Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Методики качественной и количественной идентификации белков в смесях с применением масс-спектрометрии 10
Развитие применения масс-спектрометрии в протеомике 10
Подходы к идентификации белков методами масс-спектрометрии, существующие на данный момент 12
Peptide mass fingerprint 13
Подход bottom-up 14
Подход top-down 15
Секвенирование de novo 18
Метод точных массово-временных меток 19
Разрешающая способность и точность измерения масс 23
Масс-спектрометрия ИЦР ПФ 25
Подходы в количественной протеомике 29
Совмещение методов атомно-силовой микроскопии и масс-спектрометрии.32
Источники ионизации 35
Источник ионов на основе электрораспыления в вакуум 35
MALDI при атмосферном давлении 37
Источник MALDI при атмосферном давлении 37
APCI - химической ионизации при атмосферном давлении 41
Глава 2. База точных массово-временных меток для протеома мочи человека 42
Объект исследования 42
Методы исследования 44
Сбор образцов мочи 44
Подготовка проб для хромато-масс-спектрометрии 44
Хромато-масс-спектрометрия 45
Анализ данных и идентификация белков 47
Структура базы данных 49
Созданная база точных массово-временных меток для протеома мочи человека 52
Глава 3. Количественная протеомика 53
Пробоподготовка 53
Получение образцов мочи 53
Получение пептидов, меченных О 53
Хромато-масс-спектрометрический эксперимент 55
Обработка результатов эксперимента 55
Выделение моноизотопных пиков однозарядных ионов 55
Поиск по АМТ-базе 56
Объединение результатов поиска 56
Корректировка интенсивностей пиков 56
Схема сравнительно-количественного анализа 59
Модельный эксперимент 61
Глава 4. Подход к совмещению методов атомно-силовой микроскопии и масс-спектрометрии 64
Модельный эксперимент №1 65
Модельный эксперимент №2 66
Заключение 69
Список литературы
- Метод точных массово-временных меток
- Подготовка проб для хромато-масс-спектрометрии
- Хромато-масс-спектрометрический эксперимент
- Схема сравнительно-количественного анализа
Введение к работе
Введение и актуальность проблемы
При помощи современных методов, основанных на масс-спектрометрическом анализе, можно исследовать биологические объекты самого разного происхождения и сложности. Это стало возможным благодаря открытию новых методов ионизации вещества: метода электроспрей и метода лазерной десорбции/ионизации из матрицы (МАЛДИ) – которые позволили переводить в газовую фазу и одновременно ионизировать большие биологические молекулы, такие как пептиды, белки и полинуклеотиды. Среди методов масс-спектрометрии, используемых в протеомных исследованиях, масс–спектрометрия ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье (ИЦР ПФ) занимает особое место. Главными достоинствами этого метода являются: сверхвысокая разрешающая способность и рекордная точность измерения масс. С помощью современного масс-спектрометра ИЦР ПФ можно однозначно как идентифицировать индивидуальные биомолекулы, так и определять состав их смесей.
В настоящее время полностью расшифрованы геномы различных организмов, в том числе и человека. В связи с исследованиями многообразия белков, содержащихся в различных биологических объектах, возникла новая фундаментальная концепция, названная «протеом» (ПРОТЕиновое дополнение к генОМу). Создана новая дисциплина - протеомика, которая призвана дополнить и аннотировать информацию, содержащуюся в геномах. Современная масс-спектрометрия (в том числе, и ИЦР ПФ) занимает передовые позиции в решении основной задачи протеомики идентификация белков. В настоящее время также ведется активная разработка масс-спектрометрических методов количественного анализа протеомов.
Масс-спектрометр ИЦР ПФ обладает ограниченным динамическим диапозоном, в то же время, протеомы различных организмов содержат белки в широком диапазоне относительных концентраций. И поэтому необходимо использовать масс-спектрометрии ИЦР ПФ в комбинации с существующими методами разделения (жидкостная хроматография, электрофорез). Время удерживания пептида (продукта гидролиза белка энзимом трипсин) на хроматографе может являться дополнительным параметром при идентификации пептида.
В работе разрабатывались и оптимизировались методы, использующие масс-спектрометрию ИЦР ПФ для исследования протеомного состава одной из физиологических жидкостей человека – мочи. В работе были разработаны и использованы новые подходы для обработки и интерпретации полученных данных, в том числе, для сравнительного количественного анализа протеома. Также проводилась разработка подхода для совмещения методов атомно-силового микроскопа и масс-спектрометрии, где масс-спектрометрические методы использовались для идентификации молекул, обнаруживаемых АСМ.
Цели и задачи
-
разработать хромато-масс-спектрометрические методики анализа протеомного состава мочи человека;
-
разработать и применить в реальных исследованиях метод точной массово-временной метки для анализа протеома мочи;
-
создать новую базу данных, состоящую из точных массово-временных меток, для быстрого поиска и идентификации белков содержащихся в моче человека;
-
разработать методику сравнительного количественного анализа протеома, реального биологического объекта;
-
разработать подход масс-спектрометрической идентификации белков детектируемых методами атомно-силовой микроскопии.
Научная новизна работы
-
Cоздана база данных точных массово-временных меток триптических пептидов протеома мочи человека.
-
Cоздана новая процедура нормирования времен удерживания на колонке жидкофазного хроматографа триптических пептидов белков, содержащихся в моче человека, которая может быть использована для идентификации белков методом точных массово-временных меток.
3. Разработан новый метод для сравнительного количественного анализа на основе использования методов точной массово-временной метки и изотопного мечения с применением концепции гипотетической аминокислоты «аверагин» для коррекции значений интенсивности пиков пептидов в спектрах.
4. Исследован протеомный состав мочи здорового человека, при помощи новой хромато-масс-спектрометрической методики, основанной на методе точной массово-временной метки. Обнаружено 39 новых генных продуктов.
5. Предложен подход совместного использования методов атомно-силовой микроскопии и масс-спектрометрии для идентификации и количественного определения содержания белков при сверхмалых концентрациях.
Практическая значимость работы
Разработанные хромато-масс-спектрометрические подходы для качественного и количественного анализа биологических жидкостей человека могут быть использованы при разработке методов диагностики различных патологий, вызванных, в том числе, заболеваниями.
Новая база данных точных массово-временных меток может использоваться для высокопроизводительного анализа протеома мочи человека при поиске биомаркеров различных заболеваний.
Подход, разработанный для идентификации белков, детектируемых методами атомно-силовой микроскопии может применяться для исследования других объектов, содержащихся в сверхнизких концентрациях в реальных биологических жидкостях.
Личный вклад автора
Материал, представленный в диссертации, получен при непосредственном участии автора как в постановке задачи, так и при проведении исследований. База данных точных массово-временных меток создавалась автором совместно с Д.М. Автономовым (ИНЭП ХФ РАН), И.А. Поповым (ИБХФ РАН) и А.С. Кононихиным (ИНЭПХФ РАН). Метод количественного анализа был разработан автором совместно с Д.М. Автономовым (ИНЭП ХФ РАН). Подход к совместному использованию методов атомно-силовой микроскопии и масс-спектрометрии был разработан совместно с А.С. Батуриным, Е.В. Дедковой (МФТИ (ГУ)). Диссертационная работа выполнена в Институте энергетических проблем химической физики Российской академии наук, в Лаборатории ионной и молекулярной физики, часть работ выполнялась автором параллельно в Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук в период с 2005 по 2011 год.
Защищаемые положения
-
новая база данных точных массово-временных меток триптических пептидов протеома мочи;
-
новый метод количественного анализа протеома физиологических жидкости человека, основанный на использовании методик точной массово-временной метки и изотопного мечения триптических пептидов изотопом 18O;
-
новая процедура нормирования времен удерживания на хроматографической колонке и идентификации пептидов;
-
метод идентификации белков при сверхмалых концентрациях с использованием масс-спектрометрии и атомно-силовой микроскопии.
Апробация работы
Результаты работы докладывались на следующих российских и международных конференциях: 58-ая Ежегодная конференция американского масс-спектрометрического общества «Масс-спектрометрия и смежные темы», Солт Лейк Сити, США, 23-27 мая 2010; 4-я Всероссийская конференция «Фундаментальные вопросы масс-спектрометрии и ее аналитические применения», Звенигород, Россия, 10 -14 октября 2010; 8-ая Международная конференция организации “Протеом Человека” (HUPO), Торонто, Канада, 26-30 сентября 2009; 57-ая Ежегодная конференция американского масс-спектрометрического общества «Масс-спектрометрия и смежные темы», Филадельфия, США, июнь 2009.
Публикации
Основное содержание диссертации опубликовано в работах, список которых приводится в конце автореферата. Работы, результаты которых изложены в диссертации выполнены при поддержке грантов РФФИ, INTAS, Миннауки.
Структура и объем диссертации
Метод точных массово-временных меток
Качественная и количественная протеомика - разделы науки, основным предметом изучения которой являются белки, их структура и функции, их взаимодействия в живых организмах, в том числе в человеческом, определение их количества в реальном объекте. Активное развитие она получила в последние два десятилетия, когда были созданы и доведены до коммерческой применимости физические методы исследования, необходимые для высокопроизводительного белкового анализа, однако сам термин "протеомика" был впервые применен лишь в 1997 году (1). Если кратко взглянуть на историю развития масс-спектрометрии, можно выделить несколько основополагающих моментов, лежащих на пути к ее применению в этой области:
Продемонстрированы Микро- и нано- электроспрей (8) В 1994 году также был проведен первый конгресс "От генома к протеому" в Сиене, на котором впервые был предложен новый термин протеом, обозначающий белки, закодированные геномом в определенное время, в определенной клетке, ткани, особи и т.д. Важным открытием прошлого века стало частичное понимание структуры ДНК, осознание важности генома. За последние десятилетия были отсеквенированы геномы более восьмисот организмов, включая грибы, растения, бактерии, а также геном человека, окончательный вариант генома которого был завершен лишь в 2003 году (9), два года спустя, после опубликования предварительной версии в 2001 (10) (11). Но, несмотря на наличие информации о последовательностях ДНК, остается много нерешенных биологических вопросов. В человеческом организме более 23000 генов (12) по которым могут экспрессироваться более миллиона различных белков (13) благодаря альтернативному сплайсингу, однонуклеотидным полиморфизмам, множественным пост-трансляционным модификациям (см. Рис. 1). Для понимания того, как функционирует живая клетка, не достаточно иметь информацию лишь о "схемах" белков (информацию хранящуюся в ДНК), надо исследовать сами генные продукты (белки). Исследование белков привлекало интерес ученых уже давно, активные работы по данному направлению ведутся почти сто лет. Раньше, из-за ограниченности доступных методик, исследователи могли провести всю жизнь, изучая лишь один единственный белок, хотя уже тогда было понятно, что один белок сам по себе не может выполнять сложных биологических функций и должен взаимодействовать с другими белками, т.е. необходимо иметь возможность изучать протеом биологической системы в целом.
Изменение конформации Рис. 1. Процесс создания белков в эукариотах. Синтез белка начинается с транскрипции последовательности ДНК в мРНК, на что может влиять альтернативный сплайсинг и другие факторы. Затем мРНК транслируется в аминокислотную последовательность белка, который затем может подвергаться, например, химическим модификациям (посттрансляционным модификациям).
Лишь открытие двух методик "мягкой" ионизации в конце 1980-х годов: Матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации (МАЛДИ, MALDI) (7; 14) и Электрораспыления (электроспрея, ESI) (3; 4), способов стыковки масс-спектрометра и жидкостного хроматографа (6), а также демонстрация возможности применения электроспрея для ионизации тяжелых макромолекул (белки, сахара и т.п.) (5) стало поворотной точкой и послужило толчком к применению масс-спектрометрии в протеомных исследованиях.
Подходы к идентификации белков методами масс-спектрометрии, существующие на данный момент
Все они, за исключением первого и последнего, имеют в своей основе использование тандемной масс-спектрометрии (МС/МС), что является недостатком в определенных типах исследований, например, когда требуется высокая скорость анализа либо когда количество исследуемого вещества очень мало. Остановимся на каждом из приведенных методов подробнее. Peptide mass fingerprint
Исторически первым методом идентификации белков при помощи масс-спектрометрии был метод "пептидных отпечатков пальцев" (peptide mass fingerprint, PMF) (15). Суть его в следующем: сравниваются измеренные массы пептидов, полученных при гидролизе белков, с рассчитанными массами всех возможных пептидов, полученных теоретическим нарезанием аминокислотных последовательностей белков из белковых баз данных. Затем дается оценка качества найденных совпадений. Метод PMF основывается на том факте, что масса одного отдельно взятого пептида совпадает с массой лишь нескольких теоретически возможных пептидов из всего протеома (16). Например, если мы возьмем массу 2000 Да, зададим mma (mma - mass measurement accuracy, точность измерения массы) lppm (ppm - part per million, миллионная доля), то во всем человеческом протеоме найдется лишь 4 немодифицированньгх триптических пептида с такой массой (пептид называется триптическим, если он получен путем гидролиза белка ферментом, называемым трипсин, т.е. аминокислотная
Подготовка проб для хромато-масс-спектрометрии
В отличие от описанных выше методик, в top-down подходе белки предварительно не гидролизуют (см. Рис. 3 для сравнения с bottom-up), но по своей сути он похож на PMF и bottom-up, за тем исключением, что гидролиз заменяется на газофазную фрагментацию белков в масс-спектрометре (32). Ионы интактных белков, получающиеся при ионизации электроспреем, вводят в масс-спектрометр (наиболее подходящими для top-down анализа являются масс-спектрометры ИЦР) и измеряют их точную массу. Затем их подвергают газофазной фрагментации и измеряют массы фрагментов. Массы фрагментов и исходных белков сравнивают с теоретическими значениями из белковых баз данных. Прямое сравнение сильно осложняется из-за того, что велика вероятность точечных аминокислотных замен в белке (замена одного аминокислотного остатка другим ведет как к изменению полной массы белка, так и к изменению масс его пептидов), а также наличием пост трансляционных модификаций, присутствие которых расширяет поисковое пространство (из-за необходимости учитывать возможность добавки различных химических групп к разным участкам белка). К настоящему времени существует лишь одна программа специально предназначенная для идентификации белков методом top-down (33). Кроме того, у данного метода имеются и другие проблемы.
Во-первых, интактные белки имеют сложный масс-спектр, состоящий из множества пиков, если в смеси присутствует несколько белков одновременно, спектр может стать невозможно интерпретировать из-за взаимного наложения сигналов от разных белков, также невозможной станет изоляция одного конкретного белка для проведения газофазной фрагментации оного. Это ограничивает применимость метода для исследования сложных смесей белков, как правило, метод применяется для какого-то одного выделенного белка. Во-вторых, шаг измерения масс фрагментов белка также сопряжен с определенными технологическими трудностями. Одной из них является правильное определение масс фрагментов, получающихся из многозарядных родительских ионов. В-третьих, top-down анализ белков массой больше 50 кДа до сих пор не является рутинным процессом и относится скорее к разряду постановки рекордов (34). В-четвертых, предпочтительной методикой фрагментации ионов является диссоциация при захвате медленных электронов (ECD), медленный процесс, требующий длительного накопления ионов и большого времени активации, а также доступный только на дорогостоящих и сложных в обслуживании масс-спектрометрах ИЦР, хотя в последние годы была продемонстрирована возможность применения ионных ловушек и диссоциации методом передачи электрона (ETD) (35). В-пятых, есть сложности (преодолимые (36)) с хроматографическим разделением таких больших молекул, как целые белки. Но, тем не менее, несмотря на вышесказанное top-down является уникальным методом, позволяющим получать информацию, обычно теряемую при использовании других подходов к идентификации белков — местоположение и тип посттрансляционных модификаций и наиболее полное покрытие сиквенса исходного белка.
Секвенирование de novo - восстановление исходной аминокислотной последовательности пептида на основе спектров фрагментации. Для однозначного восстановления последовательности требуется разрыв всех или почти всех пептидных связей, что не всегда возможно из-за особенностей фрагментации пептидов. Метод сложен сам по себе и сильнее всех зависит от качества МС/МС спектров (на Рис. 4 приведен пример участка "хорошего" масс-спектра фрагментации, по которому можно восстановить аминокислотную последовательность), зато не требует дополнительных знаний в виде белковых или геномных баз данных, благодаря чему является единственным применимым в некоторых случаях (17).
Сообщается (37; 38), что при использовании комплементарных методов фрагментации пептидов, можно методом de novo секвенирования добиться покрытия протеома сравнимого, с получаемым при использовании наиболее производительного на данный момент метода bottom-up.
Метод точных массово-временных меток — логическое продолжение методики Peptide mass fingerprint, позволяющее расширить границы ее применимости. Изначальной проблемой метода PMF является неуникальность масс пептидов, но если добавить еще одно измерение, то комбинация этих двух величин позволит сделать идентификацию однозначной. Таким дополнительным измерением является время удержания пептида в хромато графической колонке (39). Отказ от фрагментации пептидов в масс-спектрометре позволяет добиваться рекордных результатов по чувствительности, например, было продемонстрировано обнаружение пептидов при концентрации всего 250 атто молей (40), а также позволяет отказаться от предварительного фракционирования исследуемых образцов каким либо образом, оставляя лишь необходимость проведения хромато-масс-спектрометрического эксперимента (41).
Какая точность измерения масс измерения масс и времени требуется для применения подобного метода? Модельные вычисления, проведенные с полными геномными базами данных Saccharomyces cerevisiae и С. Elegans показали, что при точности измерения масс Юррт, значительная часть предсказанных триптических пептидов может служить надежными маркерами для соответствующих белков. При уровне в lppm, доля становится равной приблизительно 50% для дрожжей и 40% для С. Elegans, покрывая при этом 98% и 96.6% предсказанного протеома этих организмов (42). В статье (43) приводятся исследование уникальности идентификаций пептидов белков различных организмов (с геномами разного размера, см. таблицу 1) при различных критериях поиска. На Рис. 5 представлена уникальность триптических пептидов, как функция их массы (допуская максимум одну, неразорванную при гидролизе, связь) при различных уровнях точности измерения масс и нормализованных времен удержания (Normalized Elution Time - NET).
Хромато-масс-спектрометрический эксперимент
Подходы в количественной протеомике Изотопные метки для попарного сравнения образцов начали разрабатываться с самого начала применения тандемной хромато-масс-спектрометрии (LC-MS/MS) для задач протеомики (49). Принцип метода заключается в том, что в результате мечения пептиды в опытном и контрольном образцах дают пики в масс-спектрах, отстоящие друг от друга на несколько единиц массы. Варианты меток конструируют таким образом, чтобы они не влияли на эффективность ионизации и времена хроматографического удержания. По отношению интенсивностей пиков соответствующих пептидов делают вывод об их относительном содержании в образцах.
Разработано несколько коммерчески доступных решений для проведения сравнительного количественного анализа протеомов. Примерами могут служить технологии ICAT (Isotope-Coded Affinity Tag) и ICROS (Isotope Coded Reduction Off of Chromatographic Support), в которых мечение производится по цистеиновому остатку. Более сложным способом является технология iTRAQ (Isobaric Tagging Reagents Amino-reactive Quantification), которая позволяет проводить количественный анализ сразу 4 образцов на уровне MS/MS анализа. Изобарные (имеющие одинаковые массы) метки в iTRAQ связываются с N-концевым остатком пептидной цепи. Одним из методов модификации для количественного анализа является гуанидирование лизинового остатка пептидов.
В данной работе для сравнительного количественного анализа протеомов использовано более простое и экономичное С-концевое ферментативное мечение изотопом кислорода 180. Использование 180-атома в качестве метки известно еще с работ Спирсона (Spirson) и Риттенберга (Rittenberg) (50), которые исследовали-механизм ингибирования продуктов реакции гидролиза амидной связи химотрипсином. Они обнаружили, что инкубация карбобензоксифенилаланина с химотрипсином в Н2180 приводит к включению изотопа атома кислорода 180 в карбоксигруппу карбобензоксифенилалнина. При применении 180 /1бО изотопного мечения получаются химотриптические пептиды, меченые по С-концу независимо от их аминокислотной последовательности. Миргородская с соавторами (51) использовали в своих работах протеолитическое расщепление с участием О применительно к количественной протеомике. Благодаря ряду преимуществ, такими как несложная химия и сдвиг массы на строго определенную величину, 180/1бО изотопное мечение стало популярным методом в количественной протеомике. Однако из-за слишком малой разницы масс между изотопами (всего 2 или 4 Да, см. Рис. 16-17) этот подход применяется в сочетании с масс-спектрометрами сверхвысокого разрешения (порядка 500000).
В самом начале использования этого метода протеолитическое расщепление белков проводили в присутствии Н2180 (58). Со временем была разработана оптимизированная процедура, в соответствии с которой протеолиз проводят в обычной воде, а после лиофилизации смесь пептидов растворяют в буфере в Н2180 (59). При этом в присутствии трипсина два атома О на С-конце пептида замещаются двумя атомами 180. Условия для каждого из этапов в данном процессе могут быть оптимизированы независимо друг от друга.
Как сказано выше, для данной работы нами был выбран метод мечения кислородом О в реакции обмена атомов, кислорода С-концевой карбоксильной группы пептида в присутствии трипсина. Преимуществами этого подхода являются отсутствие специфичности мечения по аминокислотам; а также одинаковое время удержания в хроматографической колонке меченого и немеченого пептидов. При использовании мечения 180 важным аспектом обработки результатов является коррекция интенсивностеи пиков при наложении изотопных распределений. Для этого мы применили модифицированную концепцию виртуальной аминокислоты "аверагин" (52).
В запутанной картине масс-спектра, изобилующего пиками, важно выделить моноизотопный пик, от интенсивности которого следует исходить при всех сравнительных количественных расчетах. Для выделения моноизотопного пика в изотопном распределении пептида на основе статистической оценки встречаемости аминокислот в белковой базе данных группой МакЛафферти была предложена виртуальная аминокислота «авераГИН» С бруТТО-формуЛОЙ C4,9384H7,7583Nij35770i,4773So,0417 И молекулярной массой 111,1237 (52). Зная молекулярную массу пептида, можно виртуально сгенерировать аминокислотную последовательность, состоящую только из таких аверагинов, и построить теоретическое изотопное распределение, ошибка вычисления массы моноизотопного иона в котором составит менее 10 миллионных долей относительно реального значения массы молекулы. Определение моноизотопного пика в эксперименталыю полученном спектре проводят путем поиска наилучшего совпадения его с теоретическим спектром — спектром пептида, состоящего только из аверагинов.
Целью данной работы была разработка метода количественного анализа белков в протеоме мочи, чувствительного и быстрого за счет применения подхода точной массово-временной метки, а также точного за счет внедрения метки 180 с последующей корректировкой интенсивностей пиков меченых пептидов.
Совмещение методов атомно-силовой микроскопии и массг спектрометрии
Данное исследование было выполнено в процессе поиска методов обнаружения и идентификации белков в растворах при концентрациях, при которых их не удается обнаружить стандартными методами хромато-масс-спектрометрии.
В последние годы в биоаналитике уделяется большое внимание методам, позволяющим прямо измерять величину слабых биохимических взаимодействий типа лиганд-рецептор, используя, в том числе, метод динамической силовой АСМ-спектроскопии. Биохимические реакции отличаются от обычных химических реакций тем, что в формировании связей между сложными биологическими молекулами участвуют как дально действующие, так и близкодействующие силы одновременно: водородные, Ван дер Ваальсовы, гидрофобные, электростатические и ряд других. Уникальная комбинация сил ближнего порядка действия между некоторыми типами молекул определяет высокую специфичность межмолекулярных связей, что делает возможным "узнавание" одних молекул другими (61-62).
Схема сравнительно-количественного анализа
Для иллюстрации принципиальной работоспособности метода, т.е. для определения ошибок метода, диапазона применимости, закономерностей систематического нестопроцентного мечения, был проведен модельный эксперимент на контрольном образце, в рамках которого были определены ошибки метода и диапазон применимости, проведена статистическая обработка для определения зависимостей систематического недомечения.
В модельном эксперименте исследовались образцы, представляющие собой смесь двух образцов, один из которых был помечен в присутствии трипсина кислородом-18. В каждом из трех экспериментов было идентифировано более 150 пептидов.
После чего для любых двух различных, случайно выбранных и идентичных по условиям экспериментов, пептидов было рассчитано отношение интенсивностей пиков, соответствующих немеченым и меченым пептидам. Результаты этого модельного эксперимента продемонстрировали высокую воспроизводимость и низкую ошибку (см. Рис. 17).
Среднее отклонение от единицы (пропорции смешивания меченого и немеченого образцов) составило порядка 4,5% (см. Рис. 17). Эта величина определяет погрешность разработанного метода, что является весьма низким значением и делает метод приемлемым для использованиям в следущих экспериментах - на клинической стадии исследования.
Также в ходе статистической обработки экспериментов было выявлено отсутствие зависимости между степенью мечения и длиной пептида (продукта белкового гидролиза ферментом трипсином), степенью мечения и кислотностью N-концевой аминокислоты (в обоих случаях не выявлено никакой связи этих двух параметров пептидов со степенью мечения; коэффициенты корреляции в обоих случаях около нуля).
Степень мечения пептидов в двух идентичных LC-MS-экспериментах (на каждой оси - отношение немеченого к меченому после корректировки; точка — один и тот же пептид в обоих экспериментах), два графика представляют результаты одного и то же эксперимента в разных масштабах Глава 4. Подход к совмещению методов атомно-силовой микроскопии и масс-спектрометрии
Задачей данной работы являлось снижение порога обнаружения белковых молекул (белков, белковых комплексов), иммобилизованных на поверхности подложки сканирующего зондового микроскопа, при помощи «, масс-спектрометра до 1011 шт/см . Для этого требовалось обеспечить !) высокую эффективность гидролиза при достаточно низкой концентрации белка, обусловленной плотностью его усадки на поверхности, которая определяется возможностью их визуализации- (регистрации) с помощью сканирующего зондового микроскопа.
Достигаемый результат состоит в повышении эффективности десорбирования белковых молекул, ковалентно связанных с подложкой и их последующего гидролиза, что приводит к снижению порога обнаружения методами масс-спектрометрического анализа. Это достигается путем , предварительного ультразвукового воздействия, в ходе которого белки I отсоединяются от поверхности и переходят в жидкую фазу, что повышает { эффективность последующего гидролиза. Это отличает предлагаемый [ способ от от других, где ультразвуковое воздействие используется для і, повышения скорости гидролиза.
Для решения поставленной задачи был предложен способ, заключающийся в том, что белки подвергают воздействию сайт-специфичного фермента в буферном растворе с величиной рН и при температуре, которые обеспечивают активность фермента, а длительность воздействия выбирают таким образом, чтобы обеспечить гидролиз основной доли белков, но избежать неспецифичного гидролиза. Перед воздействием фермента подложку сканирующего зондового микроскопа с иммобилизованным на ней белком извлекают из транспортировочного буферного раствора, помещают в 5% раствор f уксусной кислоты и подвергают воздействию ультразвука высокой частоты s с мощностью не менее 1 Вт/см2 (см. Рис. 18-19), что обеспечивает разрыв І ( связей белок—поверхность. После чего раствор, содержащий десорбированные белки, замораживают и подвергают лиофилизации.
Контроль продуктов самогидролиза энзима выполняют путем сравнения масс-спектров продуктов реакции исследуемого вещества, полученных при различной длительности выдерживания, и масс-спектра тестовой пробы, содержащей исключительно используемый энзим. Для целей контроля энзима с его помощью также проводят гидролиз известного белка при тех же условиях, что и гидролиз исследуемого вещества. Затем оба раствора продуктов гидролиза переносят в хроматограф, соединенный с масс-спектрометром, или на пластину МАЛДИ-спектрометра, предварительно добавив матрицу в раствор.
Для подтверждения принципиальной работоспособности подхода было проделано два модельных эксперимента, схемы которых изложены ниже.
Модельный эксперимент №1
Первоначально сливают транспортировочный буферный раствор из пробирки, в которой находился образец размером 10x20x0.5 мм (подложка сканирующего зондового микроскопа). Затем заливают образец 2% уксусной кислотой так, чтобы образец был полностью погружен в раствор. Далее на 10 минут помещают пробирку с образцом в термостатирующую ультразвуковую ванну мощностью 5 Вт/см2 при температуре 37 С. После этого вынимают подложку и замораживают раствор, содержащий десорбированные белки, при -70 С. Затем раствор подвергают лиофилизации в течение 4ч, после чего размораживают до комнатной температуры. Добавляют в пробирку 400 мкл буферного раствора NH4HCO3 с концентрацией 3,95 мкг/мкл и 2 мкл трипсина с концентрацией 0.2 мкг/мкл. Далее пробирку помещают в термостат (с постоянным перемешиванием) при температуре 37 С на 12 часов. Затем добавляют МАЛДИ- матрицу и наносят на мишень для получения масс- спектра. Модельный эксперимент №2
Первоначально сливают транспортировочный буферный раствор из пробирки, в которой находился образец размером 10x20x0.5 мм (подложка сканирующего зондового микроскопа). Затем заливают образец 2% уксусной кислотой так, чтобы образец был полностью погружен в раствор. Далее на 10 минут помещают пробирку с образцом в термостатирующую ультразвуковую ванну мощностью 5 Вт/см" при температуре 37 С. После этого вынимают подложку и замораживают раствор, содержащий десорбированные белки, при -70 С. Затем раствор подвергают лиофилизации в течение 4ч, после чего размораживают до комнатной температуры. Добавляют в пробирку 400 мкл буферного раствора NH4HC03 с концентрацией 3,95 мкг/мкл и 1/30 часть (по отношению к количеству белка) кристаллического пепсина. Далее пробирку помещают в термостат (с постоянным перемешиванием) при температуре 25С на 17 часов. После чего пробу анализируют при помощи хромато-масс-спектрометра.
Использование способа обеспечивает снижение порога обнаружения белковых молекул (белков, белковых комплексов), иммобилизованных на поверхности подложки сканирующего зондового микроскопа при помощи масс-спектрометра до концентрации 10пшт/см2.
В результате экспериментов была продемонстрирована возможность идентификации белка BSA (бычьего сывороточного альбумина) при концентрациях —10" "М, что позволяет сделать вывод о возможности снижения порога детектирования и идентификации белков при применении методов АСМ в сочетании с масс-спектрометрией.
