГЭА-С у
женщин с физиологической беременностью 125
6.2. Дифференциальная диагностика различных вариантов гиперандрогении в период гестации 128
6.3. Клиническое обоснование разработанных нормативных величин маркеров надпочечниковой гиперандрогении у беременных женщин 136
Глава 7. Эффективность глюкокортикоиднои терапии у беременных женщин с высоким уровнем маркеров адреналовой гиперандрогении 146
Глава 8. Особенности развития детей от матерей, получавших глюкокортикоидную терапию в период гестации 154
8.1. Особенности течения перинатального периода у детей от матерей с высоким уровнем маркеров адреналовой гиперандрогении во время беременности 155
8.2. Комплексная оценка состояния здоровья детей раннего возраста от матерей, получавших глюкокортикоидную
терапию во время гестации 170
8.2.1 Особенности физического развития и соматического статуса детей раннего возраста 171
8.2.2. Оценка параметров нервно-психического развития детей раннего возраста 175
Глава 9. Оценка методов диагностики неклассической формы недостаточности 21-гидроксилазы в женской популяции 181
9.1. Клинико-гормональные методы диагностики неклассической формы ВДКН у женщин вне гестации 181
9.2. Молекулярно-генетическая диагностика неклассической формы дефицита 21 -гидроксилазы 185
9.3. Значимость биохимических маркеров врожденной ферментопатии для диагностики заболевания в период гестации 190
Заключение 196
Выводы 224
Практические рекомендации 227
Список литературы 229
- Значение адреналовой гиперандрогении в формировании репродуктивных нарушений у женщин
- Методы исследования
- Особенности развития детей первого года жизни с транзиторным повышением неонатального 17-гидроксипрогестерона
- Оценка влияния высоких концентраций ДГЭА-С на течение
Введение к работе
Актуальность темы
На протяжении последнего десятилетия демографическая ситуация в России характеризуется устойчивым отрицательным коэффициентом естественного прироста Помимо социальных причин снижения рождаемости в стране, весомой медицинской проблемой является проблема бесплодного брака, в структуре которого на долю эндокринных заболеваний приходится от 28% до 40% [Ляшко Е С , 2000, Балаболкин М И, 2002]
«Визитной карточкой» эндокринного неблагополучия женской репродуктивной системы чаще всего является гиперандрогения -патологическое состояние, обусловленное изменением секреции и метаболизма андрогенов или повышенной чувствительностью тканей к нормальному уровню андрогенов Удельный вес бесплодия, обусловленного гиперандрогенией, в структуре женской инфертильности составляет более 20%, а риск репродуктивных потерь в случае наступления беременности - до 73% [Абдурахманова Р А, 2000]
Наиболее частой причиной гиперандрогении надпочечникового генеза является врожденная дисфункция коры надпочечников (ВДКН) - группа заболеваний с аутосомно-рецессивным типом наследования, в основе которых лежат различные ферментативные дефекты биосинтеза стероидных гормонов надпочечников
ВДКН является наиболее распространенной врожденной патологией надпочечников, 95% составляют лица с дефектом фермента 21-гидроксилазы В мире средняя частота классической формы 21-гидроксилазной недостаточности колеблется от 1 5000 до 1 20000 новорожденных и составляет в среднем 1 14000 в популяции Однако в отдельных этнических группах распространенность данной патологии значительно выше так, у эскимосов она составляет 1 490 новорожденных [Дедов ИИ, 2000, Migeon С J, 2001, Speiser Р W , 2001, Glatt К , 2005, Merke D P, 2005]
Программа неонатального скрининга дефицита 21-гидроксилазы, как одного из наиболее частых наследственных заболеваний, разработана и внедрена более чем в 30 странах мира с целью ранней доклинической диагностики состояния, сопровождающегося тяжелыми метаболическими нарушениями, создающими в отсутствие своевременной патогенетической терапии серьезную угрозу жизни новорожденного [Петеркова В А , 2003, Saedi S , 1996, Brosnan Р G, 1999, Cordova R A , 1999, Therrell В L , 2001, Paul D A , 2004, Vhet GV, 2004] В России неонатальный скрининг 21-гидроксилазной недостаточности повсеместно внедрен с июня 2006 года До настоящего времени публикации результатов неонатального скрининга классической формы дефицита 21-гидроксилазы, данные о частоте заболевания в регионах России отсутствуют
В последнее десятилетие значительно возрос интерес к неклассическим формам ВДКН ввиду значительно более высокой их распространенности в
популяции (от 0,1% до 3,3%) и негативного влияния на репродуктивную функцию женского организма [Balsamo А , 1996, Tajima Т , 1998, Gudmundsson К, 1999, Dewailly D, 2002, Loke KY, Tan IT, 2002] Важным звеном в решении проблемы нарушения фертильносте и обеспечении оптимального терапевтического подхода к лечению является определение диагностических критериев неклассических форм ВДКН и их дифференциальная диагностика с другими видами гиперандрогении
До начала 90-х годов диагностика неклассических форм 21-гидроксилазного дефицита основывалась на крайне вариабельных клинических проявлениях и биохимических исследованиях активности ферментной системы стероидогенеза Совершенствование методов молекулярно-генетического анализа расширяют возможности верификации стертых форм заболевания, позволяют проводить пренатальную диагностику дефицита 21-гидроксилазы, прогнозировать течение заболевания На сегодняшний день описано около 60 мутаций в гене CYP21, кодирующем фермент 21-гидроксилазу, 12 наиболее частых мутаций в Европейской популяции определены среди Российского населения [Осиновская Н С , 2000, Dam L В , 2002, Hughes 1, 2002, Nestler J Е , 2002, Tukel Т , 2003, Baumgartner-Parzer S M , 2003, Nike M , 2003, Cunha H M, 2004] Однако сведения о наиболее характерных мутациях гена CYP21 при неклассических формах ВДКН в Российской популяции представлены в единичных публикациях
Появление новых исследований в области стероидного биосинтеза в период гестации позволяют по-новому взглянуть на проблему гиперандрогении у беременных женщин Необходимость предотвращения репродуктивных потерь в ранние сроки гестации, профилактика осложнений течения беременности, забота о рождении здорового ребенка ставят перед врачом задачи своевременной диагностики различных вариантов гиперандрогении у беременных, выбора оптимального и безопасного метода терапевтической коррекции заболевания В отечественной литературе не представлены сведения о результатах группового скрининга неклассической формы дефицита 21-гидроксилазы у беременных, отсутствуют данные об эффективности проводимой патогенетической терапии Литературные данные о состоянии здоровья новорожденных и детей от матерей, получавших супрессивную глюкокортикоидную терапию во время беременности, носят противоречивый характер
Цель исследования определить распространенность врожденной дисфункции коры надпочечников в популяции Западно-Сибирского региона с использованием программ массового и селективного скрининга и разработать систему диагностики различных форм дефицита фермента 21-гидроксилазы, направленную на сохранение репродуктивного и соматического здоровья женского и детского населения
Задачи исследования
Оценить результаты неонатального скрининга на врожденную дисфункцию коры надпочечников по данным г Тюмени и определить частоту классической формы дефицита 21-гидроксилазы в Тюменской популяции новорожденных
Разработать референтные интервалы уровня неонатального 17-гидроксипрогестерона с учетом срока гестации и массы новорожденных для оптимизации программы неонатального скрининга и снижения экономических затрат на проведение ретестов
Изучить факторы, оказывающие влияние на транзиторное повышение концентрации 17-гидроксипрогестеронав период новорожденности
Оценить диагностическую значимость скрининга неклассической формы дефицита 21-гидроксилазы у беременных и определить биохимические маркеры для дифференциальной диагностики источника гиперандрогении в период гестации
Разработать референтные интервалы уровней патогенетического маркера недостаточности 21-гидроксилазы — 17-гидроксипрогестерона (17-ОНР) и адреналового андрогена дегидроэпиандростерон-сульфата (ДГЭА-С) для женской популяции Западно-Сибирского региона
Разработать референтные интервалы биохимических маркеров адреналовой и овариальной гиперандрогении для беременных женщин с учетом особенностей стероидного синтеза в период гестации
Оценить значимость клинических и гормональных маркеров гиперандрогении в диагностике неклассической формы ВДКН у женщин вне гестации
Определить диагностическую ценность стимуляционной пробы с синтетическим аналогом АКТГ продленного действия для верификации неклассической формы недостаточности 21-гидроксилазы у женщин вне гестации
Определить наиболее характерные мутации гена CYP21 при неклассической форме дефицита 21-гидроксилазы и оценить генотип-фенотипическую корреляцию при неклассической форме ВДКН в женской популяции Западно-Сибирского региона
Оценить клинико-гормональные особенности течения периода адаптации у новорожденных и развитие детей раннего возраста, родившихся от матерей, получавших глюкокортикоидную терапию в период гестации
Научная новизна исследования
Впервые в России проведен анализ результатов программы массового скрининга новорожденных на врожденную дисфункцию коры надпочечников методом определения концентрации 17-гидроксипрогестерона в сыворотке крови Впервые по данным неонатального скрининга определена частота классической формы дефицита 21-гидроксилазы в Тюменской популяции новорожденных
Доказаны достоверные различия уровней неонатального 17-гидроксипрогестерона в зависимости от массы тела новорожденного и срока гестации Полученные данные использованы при разработке норматива содержания 17-гидроксипрогестерона для недоношенных новорожденных и детей с низкой массой тела при рождении
Впервые изучено влияние фактора родового стресса на преходящие изменения стероидного синтеза, отражением которых является транзиторное повышение уровня неонатального 17-гидроксипрогестерона при нормальной активности фермента 21-гидроксилазы
Впервые в России проведен анализ результатов селективного скрининга беременных женщин на неклассическую форму недостаточности фермента 21-гидроксилазы методом определения концентрации дегидроэпиандростерон-сульфата и 17-гидроксипрогестерона Установлено, что интерпретация данных скрининга без учета особенностей стероидного синтеза в период гестации способствует гипердиагностике врожденной ферментопатии у беременных
Впервые проведена оценка влияния супрессивной глюкокортикоидной терапии на угрозу невынашивания беременности у женщин с повышенным уровнем дегидроэпиандростерон-сульфата
Впервые проведена комплексная оценка состояния здоровья новорожденных и детей раннего возраста от матерей, получавших глюкокортикоидную терапию в период гестации
Впервые исследована возрастная динамика маркеров адреналовой
гиперандрогении в женской популяции Западно-Сибирского региона
Полученные данные использованы при разработке показателей региональной
динамической нормы содержания 17-гидроксипрогестерона и
дегидроэпиандростерон-сульфата в сыворотке крови для женской популяции от раннего возраста до периода менопаузы
Впервые исследована динамика биохимических маркеров адреналовой и овариальной гиперандрогении в период гестации Полученные данные использованы при разработке показателей динамической нормы содержания 17-гидроксипрогестерона, дегидроэпиандростерон-сульфата, тестостерона и сексстероидсвязывающего глобулина с определением индекса свободного тестостерона для первого триместра гестации
В исследовании определена эффективность и чувствительность гормональной пробы с синтетическим аналогом АКТГ пролонгированного действия для диагностики неклассической формы недостаточности 21-гидроксилазы у женщин вне гестации
Впервые определены наиболее характерные мутации гена CYP21 при неклассической форме дефицита 21-гидроксилазы в женской популяции Западно-Сибирского региона Проведена генотип-фенотипическая корреляция у женщин группы риска по неклассической форме дефицита фермента 21-гидроксилазы
Практическая значимость
Доказана высокая эффективность, чувствительность и специфичность метода массового скрининга новорожденных для ранней доклинической диагностики врожденной дисфункции коры надпочечников Обоснована возможность применения метода неонатального скрининга для определения распространенности недостаточности 21-гидроксилазы в популяции Определены значительные расхождения данных о распространенности классической формы врожденной дисфункции коры надпочечников, рассчитанной по показателям заболеваемости детского населения, с данными о распространенности врожденной ферментопатии в популяции новорожденных
Определены референтные интервалы уровня неонатального 17-гидроксипрогестерона у недоношенных детей и новорожденных с низкой массой тела для снижения количества ложноположительных результатов обследования, а следовательно, и финансовых затрат на проведение ретестов Доказана зависимость транзиторного повышения уровня 17-гидроксипрогестерона у новорожденных с неврологическими нарушениями в раннем неонатальном периоде
При комплексной оценке состояния здоровья детей раннего возраста, родившихся от матерей, получавших супрессивную глюкокортикоидную терапию дексаметазоном во время гестации, не выявлено отклонений параметров физического и нервно-психического развития в исследуемый возрастной период Однако возможное влияние неблагоприятных факторов перинатального периода на организм в критические фазы его развития определяет необходимость динамического наблюдения за данной группой пациентов
Для оптимизации диагностики неклассической формы дефицита 21-гидроксилазы в женской популяции впервые разработаны референтные интервалы уровней 17-гидроксипрогестерона и дегидроэпиандростерон-сульфата с учетом возраста и фазы менструального цикла
Обоснована необходимость определения региональной динамической нормы 17-ОНР и ДГЭА-С для беременных женщин с учетом особенностей стероидогенеза в период гестации Разработаны и внедрены в клиническую практику референтные интервалы маркера дефицита 21-гидроксилазы - 17-гидроксипрогестерона и маркера адреналовой гиперандрогении дегидроэпиандростерон-сульфата для первого триместра беременности
Для дифференциальной диагностики различных вариантов гиперандрогении и выбора патогенетической терапии разработаны и внедрены в клиническую практику референтные интервалы тестостерона, сексстероидсвязывающего глобулина и индекса свободного тестостерона для беременных
Разработан алгоритм диагностики неклассической формы недостаточности 21-гидроксилазы в женской популяции Для верификации заболевания определены диагностические значения 17-гидроксипрогестерона
после стимуляции гормональной секреции синтетическим аналогом АКТГ пролонгированного действия
Обоснована необходимость проведения молекулярно-генетического анализа с детекцией мутаций в гене CYP21 для верификации врожденной ферментопатии у женщин с сомнительными результатами стимуляционной пробы с синтетическим аналогом АКТГ пролонгированного действия вне гестации, а также в качестве стандарта диагностики неклассической формы недостаточности 21-гидроксилазы у женщин во время беременности
Формирование базы данных мутаций гена CYP21 в тюменской популяции позволит определить подходы к диагностике врожденной ферментопатии у детей от матерей с неклассической формой заболевания
Положения, выносимые на защиту
Массовый неонатальный скрининг недостаточности фермента 21-гидроксилазы является эффективным методом доклинической диагностики заболевания и оценки распространенности врожденной ферментопатии в популяции Частота классической формы недостаточности 21-гидроксилазы, рассчитанная по показателям заболеваемости детского населения, в 3 раза ниже истиной распространенности заболевания, определенной по данным скрининга новорожденных
Использование глюкокортикоидной терапии у беременных женщин с высокой концентрацией 17-гидроксипрогестерона и дегидроэпиандростерон-сульфата не оказывает значимого влияния на течение процессов адаптации новорожденных и показатели развития детей в возрасте до трех лет Возможные последствия тех или иных событий перинатального периода, проявляющиеся на различных этапах онтогенеза, определяют необходимость динамического наблюдения за данной группой пациентов в критические периоды развития детского организма
Метод селективного скрининга беременных женщин на неклассическую форму недостаточности фермента 21-гидроксилазы с использованием показателей дегидроэпиандростерон-сульфата и 17-гидроксипрогестерона обладает низкой эффективностью для диагностики заболевания и не позволяет оценить распространенность врожденной ферментопатии в группе потенциального риска Для верификации диагноза в период гестации следует применять метод молекулярно-генетического анализа с детекцией мутаций в гене CYP21
Использование метода молекулярно-генетического анализа в комплексном обследовании пациенток с репродуктивными нарушениями способствует диагностике неклассической формы недостаточности фермента 21-гидроксилазы и определению тактики терапии, направленной на сохранение здоровья матери и рождение здорового потомства
Апробация результатов исследования
Материалы диссертации представлены на областной научно-практической конференции «Клиническая эндокринология достижения и перспективы», на научно-практической конференции «Актуальные вопросы внутренних болезней» в рамках Международного симпозиума «Медицина и охрана здоровья» (Тюмень, 2004), на терапевтическом форуме «Актуальные вопросы диагностики, лечения и профилактики наиболее распространенных заболеваний внутренних органов», на заседании Тюменского отделения Научного общества специалистов клинической лабораторной диагностики (Тюмень, 2005), на региональной научно-практической конференции «Детская и подростковая эндокринология перспективы и пути развития» (Омск, 2005 ), на «Национальных Днях лабораторной медицины России» (Москва, 2005), на I съезде терапевтов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 2005), на региональной научно-практической конференции акушеров-гинекологов (Тюмень, 2006), на III Всероссийской научно-практической конференции «Достижения науки - в практику детского эндокринолога» (Москва, 2006), на V Всероссийском конгрессе эндокринологов «Высокие медицинские технологии в эндокринологии» (Москва, 2006)
Внедрение результатов работы
Результаты исследования внедрены в работу многопрофильной клиники ГОУ ВПО ТюмГМА Росздрава, ГЛПУ Тюменская областная клиническая больница, ЗАО «Алкор Био» (г Санкт-Петербург), ЗАО «ДРГ Техсистемс» (г Москва) Используются в учебно-педагогической работе кафедр педиатрии и терапии ФПК и ППС с курсом эндокринологии ГОУ ВПО ТюмГМА Росздрава
Публикации
По теме диссертации опубликовано 35 печатных работ в центральной и местной печати, в том числе 10 в рецензируемых ВАК журналах, 2 учебных пособия для врачей (утверждены УМО-53 по медицинскому и фармацевтическому образованию ВУЗов России 1 февраля 2005 г), 1 монография
Объем и структура работы
Значение адреналовой гиперандрогении в формировании репродуктивных нарушений у женщин
Понятие эпидемиологии неинфекционных заболеваний включает в себя применение эпидемиологических методов для изучения распространенности различных соматических заболеваний человека. Одним из таких методов является скрининг (от лат. screening - просеивание) - одномоментное обследование всего или части (контингента, коллектива) населения с целью выявления определенного заболевания [16, 75, 78].
Основным требованием для любого скринирующего обследования, помимо наличия подготовленного персонала, является стандартный подход к выявлению изучаемого признака и оценке полученных результатов. Особо следует обратить внимание на критерии отбора скрининговых тестов, которые должны быть недорогостоящими, легко осуществимыми, стандартными и достоверными [75, 78].
Эффективность применяемых скрининговых тестов оценивается как отношение количества правильных результатов обследования к общему количеству исследований. Оптимальным является, когда тест совмещает в себе все эти качества и обеспечивает высокую чувствительность и специфичность, приближающуюся к 100% [76, 159, 209, 234]. Чувствительностью называется вероятность получения положительного результата при обследовании лиц, имеющих определенный признак (заболевание, носительство). Чем выше чувствительность теста, тем меньше количество ложноположительных результатов, и наоборот. Под специфичностью понимается вероятность получения отрицательного результата при обследовании лиц, не имеющих определенного признака (заболевание, носительство). Соответственно чем выше специфичность теста, тем меньше количество ложноотрицательных результатов. Важной характеристикой тестов является прогностическая ценность, т.е. вероятность выявления лиц с искомым заболеванием среди всех обследованных. Различают прогностическую ценность как положительных, так и отрицательных результатов исследования. Прогностическая ценность положительного результата - вероятность заболевания (или искомого признака) при положительном (или патологическом) результате теста, отрицательного -вероятность отсутствия его при отрицательном (или нормальном) результате тестирования [75, 76, 78].
Подразделение скрининга на монопрофильный и многопрофильный происходит в зависимости от исследования эпидемиологической ситуации по определенной болезни или сразу по нескольким. Также скрининг может быть многостадийным, если для него используются несколько последовательных тестов.
В зависимости от величины охвата обследованных лиц среди всего населения различают несколько типов (вариантов) скрининга: 1. Массовый, т.е. обследование всего населения без учета факторов риска 2. Селективный, который проводится в определенных группах населения 3. Поисковый, проводимый среди лиц, обратившихся за медицинской помощью [76, 78]. Примером массового скрининга является неонатальный скрининг — тотальное обследование всех новорожденных с целью ранней доклинической диагностики тяжелых врожденных заболеваний, позволяющий своевременно начать патогенетическую терапию и предотвратить тяжелые метаболические и неврологические нарушения в развитии ребенка.
Основаниями для проведения неонатального скрининга являются: - высокая летальность, тяжелое течение заболевания, а также необратимые изменения в нервной системе, которые обусловливают развитие умственной отсталости и инвалидности у ребенка в случае поздней диагностики и несвоевременно начатой терапии; - наличие эффективных методов коррекции на начальных стадиях заболевания в случае выявления с целью предотвращения необратимых осложнений; - высокая частота встречаемости заболевания ( 1:10000 новорожденных); - отсутствие специфических клинических проявлений в раннем неонатальном периоде, что позволило бы предположить наличие у ребенка данного заболевания; - отсутствие ложноотрицательных результатов обследования (т.е. 100% специфичность). К числу таких заболеваний относят врожденный гипотиреоз (ВГ), фенилкетонурию (ФКУ), врожденную дисфункцию коры надпочечников (ВДКН), муковисцидоз и некоторые другие.
Неонатальный скрининг является оптимальной моделью для изучения распространенности тех заболеваний, в отношении которых проводится скрининг в данном регионе, таким образом, определяется истинная распространенность заболевания в популяции.
Эпидемиологи понимают под популяцией совокупность индивидуумов, проживающих в определенном географическом регионе. Такой подход к определению оправдан при анализе результатов неонатального скрининга,, а также при изучении факторов риска и их воздействий на популяцию в целом.
При решении клинических вопросов предлагается составлять популяцию из пациентов, имеющих определенные симптомы, либо заболевание, и наблюдающихся в таких же условиях, в которых полученные данные (результаты) будут использоваться в дальнейшем [75]. В этом случае наиболее информативны будут данные о частоте события в определенной группе, т.е. в группе потенциального риска. В этом случае распространенность будет рассчитываться на группу риска, а не на популяцию (частота случаев в группе риска всегда выше, чем в целом в популяции).
Методы исследования
По распоряжению департамента здравоохранения Тюменской области с 2003 года внедрена программа скрининга новорожденных на врожденную дисфункцию коры надпочечников в г. Тюмени.
Неонатальный скрининг на врожденную дисфункцию коры надпочечников проводится методом определения уровня основного патогенетического маркера заболевания - 17-гидроксипрогестерона (17-ОНР) в капиллярной крови.
У всех доношенных новорожденных в родильном доме на 3 - 4 день жизни, у недоношенных детей на 7 - 14 сутки жизни производится забор капиллярной крови в количестве 6 — 8 капель из пятки новорожденного с нанесением на пористую фильтровальную бумагу Schleicher and Schuell SqS 2992. Полученные пятна крови высушиваются на воздухе и, упакованные в пластиковые рамки, доставляются в лабораторию Перинатального центра (главный врач д.м.н. Е.В. Кашуба), где проводится определение уровня неонатального 17-ОНР (рис. 4). Лаборатория является централизованной и работает согласно международным стандартам проведения неонатального скрининга. Родильные дома и детские поликлиники г. Тюмени, обследование новорожденных в рамках массового скрининга врожденных и наследственных заболеваний Генетическая лаборатория Тюменского областного перинатального центра Скрининг на дефицит 21-гидроксилазы в г. Тюмени проводится одновременно с другими скрининговыми программами: на врожденный гипотиреоз, фенилкетонурию, врожденный муковисцидоз и галактоземию, таким образом, проводимый неонатальный скрининг является многопрофильным.
Пороговым значением 17-ОНР для выявления врожденной дисфункции коры надпочечников является уровень 60 нмоль\л. Все образцы с концентрацией 17-ОНР выше 60 нмоль/л проверялись повторно.
В рамках неонатального скрининга за период 2003 - 04 гг. уровень 17-ОНР был определен у 20011 новорожденных г. Тюмени, процент охвата новорожденных составил 98,95%.
Для сравнения показателей неонатального 17-ОНР в группах детей с различными сроками гестации и весом при рождении были проанализированы истории новорожденных в Перинатальном центре за 2003-04 гг. Из историй фиксировались данные гестационного возраста и веса ребенка при рождении в сопоставлении с показателем неонатального 17-ОНР.
Согласно классификации, принятой в акушерстве и неонатологии, недоношенным считается ребенок, родившийся в сроке до 36 недель беременности, пороговое значение веса при определении ребенка в группу маловесных составляет 2 500 г. [39].
На основании полученных данных было сформировано 2 группы новорожденных; характеристика групп представлена в табл. 4. Таблица 4 Общая характеристика сформированных групп новорожденных Параметр 1 группа 2 группа Р = Вес детей (граммы) (п, = 100,п2 = 202) 2139 ±345 3448 ± 504 р = 0,000; df =300 Гестационный возраст(недели)(П! = 97,п2 = 202) 33 ±1,4 38,8 ±0,9 р = 0,000; df = 297 По результатам обследования 100 недоношенных детей и 97 новорожденных с малым весом были разработаны референтные интервалы уровня 17-ОНР для этой группы. С учетом непараметрического характера распределения неонатального 17-ОНР, определены 95% доверительные интервалы как показатели 2,5 и 97,5 перцентилей, которые могут быть использованы в качестве референтных для данной категории детей [42].
В г. Тюмени с 1998 г. ведется регистр больных детей с ВДКН. В регистр включаются больные дети в возрасте от 0 до 18 лет. Согласно принятым требованиям к созданию регистра используются три независимых источника информации: 1. Пациенты, состоящие на учете у детских эндокринологов г. Тюмени. 2. Пациенты, наблюдающиеся у эндокринолога в городском детском центре на базе поликлиники №11 (главный врач Зиганшин А.Р.). 3. Пациенты - жители г. Тюмени, проходившие стационарное обследование в детском отделении ГЛПУ Тюменской областной клинической больницы (главный врач Миневцев СВ.).
На основании данных регистра рассчитывалась распространенность 21-гидроксилазной недостаточности как совокупность всех пациентов (независимо от сроков постановки диагноза), приходящихся на 100 000 детского населения: Распространенность = число выявленных больных детей х 100 000 число детского населения В г. Тюмени на 1.01.2007 г. зарегистрировано 6 пациентов с классическими формами ВДКН: 1 девочка с простой вирильной формой заболевания и 5 мальчиков с сольтеряющей формой дефицита 21-гидроксилазы.
С целью уточнения возможных причин транзиторного повышения содержания 17-ОНР в сыворотке крови при рождении проведен ретроспективный анализ течения беременности и родов, а также клинический осмотр 27 детей первого года жизни, имевших высокий уровень 17-ОНР по данным неонатального скрининга с нормальными показателями ретеста. Организация селективного скрининга беременных женщин на неклассическую форму дефицита 21-гидроксилазы
На основании рекомендаций кафедры акушерства и гинекологии ГОУ ВПО ТюмГМА Росздрава, при поддержке Управления по здравоохранению г. Тюмени, с 2002 года беременным женщинам, имеющим отягощенный репродуктивный анамнез и риск невынашивания, проводится определение уровней ДГЭА-С и 17-ОНР в рамках селективного скрининга беременных на неклассическую форму врожденной дисфункции коры надпочечников вследствие дефицита 21-гидроксилазы (рис. 5).
Особенности развития детей первого года жизни с транзиторным повышением неонатального 17-гидроксипрогестерона
Параллельно результаты стимуляционной пробы оценивались по степени нарастания концентрации маркеров врожденной ферментопатии. По данным Phyllis W., Speiser с соавторами (2003), у женщин с неклассической формой недостаточности 21-гидроксилазы изменение уровня 17-ОНР после пробы выше, чем у здоровых (от 50 до 300 нмоль/л) и ниже, чем при классической вирильной форме заболевания (от 300 до 1000 нмоль/л).
В разделе, посвященном особенностям развития детей от матерей, получивших глюкокортикоидную терапию во время беременности, проведена оценка нервно-психического развития с помощью клинико-психологической методики исследования развития психоневрологических функций у детей раннего возраста. Использованы формализованные карты психоневрологического обследования и динамического наблюдения за крупной и мелкой моторикой, экспрессивной и импрессивной речью, полимодальным восприятием, разработанные в Научно-терапевтическом центре по профилактике и лечению психоневрологической инвалидности и апробированные в различных регионах Российской Федерации (68).
При оценке развития всех обследованных детей сопоставлялись нормативные для каждого возраста навыки по каждой отдельно изучаемой психоневрологической функции с реальным развитием этой функции у ребенка. Согласно предлагаемой методике для объективизации полученных результатов вычислялись усредненные индексы развития (ИРср) для каждой психоневрологической функции в конкретной возрастной группе, представляющие отношение среднего возраста (выраженного в месяцах), в котором не менее 95% здоровых детей достигают определенного уровня развития функции (М), к паспортному возрасту конкретного ребенка (ИРср=М/возраст). Вычисленный индекс развития любой психоневрологической функции показывает отношение действительного уровня ее развития у данного ребенка к контрольным значениям. Установлено, что ИРср у здоровых детей больше или равен единице. Значение ИР отдельной неврологической функции меньше единицы указывает на задержку темпов ее развития. Значение ИР больше единицы в пределах его максимальной величины (ИРтах) соответствует нормальному развитию. Значение ИР больше ИРтах указывает на опережающее развитие функции. Чем больше значение ИРср, тем больше потенциал развития функции.
Молекулярно-генетическое исследование выполнено методом аллель-специфической полимеразной цепной реакции с использованием специфических праймеров Р1, Р4, Р48 и Р55 для истинного гена [181, 198, 215, 237, 248, 309]. Определялись мутации гена CYP21, приводящие к аминокислотным заменам, характерным как для неклассического варианта (V281L, P30L, P453S), так и для классических форм недостаточности 21-гидроксилазы (E3del, 30kb del, I2spl, R356W, Q318X, L306insT, V237E, G291S, int7, I172N), наличие которых возможно при гетерозиготном носительстве мутаций неклассической формы. Режимы амплификации отрабатывались отдельно для каждой мутации. Для каждой реакции использовано по 3 мкл раствора геномной ДНК.
Состав реакционной смеси для амплификации малого и большого фрагментов гена CYP21 (общий объем 30 мкл): ПЦР-буфер, 2 мМ MgCl2, 200 мкМ каждый dNTP, 0,5 мкМ каждый праймер (малый фрагмент - Р1/Р48; большой -Р4/Р55), 1 ед.акт. Taq-полимеразы.
Режимы амплификации: - большой фрагмент (Р4/Р55): преденатурация - 95 С 3 мин; 30 циклов, включающих денатурацию - 95 С 30 сек, отжиг - 60,5 С 30 сек, элонгацию — 72 С 2 мин; финальная элонгация - 5 мин; - малый фрагмент (Р1/Р48): преденатурация — 95 С 3 мин; 30 циклов, включающих денатурацию - 95 С 30 сек, отжиг - 62,5 С 30 сек, элонгацию — 72 С 1 мин; финальная элонгация - 5 мин; - остальные режимы амплификации: преденатурация - 95 С 3 мин; 30 циклов, включающих денатурацию - 95 С 30 сек, отжиг - 62 С 30 сек, элонгацию - 72 С 1 мин; финальная элонгация - 5 мин. Для амплификации использовали амплификатор "Терцик" МС-2 (НПФ "ДНК-Технология", Россия); термостат "Гном" (НПФ "ДНК-Технология", Россия); источники питания для электрофореза ИП-2, "Эльф-4" (НПФ "ДНК-Технология", Россия); трансиллюминатор (НПФ "ДНК-Технология", Россия); видеосистема "Gel Imager" (НПФ "ДНК-Технология", Россия); микроцентрифуга-вортекс CV-1500 (НПФ "ДНК-Технология", Россия); камеры для горизонтального электрофореза SE-1, SE-2 (ООО "Хеликон", Россия); микроцентрифуга Biofuge Pico МС-13000 («Kendro Laboratory Systems», Германия); система высокой очистки воды («Simplicity», Франция). Детекцию результатов осуществляли путем электрофореза в 1-3% агарозном геле с добавлением этидиума бромида.
Оценка влияния высоких концентраций ДГЭА-С на течение
Достоверных отличий в возрасте матерей к моменту рождения детей в основной и контрольной группе не установлено (26,4 + 4,3 лет и 27,06 + 0,43 лет соответственно, р 0,05). В структуре репродуктивной патологии у матерей основной группы преобладали первичное бесплодие - у 5 чел (18,5%) и нарушения менструального цикла, отмеченные у 6 чел (22,2%), частота которых не превышала таковую в группе контроля (р 0,05). Настоящая беременность была первой для 16 женщин (59%) основной группы и повторной для 39 женщин (68%) группы контроля (р 0,05). В тоже время, первородящие женщины составляли практические равные доли в каждой группе: 78% - в основной и 68,4% - в группе контроля (р 0,05). Соматические заболевания и острые респираторные инфекции во время беременности отмечались с равной частотой у женщин в обеих группах и не оказывали значимого влияния на формирование гестационных осложнений (р 0,05). Особенности течения беременности представлены в табл.
Отягощенное течение беременности отмечалось у большинства женщин как основной, так и контрольной групп. При этом с равной частотой диагностированы хроническая маточно-плацентарная недостаточность и угроза прерывания беременности (37% и 45,6%; 63% и 68,4% соответственно, р 0,05). Частота гестозов II половины беременности достоверно чаще отмечена среди беременных основной группы (81,5%) против 45,6%о, р 0,05).
Анализируя особенности течения пренатального периода у детей с транзиторным повышением 17-ОНР при рождении, нами не установлено зависимости между высоким уровнем аналита и патологией беременности (гестоз II половины: %2 = 1,41, р =0,23; ХМПН: = 0,39, р =0,53; угроза прерывания беременности: % = 1,43, р =0,231). Возможно, это связано с особенностями эндокринной регуляции в системе «мать-плацента-плод», поддерживающей нормальный гомеостаз плода при отдельных патологических состояниях гестации.
С целью профилактики угрожающего выкидыша 8 женщинам (29,6%) основной группы назначался препарат прогестагена («Дюфастон», Solvay Pharma, Германия) в различные сроки гестации. Определена достоверная обратная корреляционная зависимость между приемом прогестагена и уровнем неонатального 17-ОНР в диапазоне повышенных значений (г = — 0,64 при р=0,00).
Средний срок наступления родов у женщин основной группы составил 38,4±0,17 недель. При исследовании статистически значимых отличий в сроке родов у женщин двух групп не установлено. Наличие достоверной обратной корреляционной взаимосвязи между уровнем неонатального 17-ОНР и сроками родов (г = — 0,45 при р=0,01) подтверждает существование более высоких значений аналита у недоношенных новорожденных.
Задержку внутриутробного развития плода (ЗВУР) диагностируют у детей, имеющих дефицит массы тела при рождении по отношению к их гестационному возрасту (вес ниже 10 перцентили для срока гестации) и/или при наличии морфологических признаков незрелости у новорожденного. ЗВУР формируется под действием неблагоприятных факторов течения беременности, наследственных и социально-биологических факторов. Наиболее частыми осложнениями неонатального периода у детей со ЗВУР являются асфиксия, синдром аспирации, снижение иммунологической резистентности и метаболические расстройства, такие как полицитемия, гипогликемия, гипербилирубинемия и др.; у таких новорожденных нередко выявляются признаки перинатальной энцефалопатии. При умеренно выраженной задержке внутриутробного развития как проявление компенсаторных реакций плода на гипоксию в период новорожденности определяется повышение уровня катехоламинов и кортизола [80], и, возможно, промежуточных метаболитов стероидного синтеза при активации системы гипофиз-надпочечники. В двух группах исследования ЗВУР определялась в равном соотношении (р 0,05), не установлено зависимости между внутриутробной гипотрофией плода и тяжестью перинатальной энцефалопатии (х = 0,49 df=l,0 р =0,48), а также неудовлетворительной резистентностью в течение первого года жизни у детей основной группы.
Внутриутробная гипоксия является следствием разнообразной экстрагенитальной и акушерской патологии, при этом длительность и степень тяжести гипоксии имеет определяющее значение в нарушении обменных процессов в мозговой ткани плода. В основной группе внутриутробная гипоксия диагностирована в 5 раз чаще, чем в группе контроля (р 0,05). При проведении корреляционного анализа нами не установлено достоверной взаимосвязи между наличием внутриутробной гипоксии плода и формированием перинатальной энцефалопатии в младенческом возрасте, что может быть обусловлено физиологической реакцией адаптации плода к кратковременной и/или умеренной гипоксии [80]. Физиологическая реакция защиты от гипоксии реализуется за счет активации симпато-адреналовои системы. Вероятно, именно этим механизмом объясняется зависимость транзиторного увеличения концентрации 17-ОНР у новорожденных, перенесших внутриутробную гипоксию, определенную методом логистического регрессионного анализа (%2 = 14,11 при р =0,0001).
