Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Липосомы 8 - 28
1.1 .Общая характеристика. Способы получения 8— 17
1.2. Биофармацевтические свойства и использование липосом для транспорта лекарственных веществ в организме. ..17 - 28
Глава 2. Применение липосом в терапии инфекционных и опухолевых заболеваний 28 - 46
2.1. title2 Применение липосом в терапии инфекционных заболеваний title1 29 - 39
2.2.Применение липосом в противоопухолевой терапии... 39 -44
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 47 -III
Глава 3. Материалы и методы 47 - 60
3.1. Получение липосомальной формы стрептомицина 47 - 53
3.2.Изучение химиотерапевтической эффективности липосомальной формы стрептомицина 53 - 56
3.3.Изучение фармакокинетикй липосомальной формы стрептомицина 56 - 58
3.4.Изучение фармакокинетикй *%-дигидрострептомицина.. 58 - 59
3.5.Оценка фармакокинетических параметров 59 - 60
3.6 .Статистическая обработка результатов 60
Глава 4. Получение липосомальной формы антибиотиков стрептомицинового ряда 61 - 70
Глава 5. Химиотерапевтическая эффективность-липосомальной формы стрептомицина 71 - 78
5.І. Оценка химиотерапевтической эффективности липосомальной формы стрептомицина 71-75
5.2.Оценка антимйкобактериальной активности липосомальной формы стрептомицина 76-78.
Глава 6. Фармакокинетика стрептомицина и дигидрострептомицина при введении в липосомальной форме 79-ІІІ
6.1.Сравнение фармакокинетики стрептомицина при введении в виде раствора и липосомальной формы 79-91
6.2.Сравнительная фармакокинетика дигидрострептомицина у интактных и пораженных генерализованным туберкулезом мы шей 92-111
Глава 7. Обсуждение результатов ІІ2-І25
ВЫВОДЫ 126-127
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 128-154
- Биофармацевтические свойства и использование липосом для транспорта лекарственных веществ в организме.
- Получение липосомальной формы стрептомицина
- Получение липосомальной формы антибиотиков стрептомицинового ряда
- Оценка химиотерапевтической эффективности липосомальной формы стрептомицина
Биофармацевтические свойства и использование липосом для транспорта лекарственных веществ в организме
Включение гидрофильных и гидрофобных молекул в липосомы зависит от строения самих липосом /42/. Так как гидрофобные молекулы могут включаться в липидную фазу, многослойные липосомы являются наиболее подходящим носителем для них и характеризуются наибольшей степенью включения гидрофобных веществ /147/.
Гидрофильные молекулы инкапсулируются во внутренней водной фазе, поэтому степень их включения во многом зависит от емкости водной фазы липосом. йякость маленьких моноламеллярных везикул составляет 0,5 мкл/мг липида, однослойных макровезикул - 13,7 мкл/мг липида, мультиламеллярных липосом - 4,1 мкл/мг липида /147/. Эффективность включения пентацина, например, в мультила-меллярные липосомы емкостью 3,78 мкл/мкмол липида составляет 19,3%, а в макровезикулы, полученные комбинированным методом обращения фаз и замораживания-оттаивания, емкостью 10,6 мкл/мкмол,-54,6#/33/. Большие мультиламеллярные липосомы характеризуются большей степенью включения метотрексата, чем микровезикулы /156/. Микровезикулы, полученные детергентным методом, характеризуются большим объемом внутренней водной фазы и большей степенью включения стрептомицина, чем везикулы, полученные путем ультразвуковой
Степень включения лекарственных веществ в липоеомы зависит от заряда липосом. Введение стеариламина и создание таким образом положительного заряда сопровождается повышением латентной активности креатинфосфокиназы в липосомах /12/; дицетилфосфат, с помощью которого создают отрицательный заряд липосом, повышает включение амилоглюкозидазы в водную фазу липосом и снижает адсорбцию фермента на поверхности /120/; при увеличении положительного заряда на поверхности липосом снижается связывание аминазина /49/. Включение метотрексата в отрицательно заряженные мультила-меллярные и моноламеллярные микровезикулы является более высоким, чем в положительно заряженные везикулы /156/.
Применение липосом в терапии инфекционных заболеваний
Среди инфекционных заболеваний особое место занимают заболевания, вызываемые факультативными внутриклеточными паразитами, такими как bruczCCci , ІСЛТЄҐСО, , &а,СтопеС ь , ШусоЬасЬегсилъ % которые могут выживать и размножаться в системе нононуклеарннх фагоцитов /222/. В то время как эти патогены чувствительны к антимикробным агентам in viito , их внутриклеточное пребывание иг vivo предохраняет их от иммунных реакций организма-хозяина и химиотерапевтических воздействий /137, 172/. Эта способность патогенов представляет большую трудность в лечении , так как приводит к хроническому течению процесса /87, 88/.
Активный захват липосом макрофагами и возможность обеспечения внутриклеточной доставки лекарственных веществ, которые сами по себе проникают внутрь клеток в незначительных количествах, является предпосылкой для применения липосом в терапии инфекционных заболеваний /206/.
В течение ряда лет предпринимаются попытки повысить эффективность химиотерапевтического лечения лешманиозов при помощи липосом /62, 81, 181, 183, 244, 245/.
При висцеральном лейшманиозе амастиготные паразиты постоянно обитают в вакуолях звездчатых ретикулоэидотелиоцитов печени, для лечения леЁшманиозов применяют препараты сурьмы и мышьяка, характеризующиеся высокой токсичностью.
Продемонстрировано, что при введении мышам, зараженным Ledk-matiLcL, cLonorani, инкапсулированного в липосомы пентостама (20 мг/кг; внутривенно) количество паразитов в печени уменьшается в 200 раз, тогда как раствор, введенный в такой же дозе, неэффективен /74/.
У мышей, инфицированных этим же паразитом, контрольных и получавших калий-сурьмяный тартрат (20 мг/кг; внутривенно; на 10, II и 12-й день после инфицирования), в виде раствора, число лейш-маний в клетках печени составляет 240 и 260 на 200 клеток, в виде липосомального препарата - 0 на 200 клеток /183/,
Удаление паразита из печени при введении препаратов в виде раствора и липосомальной формы (внутривенно; в течение 3-х дней после инокуляции паразита) составляет при использовании калий-сурьмяного тартрата (20 мг/кг) 0 и 100%, пентостама (10 мг/кг, однократно) - 0 и 88%, амфотерицина В (3,75 мг/кг) - 0 и 77%, гри-зеофулвина (25 мг/кг) - 0 и 76%, пентамидина (90 мг/кг) - 13 и 67%, 5-фторцитозина (37 мг/кг) - 7 и 48%, соответственно /81/.
Получение липосомальной формы стрептомицина
Раствор, содержащий 20-50 мг лецитина (лецитин-стандарт, г.Харьков) в хлороформе, помещали в круглодонную колбу и отгоняли растворитель с помощью роторного вакуумного испарителя. К полученной на стенках колбы пленке лецитина добавляли 2-5 мл 20$ раствора стрептомицина-сульфата (отвечающего требованиям ГХ X) в 0,01 М трис-HCI буфере, содержащем 0,1 М хлористого натрия (рН 7,4), и 0,2-0,5 мл 20$ раствора холата натрия. Содержимое встряхивали до образования прозрачного смешанного мицеллярного раствора. Полученную смесь наносили на колонку с сефадексом Г-50 (средний) (20 х 1,5 см), которую элюировали тем же буфером (скорость пропускания 7-8 мл/час). Полученная суспензия состояла из крупных липосом диаметром 2000-3000 нм, в липосомах стрептомицин обнаруживался в следовых количествах. Такие липосомы агрегировали в течение нескольких минут после образования.
Получение липосом, содержащих стрептомицин, с предварительным насыщением колонки антибиотиком
С целью повышения включения стрептомицина в липосомы холат-ный метод был модифицирован. Модификация заключается в том, что гель-хроматографию смешанного мицеллярного раствора проводят после предварительного нанесения на колонку с сефадексом буферного раствора стрептомицина-сульфата.
Способ получения липосомальной формы стрептомицина осуществляется следующим образом. 20-50 мг лецитина высушивают на роторном вакуумном испарителе в круглодонной колбе. Добавляют в колбу 2-5 мл 5-20$ раствора стрептомицина-сульфата в трис-HCI буфере и 0,2-0,5 мл 20$ раствора холата натрия. Колбу встряхивают до образования смешанного мицеллярного раствора. Отношение концентраций (в мг/мл) антибиотика, лецитина и холата натрия в полученном мицеллярном растворе составляет (50-200):10:20.
На колонку с сефадексом наносится раствор антибиотика и сразу же после его всасывания в верхней части колонки - предварительно полученный мицеллярный раствор. Размеры колонки 40-45 х 1,5-2,5 см. Используется сефадекс Г-50 средний. Колонка элюируется трис-буфером. Скорость элюции при формировании липосом в верхней части колонки составляет 0,8-1 мл/мин. Собирают опалесцирующую фракцию липосом.
Получение липосомальной формы антибиотиков стрептомицинового ряда
Стрептомицин хорошо растворим в воде, значительно меньше -в органических растворителях /21/. Поэтому для получения липосомальной формы стрептомицина был выбран детергентный метод /79/, при использовании которого формируются однослойные липосомы, характеризующиеся значительным объемом внутренней водной фазы, в которой могут быть инкапсулированы гидрофильные молекулы.
Процесс формирования липосом, содержащих аминогликозидные антибиотики, с помощью детергентного метода в нашей модификации можно представить в виде 3-х последовательных стадий: Получение смешанного мицеллярного раствора из лецитина, раствора стрептомицина-сульфата в трис-буфере и холата натрия; 2)освобождение от холата натрия в ходе гель-фильтрации смешанного мицеллярного раствора на сефадексе Г-50 (средний) и формирование липосом в верхней части колонки, насыщенной предварительно нанесенным буферным раствором стрептомицина-сульфата; 3)освобождение липосом от невключенного стрептомицина по мере прохождения через колонку.
В ходе 1-й стадии получают смешанный мицеллярный раствор в круглодонной колбе, на внутренней поверхности которой, после отгонки органического растворителя из раствора фосфолипида, формируется пленка лецитина. К 20-50 мг лецитина в колбе добавляют 2-5 мл раствора стрептомицина-сульфата в буфере (рН 7,4) и 0,2-0,5 мл 20$ раствора холата натрия. При механическом встряхивании содержимого колбы образуется прозрачный смешанный мицеллярный раствор, который затем подвергается гель-хроматографии.
На этом этапе получения липосомальной формы важными факторами являются концентрация липида и антибиотика. Установлено, что оптимальной концентрацией стрептомицина-сульфата является 20$, так как при более высоких значениях концентрации не образуется смешанный мицеллярный раствор, а при более низких - снижается включение антибиотика в липосомы (табл.1). Оптимальная концентрация лецитина - 10 мг/мл, так как при более высоких значениях формируются крупные (диаметр 2000 нм) липосомы, быстро агрегирующие с образованием осадка, а при более низких значениях концентрации липида снижается количество липосомального препарата.
Химиотерапевтическая эффективность-липосомальной формы стрептомицина
Сравнительную химиотерапевтическую эффективность раствора и липосомальнои формы стрептомицина изучали в опытах на мышах с острой генерализованной формой туберкулеза, диагностированной гистологически. Эффективность оценивали по времени выживания животных, погибавших от генерализованного туберкулеза, ; :при введении антибиотика в различных формах.
В первом опыте средняя продолжительность жизни инфицированных мышей линии ВДІВ/с , которым вводили буфер (0,5 мл; внутривенно; на 4, 7 и 10-й день после инфицирования), составляет 15+0,15 дня. Средняя продолжительность жизни инфицированных мышей, которым вводили стрептомицин в растворе или липосомальнои форме (50 мг/кг в день; внутривенно; на 4, 7 и Ю- й день после инфицирования), составляет 18,5+1,0 и 22,85+1,03 дня, соответственно. Различия между группами высокодостоверны (Р 0,01) (рис.5). Выживаемость 50$ животных ( в днях) в этих группах составляет 15,4; 19,8:и 21,8 дня, соответственно. У животных 2-й и 3-й групп медленнее снижалась масса тела, чем у животных 1-й группы, замедление потери массы было более авыраженным в 3-й группе.
![Изучение неспецифической микрофлоры у больных туберкулезом органов дыхания и пути оптимизации воздействия на нее во фтизиатрической клинике [Электронный ресурс]](/i/i/4420/210438.png "Изучение неспецифической микрофлоры у больных туберкулезом органов дыхания и пути оптимизации воздействия на нее во фтизиатрической клинике [Электронный ресурс] Гизатуллина Эльвира Данияловна")
![Изучение формы, размеров, положения языка при ортогнатическом прикусе и аномальных прикусах. Характеристика симптомокомплекса индивидуальной макроглоссии [Электронный ресурс]](/i/i/4345/202490.png "Изучение формы, размеров, положения языка при ортогнатическом прикусе и аномальных прикусах. Характеристика симптомокомплекса индивидуальной макроглоссии [Электронный ресурс] Баринова Руфина Витальевна")
