Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные представления о патогенезе острых бактериальньгх кишечных инфекций -18
1.1. Общие закономерности взаимодействия возбудителей кишечных инфекций с клетками и системами макроорганизма 18
1.2. Бактериальные токсины и их роль в патогенезе острых бактериальных кишечных инфекций 28
1.2.1. Шига-токсины 29
1.2.2. Термолабильные холероподобные энтеротоксины 43
1.2.3. Токсины C.difficile 49
1.2.4. Энтеротоксин типа А С. perfringens 59
1.2.5. Липополисахариды/эндотоксины грамотрицательных бактерий— 63
1.3. Цитокины как регуляторы воспалительного процесса и апоптоза при кишечных инфекционных заболеваниях 72
Глава 2. Клиническая характеристика больных- 95
2.1. Общая характеристика больных 95
2.2. Клиническая характеристика больных гастроинтестинальной формой бактериологически подтвержденного сальмонеллеза 99
2.3. Клиническая характеристика больных бактериологически подтвержденного шигеллеза 106
2.4. Клиническая характеристика больных острой кишечной инфекцией неустановленной этиологии 109
Глава 3. Материалы и методы исследования- 117
3.1. Определение уровней ИЛ-1 (3, ИЛ-4, ИЛ-10 и ФНО-а в сыворотке крови 120
3.2. ЛПС-индуцированный апоптоз гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов, проточно-цитофлюориметрический анализ фрагментации ДНК 122
3.3. Постановка реакции коагглютинации на стекле для выявления термостабильных антигенов (ЛПС) 124
3.4. Коагглютинация на планшетах для выявления маркеров токсинов 125
3.5. Определение уровня иммунных комплексов в копрофильтрате— 125
3.6. Расчет лейкоцитарного индекса интоксикации (ЛИИ) 126
3.7. Статистическая обработка результатов 126
Глава 4. Выявление о-антигенов и маркеров токсинов возбудителей у больных оки 128
4.1. Общая характеристика больных по этиологии заболевания 128
4.2. Выявление О-антигенов и маркеров токсинов у больных бактериологически подтвержденным сальмонеллезом 131
4.3. Выявление О-антигенов и маркеров токсинов у больных бактериологически подтвержденным шигеллезом 135
4.4. Выявление О-антигенов и маркеров токсинов у больных КИНЭ-1— 137
4.5. Динамика циркуляции О-антигенов и маркеров токсинов у больных КИНЭ-1 при различных вариантах течения болезни 152
4.6. Динамика уровней ИК в пробах КФ больных ОКИ при различных вариантах течения и этиологии 161
Глава 5. Изучение уровня и динамики шита токсина, токсинов а и в c.difficile, энтеротоксина а c.perfringens и холероподобного токсина у больных оки 165
5.1. Исследования в общей группе больных 165
5.2. Выявление маркеров в зависимости от варианта течения и этиологии заболевания 171
Глава 6. Динамика уровней и частота выявления цк (ил-ір, ил-4, ил-10, фно-а) у больных оки различной этиологии и вариантах течения заболевания
6.1. Частота выявления и средние уровни изученных цитокинов в общей группе больных 196
6.2. Частота выявления и средние уровни цитокинов при ОКИ различной этиологии 201
6.3. Частота выявления и средние уровни цитокинов при различных вариантах течения болезни 208
Глава 7. Клиническое значение выявления маркеров возбудителей оки 213
7.1. Особенности клинической картины ОКИ при различной этиологии заболевания 213
7.2. Особенности клинической картины ОКИ при разных вариантах течения болезни 219
7.3. Особенности течения ОКИ в группах в зависимости от выявленных токсинов и антигенов возбудителей 223
7.4. Этиологическая расшифровка и оценка удельного веса отдельных возбудителей, особенности выявления маркеров токсинов и показателей интоксикации у больных ОКИ с сопутствующей патологией поджелудочной железы 227
7.5. Сопоставление изученных показателей интоксикации в группах больных ОКИ, различающихся спектром и уровнями цитокинов— 234
Глава 8; Эндотоксин - индуцированный апоптоз гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов у больных, перенесщих сальмонеллезную инфекцию - 259
8.1. Апоптоз гранулоцитов периферической крови 259
8.2. Дифференциальная чувствительность гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов периферической крови к эндотоксин-индуцированному апоптозу 265
8.3. Влияние клинического течения сальмонеллеза на апоптоз клеток периферической крови 269
Глава 9. Математический анализ полученных результатов 274
9.1. Корреляционный анализ 274
9.2. Регрессионный анализ 279
9.2.1. Регрессионный анализ показателей интоксикации и диарейного синдрома 280
9.2.2. Регрессионный анализ цитокинов 288
9.2.3. Регрессионный анализ токсинов 294
Заключение 301
Выводы 341
Практические рекомендации- 345
Список литературы 346
Приложение 408
- Бактериальные токсины и их роль в патогенезе острых бактериальных кишечных инфекций
- Клиническая характеристика больных гастроинтестинальной формой бактериологически подтвержденного сальмонеллеза
- ЛПС-индуцированный апоптоз гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов, проточно-цитофлюориметрический анализ фрагментации ДНК
- Выявление О-антигенов и маркеров токсинов у больных бактериологически подтвержденным шигеллезом
Введение к работе
Актуальность. Проблема ОКИ остается одной из наиболее актуальных в современной инфекционной патологии человека и практического здравоохранения. В структуре инфекционной патологии острые кишечные инфекции занимают одно из ведущих мест [29, 30]. В РФ ежегодно регистрируются 556-580 тыс. случаев заболеваний ОКИ: при этом от 75 до 78% составляют ОКИ и ПТИ с неустановленным возбудителем, что свидетельствует о недостатках в организации* диагностики этой группы заболеваний в лечебно-профилактических учреждениях [62, 77, 78, 79, 87, 93, 107, 135, 181, 239, 278, 440, 506, 524, 578].
Заболеваемость ОКИ, вызванными кампилобактериями, энтеропато-генными кишечными палочками, йерсиниями регистрируется на довольно низком уровне (эшерихиозы - 17,0%, иерсиниозы - 6,8%, кампилобактерио-зы - 1,1% случаев), что связано, в* основном, с неадекватными возможностями многих диагностических лабораторий. Заболеваемость ОКИ неустановленной этиологии стабилизировалась на чрезвычайно высоком уровне и составила в 2006г. 306,0 на 100000 населения [79].
Парадокс современной ситуации по ОКИ состоит в том, что, несмотря на внедрение новых достижений и технологий в пищевую промышленность, уровень безопасности пищевых продуктов не становится выше, а иногда, наоборот, способствует широкому распространению новых возбудителей, как это было с ШПТ-продуцирующими штаммами E.coli [333].
Традиционно актуальность проблемы ОКИ рассматривается с позиций их распространенности, наносимого ими материального ущерба и летальности, а влияние на здоровье людей оценивается по остроте и тяжести течения заболевания (выраженности синдрома интоксикации, дегидратации и т.д.), без особого внимания к отдаленным последствиям для здоровья и трудоспособности. Однако, в последние десятилетия накоплены убедительные данные, свидетельствующие о важном значении перенесенных ОКИ в развитии
патологических состояний различных органов и систем, к числу которых относят синдром Гийена-Барре, Sjogren синдром, артропатии, включая реактивной артрит и синдром Рейтера, ГУС, тромбоцитопеническая пурпура и хроническая почечная недостаточность, хроническая воспалительная патология органов ЖКТ, синдром раздраженного кишечника, болезнь Крона, Кавасаки, Graves болезнь, рассеянный склероз, аутоиммунные тиреоидиты, псориаз и ряд других состояний [143, 239, 297, 370, 376, 383, 440, 466, 578, 582].
В ряде случаев «запуск» иммунопатологических реакций может быть обусловлен длительной персистенцией возбудителя, однако не исключается, что он может быть инициирован токсическими субстанциями, вырабатываемыми бактериями, при- этом развитие хронических состояний после перенесенных ОКИ может возникать независимо от тяжести и остроты первичной волны-заболевания* [140, 180, 181], поскольку защитные системы макроорганизма в любом случае будут реагировать на факт бактериальной инвазии. Влияние токсинов бактерий может проявляться и в их субтоксических концентрациях [460, 552].
Необходимость понимания того, каким образом энтеропатогенные возбудители способны вызывать развитие заболеваний, приобретает все большую значимость в современных условиях, особенно в свете таких эволюционных тенденций, как формирование и распространение клонов возбудителей с полирезистентностью к антимикробным препаратам, постоянного изменения этиологической структуры ОКИ, необходимости более осторожного и дифференцированного подхода к вопросам лечения и профилактики [18, 42,52,58,79, 106].
Синдром интоксикации является клиническим отражением сложных скоординированных общепатологических реакций макроорганизма, инициированных бактериальной инвазией и/или поступлением во внутренние среды его структурных компонентов, в том числе экзо- и эндотоксинов и биологически активных метаболитов. Выраженность интоксикации является одним из основных объективных критериев определения степени тяжести заболевания, так как определяет его течение и исход [87, 90, 93].
Достаточно большой накопленный клинический материал свидетельствует, что лабораторными критериями выраженности интоксикации могут служить такие показатели как ЛИИ [36], уровни соматических О-антигенов (серологический маркер ЛПС) в сыворотке крови [5, 55, 83, 115] уровни про-воспалительных цитокинов [70, 109] и другие. Несмотря на то, что токсин-опосредованная обусловленность патогенеза находит все больше подтверждений в экспериментальных и клинических исследованиях [26, 246, 293, 532], определение истинных токсинов у больных практически не проводится в связи с объективными трудностями. Между тем, четкое определение роли и значения токсинов в патогенезе откроет принципиально новые возможности в разработке методов их диагностики, а также в лечении и профилактике инфекционных заболеваний.
Особенности воздействия возбудителей и их факторов патогенности (отдельных и в совокупности) на макроорганизм в конкретных условиях инфекционного заболевания изучены недостаточно в связи с ограниченными возможностями используемых методов, их сложностью и малой доступностью. Все большую значимость в современных условиях приобретает необходимость понимания того, каким образом энтеропатогенные возбудители способны вызывать развитие заболеваний и влиять на характер клинического течения, в том числе микст-инфекций, в условиях формирования и распространения клонов возбудителей с полирезистентностью к антимикробным препаратам, постоянного изменения этиологической структуры, роста числа смешанных бактериально-бактериальных, бактериально-вирусных инфекций и необходимости более осторожного и дифференцированного подхода к вопросам лечения и профилактики [42, 58, 79, 106].
Недостаток знаний о тонких регуляторных механизмах межклеточных взаимодействий в условиях интоксикации не позволяет однозначно определить факторы, влияющие на тяжесть течения и прогноз заболеваний и разработать на этой основе более совершенные подходы к лечению и профилактике ОКИ. В этой связи представляет несомненный интерес изучение экзоток-
синов в биосредах организма больных при различных инфекционных заболеваниях, их присутствия, уровня и динамики в соотношении с выраженностью синдрома интоксикации, апоптоза, уровнями иммунных комплексов, спектром, уровнями и динамикой про- и противовоспалительных цитокинов и другими факторами клеточного и гуморального иммунного ответа.
Цель работы - обосновать клинико-патогенетическое значение бактериальных токсинов в развитии особенностей течения острых кишечных инфекций.
Задачи исследования:
Установить закономерности выявления, частоту и уровень бактериальных экзотоксинов Шига токсина, энтеротоксина А и В C.difficile, энтеротоксина типа A C.perfringens, холероподобного энтеротоксина у больных острыми кишечными инфекциями при различной этиологии заболевания, вариантах клинического течения и в разные периоды болезни.
Определить частоту и динамику выявления О-антигенов возбудителей при заболеваниях различной этиологии и вариантах течения.
Исследовать частоту, уровни и динамику циркуляции провоспалительных ИЛ-1(3, ФНО-а и противовоспалительных ИЛ-4, ИЛ-10 в крови у больных острыми кишечными инфекциями различной этиологии и клинических вариантах течения.
Изучить ЛПС-индуцированный апоптоз гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов в период реконвалесценции сальмонеллезной инфекции.
Выявить взаимосвязи Шига токсина, энтеротоксина А и В С. difficile, энтеротоксина типа A C.perfringens, холероподобного энтеротоксина (отдельных и в сочетании) с уровнями и спектром про- и противовоспалительных цитокинов, присутствием моно и микст О-антигенов возбудителей и уровнями иммунных комплексов.
6. Оценить влияние токсинов и О-антигенов на показатели интоксикации и
диарейного синдрома в зависимости от уровня и спектра регуляторных цито
кинов.
7. Определить значение в диагностике, оценке тяжести течения и прогнозе заболевания выявления широкого спектра бактериальных экзотоксинов и О-ан-тигенов различной специфичности, в том числе микст.
Научная новизна исследования. Впервые у больных ОКИ проведено комплексное исследование в копрофильтратах маркеров Шига токсина, токсинов А и В C.difficile, энтеротоксина типа A C.perfringens, холероподобного энтеротоксина, О-антигенов шигелл, сальмонелл, йерсиний, кампилобакте-рий в совокупности с изучением спектра провоспалительных ИЛ-10, ФНО-а и противовоспалительных ИЛ-4, ИЛ-10 цитокинов, показателями ЛПС-инду-цированного апоптоза гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов, уровнями среднемолекулярных ИК при заболеваниях различной этиологии, клинических вариантах течения и в зависимости от тяжести синдрома интоксикации.
Благодаря использованию широкого спектра диагностикумов на основе рекомбинантных и натуральных белков установлено значительное присутствие в копрофильтратах больных ОКИ маркеров термолабильных экзотоксинов (67,8% случаев). Чаще выявлен энтеротоксин A C.perfringens, токсин А C.difficile и Шига токсин, реже найдены маркеры токсина В C.difficile и холероподобного энтеротоксина. У подавляющего большинства больных отмечено одновременное присутствие 2-5 маркеров токсинов (66,7%) (в основном - сочетание энтеротоксина A C.perfringens с токсином А/В C.difficile или с Шига токсином). При сочетании с Шига токсином титры маркеров токсинов клостридий у трети больных в динамике болезни достоверно повышались, в отсутствие Шига токсина в динамике заболевания у 2/3 больных токсины клостридий не выявлялись.
Впервые установлена положительная достоверная связь уровней маркеров токсинов между собой и с частотой их выявления. В разгар заболевания отмечены наиболее высокие уровни маркеров1 Шига токсина, токсина А C.difficile, энтеротоксина типа A C.perfringens, более низкие — токсина В C.difficile и холероподобного энтеротоксина. В динамике заболевания они
снижались, однако, к моменту выписки из стационара сохранялись у 12,5 % больных. Высокие титры токсинов (1:512 и выше) отмечены всего у 1/5 больных.
Впервые установлены различия в уровнях токсинов в зависимости от этиологии заболевания, присутствия- моно- и микст-инфекции, антигенной и токсигенной нагрузки.
Из числа изученных в сыворотке крови ФНОос, ИЛ-lp, ИЛ-4 и ИЛ-10 все четыре цитокина выявлены у 14,4%, три — у 6,7%, два - у 9,4%, один - у 16,7% больных. Наиболее часто выявлен ИЛ-4 (37,8%), в основном, в первые два дня от начала болезни, в различных концентрациях (от 5 до 800 пг/пл) и сочетаниях с другими ЦК. Частота выявления остальных ЦК была ниже.
По сочетанию выявленных в крови цитокинов выделены 5 групп больных, четко отличающихся спектром цитокинов и их концентрациями. У трети больных ЦК не определялись, что свидетельствовало, вероятно, о преимущественно их местной, в кишечнике, продукции. У 20,0% наблюдались только низкие концентрации ИЛ-4. При повышении уровня ИЛ-4 до 130 пг/мл в крови появлялись ИЛ-ір и ФНО-а, а при концентрации ИЛ-4 выше 500 пг/мл - и ИЛ-10. У 18,0% больных цитокины выявлены в высоких концентрациях.
Концентрация ИЛ-4 в крови четко коррелировала с концентрациями провоспалительных цитокинов (ИЛ-1{3 и ФНОос) и отражала динамику уровней токсинов: рост титров токсинов у большинства больных в группе сопровождался' высокой концентрацией ИЛ-4 и провоспалительных ЦК, а также появлением ИЛ-10 в высоких концентрациях, в то время как стагнация или снижение титров токсинов сопровождались умеренной концентрацией ИЛ-4 и отсутствием ИЛ-10.
Впервые показано, что взаимообусловленное повышение-концентраций ИЛ-4 и ИЛ-10 наблюдается у больных, у которых в копрофильтрате выявлены от одного до трех маркеров разных токсинов. При выявлении 4-5 маркеров токсинов отмечено резкое достоверное падение титров ИЛ-4 и ИЛ-10 и дискоординация их уровней.
Сочетанное выявление ИЛ-4 и ИЛ-10 в высоких титрах у больных ОКИ с диффузными изменениями ткани поджелудочной железы (по данным ультразвукового исследования) сопровождается высокой частотой сочетанного выявления О-антигенов и маркеров токсинов (микст-инфекция в 92,0%), достоверным увеличением числа О-антигенов в динамике болезни, более высокими уровнями ИЛ-ір и ФНОа, на фоне нормальных показателей амилазы крови. Это может свидетельствовать о субклиническом течении воспалительного процесса в поджелудочной железе.
Сочетанное присутствие у больного О-антигенов и маркеров токсинов нескольких возбудителей приводит к более выраженным клиническим проявлениям болезни (длительной лихорадке, продолжительной и частой диарее, выраженному болевому синдрому, появлению патологических примесей в стуле) и к высоким" показателям ЛИИ, в сравнении* с больными, у которых обнаружен маркер одного токсина.
Впервые выявлены различия в уровнях, частоте и динамике маркеров токсинов в зависимости от этиологии и клинического варианта течения болезни: в разгар заболевания наиболее высокие уровни токсинов отмечены при шигеллезе и микст-инфекции, средние уровни - при сальмонеллезе и йерсиниозе, низкие - в группе больных с О-антигенами кампилобактерий. При ГЭ и ЭК вариантах течения изначально высокие уровни маркеров токсинов и частота их выявления достоверно снижались, а при ГЭК варианте выявлено сначала повышение уровня и частоты выявления маркеров, а затем их снижение до исходных показателей.
Установлены различия в уровнях, частоте и динамике циркуляции про-и противовоспалительных ЦК при различной этиологии заболевания и вариантах клинического течения. В разгар болезни наиболее высокие концентрации ЦК в периферической крови, в первую очередь ИЛ-ір и ИЛ-10, выявлены при микст-инфекции и сальмонеллезе, средние — при шигеллезе и кишечной инфекции неустановленной этиологии, наименьшие - при йерсиниозе.
Наиболее высокие уровни ЦК определены в остром периоде ГЭК, а наиболее длительно они выявлялись при ГЭ-варианте.
У больных ОКИ О-антигены шигелл Зонне, Флекснера, Ньюкастл, сальмонелл В, Сь С2, D, Е серогрупп, йерсиний псевдотуберкулеза I и III, эн-тероколитика Оэ, 07,8, Од, 04,зз5 Об,зои кампилобактерий выявлены в 90,1%, а в сочетании с токсинами - в 61,5% случаев.
При ГЭ и ЭК вариантах течения ОКИ наиболее часто выявлены О-антигены йерсиний, а при ГЭК - йерсиний и сальмонелл. При всех вариантах течения заболевания отмечена одинаковая средняя частота выявления маркеров токсинов в пробе копрофильтрата («нагрузка» токсинами), в то время как «нагрузка» О-антигенами была значительно выше при ГЭК, чем при-ГЭ и ЭК вариантах течения.
Впервые у больных, перенесших гастроинтестинальную форму саль-монелллезной инфекции, в период реконвалесценции установлено изменение показателей ЛПС — индуцированного апоптоза гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов, что выражается в снижении количества клеток, вступающих в апоптоз на ранних стадиях воздействия токсина и подавлении чувствительности апоптоза к воздействию оптимальных доз ЛПС, а также повышении порога чувствительности к субоптимальным дозам ЛПС S.Enteritidis. Выявленная у здоровых доноров закономерная иерархичность индукции апоптоза по ряду гранулоцит - моноцит - лимфоцит наблюдается у больных лишь при наличии низкой, субоптимальной дозы ЛПС.
Впервые с помощью математического анализа установлено значительное количество достоверных связей между изученными показателями, а также зависимость некоторых из них от двух и более независимых переменных. У больных ОКИ удалось установить связи между уровнями Шига токсина, энтеротоксина A C.perfringens и числом О-антигенов разных возбудителей, выявленных в пробе копрофильтрата, что может свидетельствовать об одновременной активации продукции всех токсинов (из числа изученных) возбудителями кишечных инфекций.
Впервые методом множественного регрессионного анализа созданы математические модели в виде уравнения регрессии для расчета уровней прогнозируемых показателей ЦК (ФНО-сс, ИЛ-ір, ИЛ-4, ИЛ-10) и токсинов (А C.difficile и холероподобного), показателей высоты и длительности лихорадки, частоты стула и числа лейкоцитов периферической крови, с помощью которых возможно решение задач ретро- и проспективного анализа и прогноза.
Практическая значимость. Выявление маркеров экзотоксинов (Шига токсина, энтеротоксина А и В C.difficile, энтеротоксина типа A C.perfringens, холероподобного энтеротоксина) позволяет уточнить степень интоксикации, а в сочетании с выявленными О-антигенами возбудителей характеризует токсическую нагрузку на клетки организма в целом. При этом наличие токсинов говорит о присутствии соответствующих возбудителей, обладающих рядом других факторов патогенности, и косвенно свидетельствует о значительном нарушении микрофлоры кишечника.
Определение маркеров токсинов важно, для-оценки эффективности лечения, т.к. адекватная терапия способствует уменьшению численности возбудителя, прекращению или снижению продукции ими токсинов, прекращению их определения в организме.
Использование широкого набора однотипных диагностикумов для выявления антигенов различной специфичности и маркеров токсинов позволяет осуществить раннюю этиологическую диагностику ОКИ, расширить число тестируемых патогенов (прежде всего, трудно диагностируемых) и выявитьмикст-инфекции. В результате проведенных исследований установлена высокая частота разнообразных по составу микст-инфекций (83,9%). Информация о присутствии у больного моно- или микст-инфекции и их структуре является основой для выбора дополнительных методов обследования больных. При этом, у больных с О-антигенами кампилобактерий или йерсиний установлена наиболее низкая нагрузка экзотоксинами, и поэтому при дальнейшем обследовании определение токсинов может быть признано нецелесообразным.
При выявлении большого числа О-антигенов и маркеров токсинов, особенно токсинов клостридий, усиливающих воспалительный процесс, не исключена сопутствующая реакция со стороны поджелудочной железы, что обусловливает необходимость применения ультразвукового исследования органов брюшной полости (поджелудочной железы) при микст-инфекциях.
Так как у обследованных нами больных частота выявления маркеров токсинов клостридий в1 различных сочетаниях в копрофильтратах в остром периоде составляет 64,5%, к моменту выписки снижается, но при этом сохраняется у 12,5%, существует необходимость более широкого обследования больных ПТИ на энтеротоксины клостридий.
При отсутствиирутинных методов диагностики кампилобактериозаиспользование поливалентного диагностикума для РКА позволяет напрямую выявить присутствие кампилобактерий (C.coli, C.jejimi, C.lari) при ОКИ и других заболеваниях.
Своеобразная динамика всех токсинов (нарастание к 4-6 дню от начала болезни с последующим снижением, а также более длительное присутствие и более высокая антигенная нагрузка) и цитокинов при гастроэнтероколитиче-ском варианте течения, в отличие от гастроэнтерита и энтероколита, свидетельствует о недостаточности защитных механизмов при поражении ЖКТ на всем протяжении и может быть предиктором развития различных иммунопатологических реакций и хронических заболеваний кишечника.
Внедрение результатов работы. Апробированные в данной работе методики используются в научной деятельности лаборатории по изучению токсических и септических состояний отделения НИЦ при МПФ ММА им. И.М. Сеченова на базе ГИКБ № 2 и ГКБ № 4 г. Москвы, в ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, в ИКБ "Норк" г. Еревана РА.
Результаты проведенной работы дополняют данные исследований синдрома интоксикации при ОКИ различной этиологии, полученные на кафедре инфекционных болезней МПФ ММА им. И.М. Сеченова, и используются в процессе преподавания курса инфекционных болезней.
Апробация работы. Основные положения и результаты работы доложены: на 7-ом Российском съезде инфекционистов «Новые технологии в диагностике и лечении инфекционных болезней» (Нижний Новгород, 25 - 27 октября 2006 г.); на Российской научно-практической конференции, посвященной 110-летию кафедры инфекционных болезней Военно-медицинской академии им. С.М.Кирова (Санкт-Петербург, 22-24 марта 2006г.); на 7-й научной конференции РАЕН с международным участием (Дагомыс, Сочи, 4 -7 сентября 2006 г); на Юбилейной Российской научной конференции с международным участием, посвященной 75-летию со дня рождения СП. Боткина (Санкт-Петербург, 29 мая-1 июня 2007 г.); на научно-практической конференции, посвященной 70-летнему юбилею больницы «Соколиная гора» (Москва, июль 2007 г.); в материалах Тринадцатой и Четырнадцатой Российской Гастроэнтерологической Недели (Москва, 22 - 24 октября 2007 г. и 6-8 октября 2008 г.); в материалах Тринадцатой и Четырнадцатой Российской-конференции «Гепатология сегодня» (Москва, 17-9 марта 2008 г., Москва 16-18 марта 2009 г); в материалах Евроазиатского конгресса инфекционистов (г. Витебск, Беларусь, 29-30 апреля 2008 г.); на Втором Санкт-Петербургском международном экологическом форуме "Окружающая среда и здоровье человека" (Санкт-Петербург, 1-4 июля 2008 г.); на IV Международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (Санкт-Петербург, 2-4 июня 2008 г.); на I Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 30 марта -1 апреля, 2009 года). Отдельные фрагменты работы опубликованы в журналах «Эпидемиология и инфекционные болезни», «Клиническая лабораторная диагностика», «Современные наукоемкие технологии», «Успехи современного естествознания», «Лечащий врач», «Ремедиум-Привол-жье», «Российский журнал Гастроэнтерологии, Гепатологии, Колопроктоло-гии», «Инфекционные болезни».
Диссертация апробирована на совместном заседании кафедры инфекционных болезней МПФ и лаборатории по изучению токсических и септических состояний при кафедре ММА им. И.М. Сеченова 11 марта 2009 г.
По теме диссертации опубликовано 37 научных работ.
18 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Бактериальные токсины и их роль в патогенезе острых бактериальных кишечных инфекций
С тех пор, как Е. Roux и A. Yersin в 1888 году впервые выделили от больного дифтерийный токсин и продемонстрировали его токсические свойства на экспериментальной модели, бактериальные токсины были признаны ведущими факторами патогенности, играющими исключительную роль в патогенезе многих бактериальных инфекционных заболеваний [21, 26, 28, 246, 496, 530, 532, 533, 546, 613]. БТ оказались тонким молекулярным инструментом, вмешивающимся во внутриклеточные процессы, изменяя дифференци-ровку, пролиферацию, рост, метаболизм чувствительных клеток и, как следствие, нарушая их интегративные связи, эффекторные функции, вплоть до гибели посредством индукции апоптоза. Столь активное участие в развитии инфекционного процесса на клеточном уровне не может не оказывать системного действия на организм [27, 176, 185, 206, 537, 551]. Перспективы совершенствования лечебной тактики и разработки вакцин при многих бактериальных инфекциях заключаются в расшифровке молекулярных механизмов действия БТ.
Более четкое определение роли и значения БТ в патогенезе инфекционных заболеваний открывает принципиально новые возможности в разработке методов их диагностики, лечения и профилактики заболеваний.
Достижения экспериментальной микробиологии, биохимии, генетики позволили охарактеризовать и установить химическую структуру, генетический контроль, основные механизмы действия многих токсинов возбудителей [34]. Так установлено, что различные бактерии способны вырабатывать сходные токсины, что в клинике инфекционных болезней проявляется сходством клинических проявлений различных по этиологии заболеваний [26]. Группа ОКИ является одной из наиболее полиэтиологичных, их клинические проявления, в основном, сведены в несколько синдромов, например, интоксикации, диарейный синдром (ГЭ, ЭК, гемоколит) и др. Нередко энтеропато генные бактерии вырабатывают не один, а несколько токсинов, что также может оказывать влияние на клиническую манифестацию заболевания.
Бактерии вырабатывают сотни различных белковых токсинов, которые могут быть разделены в зависимости от характера взаимодействия с клетками и вызываемого эффекта на пять групп: (1) повреждающие клеточные мембраны; (2) ингибиторы синтеза белка; (3) активирующие пути метаболизма, контролируемые посредниками (мессенджерами); (4) протеазы; (5) суперантигены, активирующие иммунный ответ макроорганизма. К 1-ой группе, в частности, относится а-токсин C.perfringens, ко 2-ой — ШТ и ШПТ, к 3-й — LT E.coli, ХЭТ, токсины А и В C.difficile [31, 533].
ШТ и ШПТ продуцируются рядом энтеропатогенных бактерий, из которых наиболее важными являются S.dysenteriae (серотип 1) и энтерогемор-рагические E.coli [449]. Кроме этого, имеются сообщения об изоляции из окружающей среды и кала больных с ОКИ штаммов V.cholerae, V.parahae-molyticus [462] и штамма A.haemolyticus [276], продуцирующих ШПТ токсинов, что свидетельствует о потенциальной возможности более широкой выработки ШТ [525].
Среди штаммов, принадлежащих к различным видам и родам семейства Enterobacteriaceae, Аг ШТ обнаруживался у всех штаммов S. dysenteriae 1 и их О" мутантов, различных E.coli, S.flexneri различных сероваров, кроме VI, сальмонелл и йерсиний псевдотуберкулеза и не выявляется у S- форм S.flexneri VI (Ньюкасл), S.boydi, S.sonnei, S.dysenteriae 2 и S.typhi. При этом установлена четкая обратная зависимость присутствия ШПТ и наличия в штаммах энтеробактерий кислых полисахаридных К (В ) антигенов. Аг ШТ, как правило, обнаруживается в штаммах, не способных синтезировать кислые К - антигены, независимо от принадлежности их к тому или другому роду или виду бактерий. При этом не важно, находится ли он в S- или в R форме, т.к. О" (R- форма) мутанты этих бактерий также синтезируют Аг ШТ. При утрате штаммами способности синтезировать К-Аг в процессе мутации в сторону К" 0+или К" О" у этих мутантов появляются АгШТ [5,14].
Возбудитель дизентерии впервые был изолирован Kiyoshi Shiga в 1898 от больного с диареей [592] и уже через несколько лет было установлено, что экстракт культуры S.dysenteriae при парентеральном введении кроликам вызывает паралич и смерть, однако только в 1972 г. появилось первое сообщение о частичной очистке этого токсина [338]. Сейчас получены уже модели кристаллических структур Шига и других токсинов (Рисунок 4). Согласно многочисленным исследованиям токсин, продуцируемый S.dysenteriae, обладает энтеро-, нейро- и цитотоксичностью, что является следствием действия единой молекулы токсина [339]. Целенаправленные исследования по изучению структурно-функциональной активности ШТ стали возможны только после получения полностью очищенной субстанции токсина в 80-х годах [468].
Очищенный ШТ проявлял цитотоксичность в культуре HeLa клеток, энтеротоксичность-в лигированных петлях тонкой кишки кроликов и летальность при парентеральном введении кроликам или мышам, и эта биологическая активность нейтрализовалась специфической антисывороткой, полученной при иммунизации животных токсоидом. Позже было продемонстрировано, что нейтрализующие антитела были эффективны в отношении некоторыми ШТ продуцируемых штаммов E.coli.
Одним из первых штаммов кишечной палочки с подтвержденной продукцией Шига-подобного токсина был штамм E.coli 0157:Н7, изолированный во время вспышки геморрагического колита в США [463]. В последующем была установлена способность вырабатывать сходные ШТ токсины более 120 штаммами других серотипов E.coli, некоторые из которых даже оказались непатогенными для человека [395].
Клиническая характеристика больных гастроинтестинальной формой бактериологически подтвержденного сальмонеллеза
Гастроинтестинальная форма сальмонеллеза была диагностирована у 66 обследованных нами больных. Диагноз устанавливался на основании кли-нико-анамнестических, лабораторных данных и во всех случаях сопровождался бактериологическим подтверждением. В 87,9%. случаев в качестве этиологического штамма высевалась S.Enteritidis группы D, в 9,1% случаев — S.Typhimurium группы В, по 1,5% S.Tshiongwe (С2) и S.Lindenburg (С2), 95,5% обследованных.больных поступили в стационар на 1-3 сутки от начала болезни.
Наибольшая часть больных сальмонеллезом (п=45) находилась в возрасте от 17 до 25 лет (68,2%), 9 больных были в возрасте от 26 до 35 лет (13,6%),. 6 пациентов (9,1%) - от 36 до 45 лет, 4 больных - в возрасте 46-55лет (6,1%), а 2 пациента были старше 56 лет (3,0%). В целом нами обследованы в основном пациенты до 45 лет (91,8%), преимущественно мужчины (84,8%).
Тяжесть и форму течения сальмонеллеза определяли согласно общепринятым методическим рекомендациям и классификациям [87, 93]. В 72,7%о случаев сальмонеллез протекал в среднетяжелой форме, в 15,2% - в тяжелой форме, легкое течение заболевания наблюдалось у 12,1% больных. У 37,9% находившихся на стационарном лечении больных, сальмонеллез протекал в ГЭ варианте (п=25), у 50,0% - наблюдался ГЭК вариант (п=33), у 12,1% больных — ЭК вариант. Легкое течение сальмонеллеза характеризовалось умеренными симптомами дегидратации и интоксикации, непродолжительным течением заболевания, у всех обследованных пациентов регистрировалась субфебрильная лихорадка продолжительностью 1-2 дня. Симптомы поражения органов пищеварения были незначительные и скоропроходящие: снижение аппетита и тошнота (37,5%), однократная рвота (25,0%), сухость во рту (12,5%) и обложенность языка. Все больные отмечали стул до 5 раз в сутки, жидкий, водянистый, зеленоватого цвета, продолжительностью 1-3 дня, у одного больного — до 10 раз в сутки. У половины больных в стуле регистрировалось появление слизи. Боли в животе, в основном, незначительные, носили схваткообразный характер (75,0%), преимущественно локализовались в эпигастральной области, у 2 больных были диффузными. У всех больных выявлена дегидратация I степени, симптомы поражения почек не наблюдались. Признаки поражения сердечно-сосудистой системы и нарушения водно-электролитного баланса не обнаружены. Лишь у 2 больных изменения периферической крови сводились к небольшому лейкоцитозу.
Наиболее значимые симптомы сальмонеллеза у больных среднетяжело-го течения в разгар заболевания представлены в таблице 16.
Как видно из таблицы, симптомы, дегидратации регистрировались в сочетании с признаками интоксикации. Начало болезни было острое с ознобом, температурная реакция в большинстве случаях (58,3%) была на уровне феб-рильных значений, длительностью 2-4 дня, а в 29,2% случаев - в диапазоне от 39 до 40С, у 6 больных наблюдалась субфебрильная реакция. Слабость и головная боль присутствовали соответственно в 93,8% и 16,7% случаев. Существенно чаще по сравнению с легким течением, отмечалось чувство жажды, сухость во рту (68,8%) и обложенность языка, бледность кожных покровов (12,5%); больные чаще жаловались на диффузные боли (62,5%) в области живота, а в 16,7% и в 20,8% присутствовали эпигастральные и мезогаст-ральные боли. Тошнота (52,1%) и рвота (50,0%) наблюдались примерно у половины больных, а в 14,6% наблюдалась повторная рвота.
С наибольшей частотой отмечался стул до 10 раз в сутки (61,5%), а примеси в стуле (в основном, в виде слизи) были отмечены у 66,7%. Продолжительность поноса в большинстве случаев составляла 4-6 дней. Интересно, что в 31,3% у больных пальпировалась спазмированная сигмовидная кишка, что первоначально (до бактериологического подтверждения) заставляло расценивать таких пациентов как больных дизентерией. У 39,6% наблюдаемых регистрировалась наклонность к гипотонии, практически у всех больных — тахикардия. Нарушения водно-электролитного баланса соответствовали дегидратации І-П степени.
Симптомы поражения почек:. олигурия отмечалась у 21,4% больных с повышением количества лейкоцитов и. эритроцитов, продолжительностью 1-2 дня. Со стороны периферической крови: умеренный лейкоцитоз выявлен у 57,1%, ускоренное СОЭ-у троих больных. При УЗИ органов брюшной полости у одного больного с ГЭК вариантом течения болезни выявлен реактивный: лимфаденит в правой подвздошной области у другого больного с ЭК течением, при колоноскопии диагностирован катаральный проктосигмоидит.
В таблице 17 представлены некоторые биохимические показатели анализа крови у больных с гастроинтестинальной формой среднетяжелого течения сальмонеллеза.
Как видно из представленных в таблице данных, отмечено некоторое повышение уровней общего билирубина и глюкозы крови, последнее, вероятно, связано с регидратационной терапией. Выявленные отклонения не имели достоверных отличий в сравнении с группой контрольных лиц. Все остальные показатели находились в пределах контрольных значений. Отсутствие выраженных изменений изученных показателей свидетельствует о благоприятном . преморбидном фоне обследованных пациентов и сохраняющихся высоких компенсаторных возможностях организма.
ЛПС-индуцированный апоптоз гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов, проточно-цитофлюориметрический анализ фрагментации ДНК
Мы использовали ранее описанную-экспериментальную систему [212, 213], имеющую следующие характерные особенности.
Апоптоз клеточных популяций индуцируется 2-мя различными дозами ЛПС - высокой, нецитотоксической (в условиях, когда не наблюдается некроз, но максимально индуцируется ЛПС-зависимый апоптоз), и низкой, субоптимальной дозой (в условиях, когда ожидаемая интенсивность ЛПС-зави-симого апоптоза на порядок меньше максимальной) ЛПС [200]. Это позволяет моделировать апоптоз как на пике инфекционно-воспалителъного ответа (высокая доза ЛПС), так и на стадии резолюции воспалительного ответа, ассоциированного с элиминацией эндотоксина (низкая доза ЛПС). При этом нами допускается предположение, что на стадии резолюции имеет место снижение концентрации ЛПС, по-крайней мере на один порядок.
Экспериментальная система позволяет зарегистрировать апоптоз гранулоцитов при непосредственном введении ЛПС в образцы цельной крови, без фракционирования клеточных популяций. При этом достигается интегральная и адекватная- оценка апоптоза, исключается влияние на этот про цесс неспецифической активации клеток и различных факторов, связанных с выделением клеточных популяций;
Система предполагает сочетание 3-х независимых методов исследований: краткосрочное культивирование цельной крови в оптимальных условиях, (длительность инкубации клеток 4ч), для исключения спонтанного апоптоза гранулоцитов, гематологический контроль образцов культивируемой крови с целью исключения цитотоксического воздействия ЛПС и выравнивания количества-клеток, и, наконец, проточная цитофлюориметрия гранулоцитов по маркерам апоптоза.
Образцы периферической крови были специально подобраны по следующим критериям: а) в крови здоровых доноров и реконвалесцентов абсолютное и относительное содержание гранулоцитов было сопоставимо и достоверно не отличались друг от друга; б) содержание белков, острой фазы (СРБ, фибриноген, церулоплазмин) и скорость оседания эритроцитов во всех образцах были сопоставимы и находились в пределах нормы.
ЛПС-индуцированный апоптоз гранулоцитов. Периферическую кровь больных и здоровых забирали в пластиковые пробирки, содержащие литий-гепарин (Vacuet, Greiner) и проводили нормализацию содержания клеток-эффекторов до уровня 5,6- 6,5 х 103 в 1 мкл во всех образцах цельной крови. Абсолютное и относительное количество гранулоцитов определяли с помощью автоматического гематологического анализатора Celly v2.20 (Hycel Diagnostics). Для индукции апоптоза к 0,5 мл образца периферической крови добавляли 0,5 мл среды RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глютамина и 10 мМ HEPES, а также 100 или 1000 нг/мл ЛПС S.enteritidis (Sigma Chemical) в конечном объеме 0,1 мл. Образцы инкубировали в круглодонных пластиковых пробирках при 37С в атмосфере, содержащей 6% СОг, в течение 4 ч. После окончания инкубации проводили гематологический анализ образцов с целью исключения цитотоксического воздействия ЛПС [212, 213].
Проточно-цитофлюориметрический анализ фрагментации ДНК. После инкубации образцов цельной крови в присутствии ЛПС клетки отмы вали 2 раза забуференным физиологическим раствором (ЗФР, рН=7,5) при 800g, 10 мин. После удаления эритроцитов лизирующим раствором и трехкратным отмыванием клеток ЗФР, клеточные мембраны перфорировали добавлением 70% этанола при - 20С в течение 4 ч. После завершения инкубации клетки отмывали 3 раза ЗФР и ресуспендировали в стабилизирующем буфере, содержащей 200 мМ какодилата калия, 25 мМ хлорида кобальта и 0,2 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (рН=6,6). Использовали тест-систему ApoAlertDNA (BD, Biosciences), позволяющую определить апоп-тотические клетки, содержащие фрагментированные участки ДНК методом Tunel [9,14]. Суть метода заключается в ник-трансляции dUTP-FITC терминальным дезоксинуклеотидилтрансферазой, которая катализирует включение dUTP-FITC в свободные З -концы фрагментов ДНК. Меченные dUTP ITC фрагменты ДНК в составе тотального ДНК (Tunel+) определяли путем окрашивания клеточного ДНК пропидий йодитом (PI). Количество ранних (Ти-пеҐРГ), поздних (Tunel+PI+) апоптотических клеток и интенсивность апопто-за (относительное содержание апоптотических фрагментов ДНК в единичной клетке) определяли на цитофлюометре FACSCalibur с использованием пакета программ CellQuest (Becton Dickinson) [266, 623].
Наиболее информативным при ранней диагностике ОКИ является исследование копрофильтрата или слюны на присутствие антигенов возбудителей. Проводимое антибактериальное лечение, как правило, не влияет на частоту положительных реакций в РКА, однако, может сокращать период выявления антигенов возбудителя из-за более быстрой санации организма.
На предметное стекло, размеченное восковым карандашом на сектора, наносят несколько отдельных капель подготовленного исследуемого КФ от больного, затем в каждую каплю добавляют по 1 капле соответствующего ко-агглютинирующего диагностикума, в одну из капель - взвесь несенсибилизи-рованных стафилококков (отрицательный контроль). В качестве положитель ного контроля на отдельном стекле смешивают каплю каждого диагностику-ма с 1 каплей ЛПС соответствующих бактерий, взятого в концентрации 10 — 20 мкг/мл. Капли перемешивают осторожным покачиванием стекла, не допуская слияния капель с различными диагностикумами. Результат реакции учитывают через 30 — 60 минут экспозиции стекол во влажной камере при просмотре стекол над вогнутым зеркалом (от микроскопа), регистрируя появление реакции агглютинации стафилококков.
Выявление О-антигенов и маркеров токсинов у больных бактериологически подтвержденным шигеллезом
Из 6 больных с бактериологически подтвержденным диагнозом острой дизентерии (заболевание протекало по ГЭ и ЭК вариантам течения - по 50,0%о) (5 - Зонне, 1 — Флекснера) при первом исследовании с помощью РКА проб КФ диагноз был подтвержден у всех. Из 5 больных с острой дизентерией Зонне у 2 больных выявлены только О-Аг шигелл Зонне, у одного - О-Аг Зонне в сочетании с О-Аг Флекснера, йерсиний псевдотуберкулеза I и энтероколитика О7.8, у 2-х пациентов наряду с О-Аг Зонне выявлены О-Аг сальмонелл: у одного - серогруппы В, у другого — серогруппы Сь D и йерсиний псевдотуберкулеза Ш. У больного с дизентерией Флекснера кроме гомологичного О-Аг найдены также антигены сальмонелл серогруппы С и йерсиний энтероколитика О7.8 (Таблица 27).
В динамике заболевания у троих больных повторно выявлены О-Аг Зонне: у одного больного - в сочетании с О-Аг йерсинией энтероколитика О7-8, У другого - в сочетании с О-Аг сальмонелл серогруппы С, йерсиний псевдотуберкулеза I и энтероколитика О7-8; У третьего - плюс еще О-Аг сальмонелл серогруппы Е. У четвертого больного найдены О-Аг сальмонелл серогруппы С и йерсиний псевдотуберкулеза I. Отрицательный результат РКА на антигены ши-гелл в динамике болезни зафиксирован у 2 больных.
В динамике болезни в пробах КФ произошло изменение состава Аг: исчезло 10 различных Аг и выявлено 8 новых. В среднем антигенная «нагрузка» в одной пробе КФ при первом исследовании составила 2,5 Аг, при повторном анализе - 2,2 Аг.
При первом исследовании Аг различных токсинов выявлены у 5 больных: у 4-х - по два маркера (C.perf. А с C.dif. А - у 2 больных, маркеры C.perf. А с ШТ - у одного и с ХЭТ - у другого); у одного больного выявлены только маркеры C.dif. В. При повторном исследовании маркеры токсинов не были выявлены. У больного с отрицательным первым анализом на Аг токсинов при втором исследовании были найденььвсе исследуемые нами токсины.
В среднем, «нагрузка» одной пробы КФ маркерами токсинов при первом исследовании составила 1,5, повторном — 0,8.
Таким образом, у всех больных с бактериологически подтвержденным шигеллезом при помощи РКА были выявлены О-Аг шигелл. Суммарная антигенная «нагрузка» в пробе КФ была выше, чем при сальмонеллезах. По итогам двух исследований у всех больных в пробах КФ были выявлены маркеры токсинов (часто энтеротоксин A C.perf. в различных сочетаниях), а также два и более Аг возбудителей кишечных инфекций (кроме одного больного).
Среди больных ОКИ с бактериологически не подтвержденным диагнозом (КИНЭ-1) при постановке РКА с 1-ой пробой КФ у 10 больных было установлено присутствие О-Аг сальмонелл (серогруппы С — в 60,0%, серогруп-пы Е - в 10,0%, серогруппы D - в 10,0%, серогруппы С и D - в 20,0% случаев), у 4 больных - О-Аг шигелл Флекснера, у 6 больных - О-Аг кампилобак-терий, у 15 больных - О-Аг йерсиний различных серотипов, у 129 больных были выявлены различные сочетания О-Аг, у 69 пациентов О-Аг кишечных возбудителей не были выявлены. В этой последней группе в 1-ой пробе КФ у 33 больных были выявлены Аг токсинов клостридий (у 20 - одновременно с маркерами ШТ), однако, у 36 больных Аг токсинов, равно как и О-Аг не было выявлено (КИНЭ-П). При исследовании 2-ой пробы КФ в группе КИНЭ-П лишь у 14 (5,1%) больных О-Аг и Аг токсинов повторно не найдены (КИНЭ-Ш).
С целью более подробного анализа структуры выявленных в I пробах КФ в разгар заболевания маркеров возбудителей и учитывая присутствие микст-Аг в описанных ранее группах, мы попытались выделить подгруппы больных (среди больных КИНЭ-1 - с бактериологически неподтвержденным диагнозом ОКИ), у которых в КФ в разгар заболевания (II проба КФ) были выявлены О-Аг сальмонелл, или шигелл, или йерсиний, или кампилобакте-рий (отдельно или в сочетании с Аг токсинов) или только Аг токсинов.
При первом исследовании КФ у 10 больных КИНЭ-1 были найдены моно-Аг сальмонелл (у 6 больных — серогруппы С, по одному больному — серогруппы Е или D, у 2-х — серогруппы С и D). В динамике заболевания у 3-х больных повторно были выявлены О-Аг сальмонелл серогруппы С, у 4-х -они исчезли. У части больных произошла смена состава антигенов и появление новых О-Аг других возбудителей. ШТ найден только у 2-х больных в 1-ой пробе КФ (Таблица 28). В целом, в динамике болезни в пробах КФ исчезло 10 различных О-Аг и выявлено 13 новых О-Аг, а также найдены маркеры токсинов в 6 случаях.
В среднем, Аг «нагрузка» в одной пробе КФ при первом исследовании составила 1,3 О-Аг, при повторном исследовании —1,6 О-Аг разных возбудителей кишечных инфекций. «Нагрузка» Аг токсинов в одной пробе КФ при первом исследовании составила — 0,2, при повторном исследовании - 0,9.
Таким образом, если при первом исследовании КФ у всех были найдены О-Аг сальмонелл, то в результате двух исследований у всех больных были выявлены уже микст-Аг, вследствие чего возросла «нагрузка» О-Аг возбудителей и маркерами токсинов в расчете на пробу КФ.
Данная группа для дальнейшего анализа была объединена с группой больных бактериологически подтвержденного сальмонеллеза (См. 4.2.), учитывая выявление в первой пробе КФ только О-Аг сальмонелл, приблизительно одинаковое соотношение различных вариантов течения болезни в этих двух группах и среднетяжелое течение болезни у всех больных. У 3 больных КИНЭ-1 моно-Аг шигелл Флекснера были найдены при первом исследовании (из них у одного — в сочетании с ШТ), у четвертого больного эти Аг были выявлены только во втором анализе (Таблица 29).
