Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Клиническое течение ВИЧ-инфекции 11
1.2. Патогенез ВИЧ-инфекции 16
1.3. Лабораторные маркеры прогрессирования и
мониторинга эффективности терапии ВИЧ-инфекции 19
1.4. Современные принципы терапии ВИЧ-инфекции 22
1.5. Резистентность ВИЧ
1.5.1. Механизмы возникновения резистентности ВИЧ 29
1.5.2. Методы исследования резистентности ВИЧ 32
1.5.3. Эпидемиология и клиническое значение резистентности 34
1.6. Мутации резистентности ВИЧ к антиретровирусным препаратам 39
1.6.1. Мутации устойчивости кНИОТ 40
1.6.2. Мутации устойчивости к ННИОТ 45
1.6.3. Мутации устойчивости к ингибиторам протеазы 48
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 52
2.1. Общая характеристика обследованных больных 52
2.2. Методы исследования 56
2.3. Методы математической обработки результатов 60
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 61
3.1. Клинико-лабораторная характеристика и мутации ВИЧ
у пациентов, не получавших ранее антиретровирусную терапию .61
3.1.1. Клинические проявления ВИЧ-инфекции у больных I группы 62
3.1.2. Лабораторные показатели ВИЧ-инфекции у обследованных больных, не получавших АРВТ 62
3.1.3. Изучение мутаций ВИЧ у больных, не получавших антиретровирусные препараты
3.1.4. Клинико-лабораторные показатели у больных I группы с учетом мутаций ВИЧ 69
3.2. Клинико-лабораторная характеристика и мутации ВИЧ у пациентов, получавших различные схемы антиретровирусной терапии 71
3.2.1. Клинические проявления ВИЧ-инфекции у пациентов, получавших антиретровирусную терапию 72
3.2.2. Лабораторные показатели ВИЧ-инфекции у больных II группы 74
3.2.3. Изучение мутаций ВИЧ у больных, получавших антиретровирусные препараты 76
3.2.4. Анализ частоты резистентности к индивидуальным антиретровирусным препаратам 82
3.3. Анализ клинико-лабораторных показателей у больных ВИЧ инфекцией, получавших антиретровирусную терапию,
с учетом резистентности 86
3.3.1. Спектр вторичных и СПИД-индикаторных заболеваний на различных стадиях ВИЧ-инфекции с учетом резистентности к антиретровирусным препаратам 87
3.3.2. Лабораторные показатели у больных ВИЧ-инфекцией на различных стадиях заболевания с учетом резистентности к антиретровирусным препаратам 88
3.4. Анализ причин развития резистентности к антиретровирусным препаратам у обследованных больных ВИЧ-инфекцией 96
3.5. Анализ эффективности антиретровирусной терапии у больных с резистентностью 104
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 108
Выводы 115
Практические рекомендации 116
Список литературы
- Патогенез ВИЧ-инфекции
- Методы математической обработки результатов
- Лабораторные показатели ВИЧ-инфекции у обследованных больных, не получавших АРВТ
- Спектр вторичных и СПИД-индикаторных заболеваний на различных стадиях ВИЧ-инфекции с учетом резистентности к антиретровирусным препаратам
Введение к работе
Актуальность темы. Широкая распространенность ВИЧ-инфекции во всем мире обуславливает огромную социальную, экономическую и демографическую значимость этого заболевания. Количество ВИЧ-инфицированных в мире по данным Всемирной организации здравоохранения на 2007 год превышает 30 миллионов человек. Ежегодно регистрируется около 2,5 миллионов новых случаев ВИЧ-инфекции и до 2 миллионов смертей пациентов в стадии СПИДа (UNAIDS, 2008).
В настоящее время ВИЧ-инфекция является объективной угрозой для населения нашей страны и серьезнейшей проблемой отечественного здравоохранения (Рахманова А.Г., 2000; Покровский В.В., 2003). Согласно официальной статистике, общее количество ВИЧ-инфицированных в России превышает 400 тысяч человек, при этом ежегодно увеличивается количество ВИЧ-инфицированных пациентов с клиническими проявлениями болезни, нуждающихся в специфическом лечении (Онищенко Г.Г., 2007).
История этиотропной терапии инфекции, вызванной вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), началась в 1987 году, когда был одобрен первый препарат, угнетающий репликацию вируса – азидотимидин. В последующие годы были разработаны другие препараты той же фармакологической группы – нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (НИОТ). Однако вскоре стало ясно, что при лечении одним или двумя препаратами эффект терапии непродолжителен из-за быстрого появления мутантных форм вируса со сниженной чувствительностью к антиретровирусным препаратам (АРВП) (Larder B.A., Kemp S.D., 1989; Shafer R.W., Schapiro J.M., 2005). Изучение различных этапов жизненного цикла ВИЧ привело к разработке других групп антиретровирусных препаратов, подавляющих репликацию ВИЧ. Сочетание трех или четырех препаратов (так называемая высокоактивная антиретровирусная терапия – ВААРТ) позволило во многих случаях подавить размножение вируса и добиться восстановления иммунной системы. С 1995 года ВААРТ широко применяется в странах Западной Европы и США, что привело к значительному снижению смертности от ВИЧ-инфекции, однако, не сняло проблему резистентности вируса иммунодефицита человека (Lucas G.M., 2005).
Современная антиретровирусная терапия позволяет подавить репликацию вируса и затормозить прогрессирование заболевания у 60-80% пациентов. При этом в подавляющем большинстве случаев неэффективность терапии связана с развитием резистентности ВИЧ к антиретровирусным препаратам. Распространенность первичной резистентности вследствие заражения от больных, получавших ранее антиретровирусную терапию, в различных популяциях ВИЧ-инфицированных индивидуумов колеблется по данным литературы от 5% до 30% и более. Эти обстоятельства указывают на необходимость определения резистентности вируса при выборе этиотропной терапии ВИЧ-инфекции у конкретного пациента (Bennett D.E. et al., 2008).
Следует отметить, что исследования резистентности к антиретровирусным препаратам штаммов ВИЧ, циркулирующих в Санкт-Петербурге и Ленинградской области, до сих пор носят крайне фрагментарный характер и не проводились систематически. Кроме того, в целом мало изучена клиническая и прогностическая значимость резистентности ВИЧ, а многие вопросы тактики ведения больных при появлении устойчивости вируса к проводимой терапии остаются не решенными.
Анализ в динамике клинико-лабораторных данных пациентов с ВИЧ-инфекцией, получающих различные схемы терапии, с учетом резистентности к антиретровирусным препаратам может прояснить некоторые до сих пор неясные вопросы в ведении таких больных, оптимизировать стратегию антиретровирусной терапии и повысить ее эффективность.
Цель исследования. Изучить клинико-лабораторные характеристики различных стадий ВИЧ-инфекции на фоне антиретровирусной терапии с учетом определения резистентности к ингибиторам обратной транскриптазы и протеазы.
Задачи исследования:
-
Определить характер и распространенность мутаций резистентности ВИЧ у больных ВИЧ-инфекцией, ранее не получавших антиретровирусную терапию, с учетом сроков инфицирования.
-
Изучить характер и распространенность мутаций резистентности ВИЧ у больных ВИЧ-инфекцией, получавших антиретровирусную терапию.
-
Представить динамику клинико-лабораторных показателей с учетом резистентности у ВИЧ-инфицированных больных, получающих различные схемы антиретровирусной терапии
-
Проанализировать причины развития резистентности ВИЧ у обследованных пациентов.
-
Проанализировать эффективность антиретровирусной терапии у больных с резистентными формами ВИЧ
Научная новизна. Впервые проведено систематическое исследование распространенности первичной резистентности, а также вторичной резистентности, возникшей на фоне применения различных схем антиретровирусной терапии у ВИЧ-инфицированных больных в Санкт-Петербурге.
Впервые продемонстрировано влияние некоторых полиморфных мутаций на клиническое течение ВИЧ-инфекции, уровень иммунологических и вирусологических показателей у пациентов, не получавших антиретровирусную терапию.
Дана комплексная оценка клинико-лабораторных показателей с учетом сведений о резистентности к антиретровирусным препаратам у больных ВИЧ-инфекцией, не получавших антиретровирусную терапию, а также получающих различные схемы терапии, в том числе включающие современные ингибиторы протеазы.
Практическая значимость. Обоснована роль различных факторов и преобладающее значение приверженности к терапии в формировании вторичной резистентности.
На основании проведенных исследований предложены наиболее рациональные режимы терапии ВИЧ-инфекции у пациентов с резистентностью ВИЧ к антиретровирусным препаратам.
Основные положения, выносимые на защиту:
Случаев первичной резистентности среди обследованных пациентов выявлено не было вне зависимости от сроков инфицирования. В связи с этим обосновывается нецелесообразность систематического исследования резистентности у всех пациентов в Санкт-Петербурге перед началом антиретровирусной терапии на данном этапе развития эпидемии ВИЧ-инфекции. Более рациональным представляется периодическое выборочное исследование первичной резистентности ВИЧ в фокусных группах.
Выявлена положительная корреляция наличия мутации E35D в гене протеазы ВИЧ с клинической стадией и уровнем вирусной нагрузки у ВИЧ-инфицированных пациентов, не получавших ранее антиретровирусную терапию, что может ускорять естественное течение ВИЧ-инфекции.
Приверженность к терапии и большое количество схем в анамнезе – наиболее важные факторы, определяющие развитие резистентности ВИЧ.
Исследование динамики лабораторных показателей у больных, получающих антиретровирусные препараты, выявило более выраженный иммунологический дефицит у пациентов с мутациями резистентности. В то же время назначение схем терапии на основе современных ингибиторов протеаз с учетом резистентности при условии хорошей приверженности позволяет улучшить иммунологические показатели и достичь стойкого подавления репликации вируса даже у пациентов с устойчивыми формами ВИЧ.
Личный вклад автора в проведение исследования. Автору принадлежит идея и планирование работы. Автор участвовал в определении диагностической и терапевтической тактики, клиническом обследовании и лечении большинства больных, включенных в исследование, контролировал проведение клинико-лабораторных мероприятий, самостоятельно осуществлял анализ архивной документации, статистическую обработку и интерпретацию
полученных результатов.
Внедрение в практику. Результаты работы внедрены в практическую деятельность профильных отделений клинической инфекционной больницы им. С.П. Боткина (С-Петербург), а также используются в учебном процессе кафедры инфекционных болезней, эпидемиологии и гигиены медицинского факультета СПбГУ.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на VIII и XI Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (2005, 2008); Ежегодной городской научно-практической конференции с международным участием «Здоровье молодых»(2005);. Первой и Второй конференции по вопросам ВИЧ/СПИДа в Восточной Европе и Центральной Азии (2006, 2008).
Материалы диссертации обсуждались на заседании кафедры инфекционных болезней, эпидемиологии и гигиены медицинского факультета СПбГУ.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 1 статья в журнале, рецензируемом ВАК.
Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 141 странице текста, включающего 40 таблиц и 1 рисунок. Список цитируемой литературы содержит 172 источника, в том числе 28 отечественных и 144 иностранных.
Патогенез ВИЧ-инфекции
В настоящее время клиническая картина ВИЧ-инфекции достаточно хорошо изучена [6, 16, 19, 20, 22, 44]. В ее развитии выделяют несколько стадий, постепенно переходящих одна в другую. В России в настоящее время используется клиническая классификация стадий ВИЧ-инфекции, предложенная В.И. Покровским в 2001 году (приложение 1) [18]. Данная редакция Российской классификации ВИЧ-инфекции рекомендована Приказом Министерства здравоохранения и социального развития России от 17.03.2006. Стадия 1 - стадия инкубации — период от момента заражения до появления клинических проявлений «острой инфекции» и/или выработки антител. Ее продолжительность обычно составляет от 3 недель до 3 месяцев, но иногда может затягиваться и до года. В этот период клинические признаки отсутствуют, антитела к ВИЧ не определяются, но возможно определение вируса или его фрагментов специальными методами.
Стадия 2 - стадия первичных проявлений - начинается с момента сероконверсии (появления антител к ВИЧ). В этот период активная репликация ВИЧ продолжается, а клинические проявления могут отсутствовать (бессимптомная форма, 2А) или иметь место в виде так называемой острой ВИЧ-инфекции без вторичных заболеваний (2Б) или с таковыми (2В). Острая ВИЧ-инфекция - преходящее состояние, напоминающее инфекционный мононуклеоз с признаками общей интоксикации, слабостью, лихорадкой, тонзиллитом, увеличением лимфатических узлов, печени и селезенки, и реже -с картиной полиартрита или кожными высыпаниями. Кроме того, могут отмечаться нарушения со стороны центральной нервной системы (ЦНС), которые характеризуются головными болями, острой обратимой энцефалопатией с потерей ориентации, ухудшением памяти и нарушением сознания [13]. Однако яркая «мононуклеозоподобная» симптоматика отмечается лишь у 15-30% больных с острой ВИЧ-инфекцией. У остальных отмечается 1 - 2 вышеперечисленных симптома в любых сочетаниях. Продолжительность клинических проявлений острой фазы ВИЧ-инфекции варьирует от нескольких дней до нескольких месяцев, однако, обычно она составляет 2-3 недели. Исключение составляет увеличение лимфатических узлов, которое может сохраняться на протяжении всего заболевания [11].
Острая ВИЧ-инфекция с вторичными заболеваниями наблюдается в 10-15% случаев у больных острой ВИЧ-инфекцией, у которых на фоне снижения уровня CD4+ лимфоцитов и развившегося вследствие этого иммунодефицита появляются вторичные заболевания различной этиологии (ангина, бактериальная пневмония, кандидозы, герпетическая инфекция и другие). Эти проявления, как правило, слабо выражены, кратковременны, хорошо поддаются терапии, но могут быть тяжелыми (кандидозный эзофагит, пневмоцистная пневмония) и в редких случаях даже иметь смертельный исход [24].
Стадия 3 - субклиническая — характеризуется медленным; прогрессированием иммунодефицита, компенсируемого за счет модификации иммунного ответа и избыточного воспроизводства С04-клеток. В крови обнаруживаются с помощью серологических методов (иммуноферментный анализ, иммуноблоттинг) антитела к ВИЧ, скорость репликации вируса, в сравнении со стадией первичных проявлений, замедляется. Единственным клиническим проявлением заболевания является увеличение лимфатических узлов (персистирующая генерализованная лимфаденопатия, ПГЛ), которое, однако, может и отсутствовать. Характерным для ВИЧ-инфекции является увеличение лимфатических узлов более одного сантиметра в диаметре в двух и более несоприкасающихся областях, за исключением паховых; длительность данного состояния, превышающая три месяца и отсутствие связи генерализованной лимфаденопатии с другими патологическими процессами и/или приемом медикаментов, способных вызвать данный эффект. Наиболее часто увеличиваются шейные, затылочные, подмышечные лимфоузлы. Они эластичны, не спаяны с подлежащей тканью, кожа над ними не изменена. Помимо ПГЛ в этой фазе могут наблюдаться увеличение печени, селезенки, астенический синдром [16, 21]. В этот период отмечается постепенное снижение уровня CD4+ лимфоцитов, в среднем со скоростью 50-70 клеток в 1 мкл за год. Длительность субклинической стадии может варьировать от 2-3-х до 20 и более лет, в среднем — 6-7 лет. На данной стадии бессимптомной инфекции и ПГЛ пациенты, как правило, к врачам не обращаются и выявляются при случайном обследовании [6, 16].
Стадия 4 - стадия вторичных заболеваний — характеризуется продолжающейся репликацией ВИЧ, которая сопровождается гибелью CD4 клеток и истощением их популяции. Это приводит к развитию на фоне иммунодефицита вторичных (оппортунистических) заболеваний, инфекционных и/или онкологических. Клинические проявления оппортунистических заболеваний, наряду с лимфоаденопатией, сохраняющейся у большинства больных, и обусловливают клиническую картину стадии вторичных заболеваний. В зависимости от тяжести вторичных заболеваний выделяют стадии 4А, 4Б, 4В [16, 18].
Стадия 4А - обычно развивается через 6-7 лет от момента заражения. Для нее характерны бактериальные, грибковые и вирусные поражения слизистых и кожных покровов, воспалительные заболевания верхних дыхательных путей. Обычно стадия 4А развивается у пациентов с уровнем С04-лимфоцитов ниже 500 клеток в мкл. У больных могут обнаруживаться понижение умственной и физической работоспособности, ночная потливость, периодический подъем температуры тела до субфебрильного уровня, неустойчивый стул, потеря массы тела менее 10%. Могут отмечаться поверхностные кожные проявления в виде грибковых (онихомикоз и рубромикоз стоп, кистей, голеней и других участков тела), вирусных (простой герпес, herpes Zoster, остроконечные кандиломы, вульгарные бородавки), бактериальных (стафилококковые и стрептококковые фолликулиты, импетиго, эктима) поражений, себорейного дерматита, псориаза, папулезной сыпи, а также поражений слизистых оболочек (афты, герпетические и бактериальные изъязвления, гингивиты, ангулярные хейлиты, кандидоз полости рта и прочие). Кроме того, нередко встречаются рецидивирующие инфекции верхних дыхательных путей, включая бактериальные синуситы.
Стадия 4Б (через 7-10 лет от момента заражения) - кожные поражения носят более глубокий характер и склонны к затяжному течению. Развиваются поражения внутренних органов. Кроме того, могут отмечаться локализованная саркома Капоши, поражения периферической нервной системы, туберкулез, необъяснимая пролонгированная лихорадка перемежающегося или постоянного типа, длящаяся более одного месяца, необъяснимая диаррея более одного месяца, потеря веса более 10% массы тела, гепатомегалия или гепатоспленомегалия. Обычно стадия 4Б развивается у пациентов с уровнем CD4+ лимфоцитов менее 350 клеток/мкл.
Стадия 4В (через 10 - 12 лет) характеризуется развитием тяжелых, угрожающих жизни вторичных (оппортунистических) заболеваний, их генерализованным характером, поражением ЦНС и соответствует стадии развернутого СПИДа. Основными среди протозойных инфекций являются пневмония, вызванная Pneumocystis carinii, токсоплазмоз головного мозга, криптоспоридиоз с диарреей более одного месяца. Изредка отмечаются изоспоридиоз, микроспоридиоз, висцеральный лейшманиоз, лямблиоз и амебиаз [16, 22].
Методы математической обработки результатов
Вторичные мутации устойчивости к ННИОТ. L100I, К101Р, Р225Н, F227L, M230L и К238Т - вторичные мутации, которые обычно возникают в сочетании с одной из первичных мутаций. L100I и К101Р обнаруживаются на фоне K103N и снижают чувствительность к NVP и EFV с 20 раз (в присутствии только K103N) до более чем 100 раз [120, 129]. Р225Н и K238T/N также обычно наблюдаются на фоне K103N и аналогично снижают чувствительность вируса к EFV и NVP. F227L практически всегда наблюдается совместно с V106A и синергично увеличивает резистентность к NVP. M230L, которая может встречаться изолированно, снижает чувствительность ко всем препаратам группы в 20 раз [84].
Малые мутации резистентности к ННИОТ. К этой группе мутаций относятся A98G, К101Е, V108I и V179D/E - часто встречающиеся мутации, снижающие чувствительность вируса к NVP и EFV в 2-5 раз. Мутация K103R, которая встречается примерно у 1% нелеченых индивидуумов, изолированно не вызывает резистентности к ННИОТ, однако в сочетании с V179D снижает чувствительность к NVP и EFV примерно в 15 раз [120]. V179D и, редко, A98G и VI08 встречаются у пациентов, которых никогда не лечили ННИОТ [138]. Оптимальная тактика выбора ННИОТ для пациентов, инфицированных ВИЧ, содержащим эти мутации, не разработана, хотя установлено, что исходная слабая резистентность не уменьшает вирусологический ответ на схемы первой линии терапии, содержащей ННИОТ, эфавиренц и этравирин более предпочтительны в таких случаях, чем невирапин, поскольку эти два ННИОТ, как правило, более активны [35].
Прочие мутации резистентности к ННИОТ. Ряд высокополиморфных мутаций в гене обратной транскриптазы, таких как K101Q, I135T/M, VI791 и L283I, снижают чувствительность к невирапину и эфавиренцу примерно в 2 раза и могут действовать синергично с первичными мутациями резистентности к ННИОТ. Другие мутации, такие как L74V, H221Y, K223E/Q, L228H/R и N3481, отбираются нуклеозидными ингибиторами обратной транскриптазы, однако также вызывают слабое снижение чувствительности к ненуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы [52]. При этом есть многочисленные свидетельства того, что MP AT I типа повышают чувствительность к ННИОТ [141, 158].
С увеличением количества препаратов в этой группе ее отдельные представители приобретают все более специфическую роль в терапии больных ВИЧ-инфекцией. Ритонавир используется только для фармакокинетического бустирования. Бустированные ритонавиром лопинавир, атазанавир, фозампренавир и, реже, саквинавир используются для первой линии терапии. Бустированные типранавир и дарунавир, а также лопинавир, используются для терапии спасения. Нельфинавир, который не может быть усилен ритонавиром, а также небустированные атазанавир и фозампренавир являются альтернативными, но субоптимальными вариантами для первой линии терапии из-за более высокого риска вирусологического провала из-за лекарственной устойчивости по сравнению с бустированными ингибиторами протеазы. Хотя индинавир/ритонавир может быть эффективным в качестве первой линии терапии или терапии спасения, его применение не рекомендуется из-за высокого риска нефролитиаза [81].
Ингибиторами протеазы отбирается больше мутаций, чем любым другим классом АРВП. Эффект мутаций резистентности к ИП на чувствительность к отдельным препаратам этой группы может быть сложно оценить, когда в одном и том же вирусе содержится множество таких мутаций, или когда мутации встречаются в необычных сочетаниях. На чувствительность к РІП могут также влиять мутации в сайтах расщепления в гене gag. Хотя для формирования клинически значимой устойчивости к бустированным ритонавиром ингибиторам протеазы часто требуется большое количество мутаций, однако в ряде случаев наличие уже одной мутации может указывать на то, что какой-то из ИП, даже усиленный ритонавиром, может оказаться неэффективным [89, 110]. Многие мутации в гене протеазы являются дополнительными, или вторичными, и компенсируют сниженную репликативную активность вируса с большими (первичными) мутациями.
Большие мутации резистентности к ИП. В таблице 1.4 приведены 17 положений в гене протеазы ВИЧ, мутации в которых имеют наибольшее клиническое значение. Мутации в 13 из этих 17 позиций снижают чувствительность к одному или более ингибиторам протеазы (позиции 23, 30, 32, 46, 47, 48, 50, 54, 76, 82, 84, 88 и 90). Мутации в оставшихся 4 из 17 положений (24, 33, 53 и 73) встречаются достаточно часто и имеют разнонаправленные эффекты на чувствительность к разным ИП [129]. Наличие мутаций L23I, D30N, M46I/L, G48V/M, I84V, N88D/S и L90M является относительным противопоказанием для использования нельфинавира, поскольку при их наличии ожидаемый вирусологический ответ на терапию нельфинавиром ниже по сравнению с другими ИП [156]. I50L, N88S, а также, вероятно, I84V - относительное противопоказание для использования
Лабораторные показатели ВИЧ-инфекции у обследованных больных, не получавших АРВТ
Оценка иммунного статуса у рассматриваемых групп EH JTJ_ инфицированных пациентов включала в себя изучение показателей т_ клеточной системы иммунитета: определение общего количества лимфоцитов, определение процентного и абсолютного числа зрелых Т-лимфоцитов (CD3—і-) и двух основных субпопуляций - хелперов (CD4+) и цитотоксичесмеих лимфоцитов (CD8+), иммунорегуляторного индекса CD4/CD8 (Кетлинсісий С.А., Калинина Н.М., 1998). Исследования проводились методом проточиной цитометрии на цитофлюориметре FACSCalibur (BD Biosciences, США). Анализ иммунологических показателей больным II группы проводился с интервалozrvi з месяца.
Вирусная нагрузка ВИЧ РНК у больных ВИЧ-инфекцией определялась с помощью тест тест-системы «Amplicor HIV-1 Monitor test» фирмы «Rocrxe».. Данная тест-система представляет собой систему количественного определения вирусной РНК в плазме крови в сочетании с амплификацией. Вирусная нагрузка определялась всем обследованным больным, при наличии показаними — исследовалась в динамике.
Определение устойчивости ВИЧ выполнялось с помопзрыо генотипирования или виртуального фенотипирования с использованием различных наборов для генотипирования. Материал от 12 пациентов I группы и 53 больных II группы исследовался в Национальном Микробиологическом Центре (Instituto de Salud Carlos III, Мадрид, Испания) в рамках Совместного проекта по Молекулярной Эпидемиологии и Мониторингу Лекарственной Устойчивости штаммов ВИЧ-1 в Восточной Европе. Тестирование 24 больных I группы и 21 пациента II группы проводилось с помощью наборов ViroSeq HIV-1 Genotyping System (Abbot Molecular Diagnostics, США). Тестирование с помощью системы Virtual Phenotype (Virco, Бельгия) было проведено для 27 больных I группы и 4 больных II группы. Резистентность у одного пациента из группы II изучалась с помощью набора TRUGENE HIV-1 Genotyping Kit (Trugene, США).
Последовательность выполнения генотипированияс помощью системы ViroSeq HIV-1 Genotyping System следующая. На первом этапе проводят выделение РНК ВИЧ из плазмы пациента, затем обратную транскрипцию и количественное измерение продукта обратной транскрипции (эти этапы аналогичны процедуре определения вирусной нагрузки). Дальнейшее проведение исследования возможно при обнаружении вирусной нагрузки более 2000 копий/мл плазмы. Далее проводят полимеразную цепную реакцию (ПНР), в которой амплифицируют фрагмент ДНК, состоящий из гена протеазы (кодоны 1-99) и двух третей гена обратной транскриптазы (кодоны 1-335) Далее продукты ПЦР секвенируются с помощью автоматического секвенатора ABI PRIZM 3100 Genetic Analyzer с применением технологии капиллярного электрофореза. Для секвенирования используют семь различных праймеров, что обеспечивает двух- или трехкратное перекрывание каждого кодона при секвенировании, что увеличивает достоверность результатов. Сравнение нуклеотидной последовательности, выявленной в результате секвенирования, проводится с последовательностью штамма ВИЧ-1 pNL4-3 (Adachi A. et al., 1986). Анализ выявленных мутаций и определение чувствительности к различным АРВП осуществляется на основе базы данных резистентности ВИЧ-1 университета Los Alamos и выводится в виде печатного отчета.
В случае виртуального фенотипирования после секвенирования и определения мутаций проводится сравнение с базой данных, содержащей сведения о парах генотип-фенотип, и соответствующая интерпретация результатов.
Обследование пациентов I группы на резистентность проводилось однократно (за исключением одного случая, когда тестирование проводилось повторно для подтверждения результата). Пациенты II группы обследовались также однократно, однако у 10 больных с резистентностью тест выполнялся повторно через некоторое время после первого обследования и у одного пациента - 3 раза.
Также больным проводились исследования общеклинических анализов крови, выполненных на гематологическом анализаторе "Microscobos" (Франция), мочи, копроцитограммы, анализа кала на яйца глистов и простейшие по общепринятым методикам; анализов слюны и мочи на определение клеток, содержащих цитомегаловирус; микроскопии мокроты на предмет обнаружения возбудителя пневмоцистоза, мочи на предмет обнаружения криптококков, общеклинических, биохимических, серологических анализов ликвора, биохимических анализов крови по общепринятым методикам включающие определение билирубина сыворотки крови по методу Ендрасика и Клегорна (норма 8,5-20,5 мкмоль/л), активности аланинаминотрансферазы энзиматическим кинетическим методом (норма до 40 Ед/л), тимоловой пробы по Мак-Лагану ( в норме не более 5 ед. экстинции), активности щелочной фосфатазы (норма до 170 МЕ/л), гаммаглютамилтранспептидазы (норма до 60 ед.), протромбинового индекса по Квину (норма 85-105%), белковых фракций с вычислением альбумино-гаммаглобулинового коэффициента (в норме 3,0 ед.); посевов крови, ликвора, мочи, кала, мокроты, отделяемого со слизистой оболочки ротовой полости на бактериальную флору и грибы; иммуноферментных анализов крови с токсоплазменным, туберкулезным, цитомегаловирусным, разных типов герпесным антигенами (по показаниям проводилось исследование на микоплазменный, орнитозный, хламидийный, листериозный антиген).
Спектр вторичных и СПИД-индикаторных заболеваний на различных стадиях ВИЧ-инфекции с учетом резистентности к антиретровирусным препаратам
Достоверно чаще резистентные варианты ВИЧ выявлялись также у пациентов, у которых в анамнезе (как правило, в самом начале терапии) использовались нестандартизованные схемы АРВП. Так, резистентность ВИЧ обнаружена у всех больных, у которых первой схемой терапии был один препарат из группы нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы (2 пациента), у 75% пациентов, у которых первой схемой было сочетание двух НИОТ (2 из 8), в 100% случаев, когда первой схемой было сочетание одного НИОТ и ингибитора протеазы (2 пациента). В то же время резистентность ВИЧ зафиксирована лишь у 3 из 28 (10,7%) индивидуумов, у которых первой схемой была тритерапия 2 НИОТ + ННИОТ, и у 8 из 35 (22,9%) больных, которые получали 2 НИОТ + ИП (различия между последними двумя подгруппами недостоверны, р=0,178). Необходимо отметить, что упомянутые нестандартизованные схемы терапии использовались у пациентов, терапия которых была начата в конце 90х годов.
Анализ взаимосвязи генотипа ВИЧ и выявления устойчивых форм вируса показал, что резистентность наблюдается достоверно чаще у больных,
Признак Отношение шансов 95% доверительный интервал Достоверность отличий Время от начала АРВТ до обследования на резистентность 1,0 0,98-1,03 Р=0,791 Количество разных схем АРВТ в анамнезе 2,23 1,23-4,04 Р=0,009 Наличие перерывов в терапии 1,7 0,24-12,27 Р=0,598 Субоптимальные схемы терапии в анамнезе 1,01 0,08-13,50 Р=0,996 Низкая приверженность к терапии в анамнезе 56,07 5,20-604,50 Р=0,001 100 зараженных вирусом подтипа В (10 из 14 больных), чем у зараженных ВИЧ подтипа А1 (1 из 9 больных, р=0,007). Однако следует отметить, что среди больных, зараженных этими двумя подтипами вируса, наблюдались существенные отличия по встречаемости пациентов с перерывами в терапии и плохой приверженностью. Так, среди 9 пациентов с генотипом А1 только у 4 (44%) были перерывы в терапии и не было ни одного больного с низкой приверженностью к лечению. А среди пациентов с генотипом В перерывы в терапии имели место у 10 из 14 (71%), а низкая приверженность отмечена у 6 (42,9%, отличия от группы с подтипом ВИЧ А1 достоверны, р=0,03). В связи с этим влияние собственно генотипа на вероятность развития резистентности представляется сомнительной.
Статистический анализ, направленный на выявление наиболее значимых и независимых друг от друга факторов, ассоциированных с резистентностью (логическая регрессия), показал, что такими факторами являются отсутствие приверженности к лечению (отношение шансов 56,1, 95% доверительный интервал 5,2-604,5, р=0.001), а также наличие большого количества различных схем терапии в анамнезе (отношение шансов 2,2, 95%) доверительный интервал 1,23-4,04, р=0.009). Длительность терапии, наличие перерывов, субоптимальных схем терапии в анамнезе, а также генотип не оказывали статистически достоверного независимого влияния на вероятность формирования резистентности (таблица 3.30).
Клинические примеры. Больной С, 1976 г.р., наблюдается в дневном стационаре 21 отделения КИБ им. С.П.Боткина с 2001 года с диагнозом: ВИЧ-инфекция, стадия ВЗ (4Б по В.И. Покровскому). Хроническая часторецидивирующая герпетическая инфекция. Персистирующий ОФК. Волосатая лейкоплакия. Кондиломы перианальной области. ВИЧ-энцефалопатия. Сопутствующие заболевания: хронический вирусный гепатит В. ВИЧ-инфекция диагностирована в 1995 году. Инфицирован при гомосексуальных контактах, год инфицирования неизвестен. В декабре 2001 года начата антиретровирусная терапия: видекс + зерит. Препараты принимал нерегулярно. В декабре 2003 на фоне терапии отмечено лабораторное прогрессирование заболевания (резкое снижение количества CD4+ лимфоцитов: с 310 кл/мкл (21%) от 17.12.02 до 23 кл/мкл (2%) от 15.12.03).
Схема АРВТ была изменена 08.01.04 на комбивир + криксиван + ритонавир. На фоне новой терапии состояние больного было клинически стабильным, отмечалась медленная положительная динамика уровня CD4+ клеток (максимум - 7.11.05, 127 кл/мкл (5%)). Однако в марте 2006 года их количество вновь резко снизилось (86 кл/мкл (7%) от 15.03.06; 33 кл/мкл (2%) от 26.06.06).
Больной был обследован на резистентность, выявлены мутации лекарственной устойчивости в гене обратной транскриптазы: M184V и K103N, в гене протеазы M46L. Виртуальный фенотип:
На основании результатов анализа с 24.07.06 назначена новая схема АРВТ: комбивир + реатаз, которую больной принимает по настоящее время. На фоне этой терапии зафиксировано подавление репликации ВИЧ (вирусная нагрузка - 10 800 копий/мл от 29.08.06; 400 копий/мл от 10.11.06 и 04.04.07), однако количество CD4+ клеток остается очень низким (61 кл/мкл (4%) от 10.11.06; 36 кл/мкл (5%) от 04.04.07). В сентябре 2006 г. госпитализирован с жалобами на выраженную слабость, лихорадку, кашель. При обследовании установлен диагноз инфильтративный туберкулез верхних долей обоих легких. Больной был переведен в ГТБ №2, где после дообследования был установлен диагноз: Диссеминированный туберкулез легких в фазе инфильтрации, МБТ+. Больной получал протуберкулезную терапию (изониазид, пиразинамид, рифампицин, этамбутол) с положительным эффектом. К концу 2007 года достигнута клиническая стабилизация и ремиссия ВИЧ-инфекции на фоне ВААРТ.
В данном случае пациент в течение 2 лет нерегулярно принимал дитерапию (D4T + DDI), что привело к лабораторной прогрессии. Смена терапии на тритерапию AZT + ЗТС+ IDV/r позволила еще на 2 года стабилизировать течение заболевания, однако на фоне низкой приверженности была вновь зафиксирована лабораторная прогрессия. Обследование на резистентность выявило наличие всего трех мутаций резистентности: M184V в гене ОТ, которая достаточно типично возникает при терапии AZT+3TC; M46L в гене протеазы, которая иногда отбирается на фоне терапии индинавиром, однако не ассоциирована с клинически значимым уровнем устойчивости к данному препарату, а также мутация K103N, которая отбирается при приеме ненуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы и приводит к высокой устойчивости ко всем препаратам этой группы. Последнее обстоятельство было крайне удивительным, поскольку больной никогда не принимал препараты из этой группы. Достоверность результатов анализа было подтверждено повторным обследованием на резистентность, также выявившем наличие замены K103N. В данном случае возможно предполагать наличие первичной резистентности у данного больного. В то же время выявление этой мутации позволило избежать назначения ННИОТ данному пациенту и успешно использовать схему на основе атазанавира. Однако следует отметить, что на фоне низкого количества CD4+ клеток остается высокой вероятность появления вторичных заболеваний.
Больной Д., 1964 г.р., наблюдается в дневном стационаре 21 отделения КИБ им. С.П.Боткина с февраля 2003 года с диагнозом: ВИЧ-инфекция, стадия СЗ. Часто рецидивирующая инфекция вируса простого герпеса (с 2003г). Персистирующий ОФК. Рецидивирующие пневмонии (с 1997г). Персистирующая лихорадка и диарейный синдром (1997). Дефицит массы тела 10% (1997). Себорейный дерматит. ВИЧ-энцефалопатия II ст. ВИЧ-полинейропатия. Онихомикоз стоп. Ангулярный хейлит.
![Клинико-эпидемиологическая характеристика ВИЧ-инфекции и поведенческих реакций у ВИЧ-инфицированных в Новгородской обл. [Электронный ресурс]](/i/i/4301/189413.png "Клинико-эпидемиологическая характеристика ВИЧ-инфекции и поведенческих реакций у ВИЧ-инфицированных в Новгородской обл. [Электронный ресурс] Ткаченко Татьяна Николаевна")
