Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1 Введение 14
1.2 Структуры основных парамагнитных интермедиатов пероксидазы хрена 16
1.3 Окисление изобутиральдегида пероксидазой хрена в условиях инициирования перекисью водорода/надкислотами 18
1.4 Окисление НАДН, катализируемое пероксидазой хрена в отсутствии перекиси водорода 20
1.5 Процесс окисления НАДН пероксидазой хрена в колебательной пероксидазно-оксидазной реакции 23
1.6 Свободные радикалы в биологических системах. Применение методов спиновой химии для исследования ферментативных процессов 27
1.7 Исследование влияния магнитного поля на процесс окисления 2-метил-1-(триметилсилилокси)проп-1-ена пероксидазой хрена 29
1.8 Исследование влияния магнитного поля на процесс окисления НАДН пероксидазой хрена в колебательной пероксидазно-оксидазной реакции..35
1.9 Теория магнитных и спиновых эффектов в ферментативных многоспиновых системах 40
Глава 2. Экспериментальная часть 51
2.1 Методы исследования 51
2.1.1 Установка остановленной струи для исследования кинетики быстрых ферментативных процессов 51
2.1.2 Установка для регистрации эффектов химической поляризации ядер с временным разрешением 53
2.1.3 рН-и спектрофотометрия 56
2.1.4 Спектрофлуориметрия 56
2.2 Методика приготовления образцов 57
2.2.1 Магнитный эффект в реакции окисления НАДН, катализируемой пероксидазой хрена 57
2.2.2 Магнитный эффект в реакции окисления нифедипина, катализируемой пероксидазой хрена 57
2.2.3 Исследование фотоокисления НАДН, катализируемого пероксидазой хрена, методом ХПЯ 58
2.2.4 Исследование кинетики окисления НАДН в различных средах 59
2.2.5 Спектрофлуориметрическое исследование образования перекиси водорода при окислении НАДН в различных средах 59
2.2.6 Зависимость скорости окисления НАДН, катализируемого пероксидазой хрена, от концентрации субстрата 60
2.2.7 Исследование акта одноэлектронного переноса и образования ферропероксидазы в реакции между НАДН и пероксидазой хрена в бескислородной среде 60
Глава 3. Исследование элементарных стадий каталитического цикла пероксидазы хрена кинетическими методами 62
3.1 Введение 62
3.2 Автоокисление НАДН при различных рН и флуориметрическое определение образующейся перекиси водорода 64
3.3 Зависимость скорости окисления НАДН, катализируемого пероксидазой хрена, от концентрации субстрата и оценка константы Михаэлиса 68
3.4 Исследование стадии одноэлектронного переноса между пероксидазой хрена и НАДН в бескислородной среде 73
3.5 Анализ кинетической кривой окисления НАДН, катализируемого пероксидазой хрена 78
3.6 Заключение 83
Глава 4. Методы спиновой химии как инструмент исследования элементарных стадий каталитического цикла пероксидазы хрена 84
4.1 Введение 84
4.2 Исследование фотоокисления НАДН, катализируемого пероксидазой хрена, методом химической поляризации ядер 85
4.2.1 Эффекты ХПЯ 'Н, зарегистрированные в процессе фотоокисления НАДН, катализируемого пероксидазой хрена 85
4.2.2 Теоретическое описание наблюдаемого эффекта ХПЯ 90
4.3 Магнитные эффекты в процессе окисления НАДН пероксидазой хрена 95
4.3.1 Ферментативное окисление НАДН, катализируемое пероксидазой хрена 95
4.3.2 Теоретические расчеты наблюдаемого магнитного эффекта в процессе ферментативного окисления НАДН пероксидазой хрена 101
4.4 Магнитные эффекты в процессе ферментативного окисления синтетического аналога НАДН, нифедипина 109
4.5 Заключение 117
Выводы 120
Список литературы 122
- Структуры основных парамагнитных интермедиатов пероксидазы хрена
- Установка остановленной струи для исследования кинетики быстрых ферментативных процессов
- Автоокисление НАДН при различных рН и флуориметрическое определение образующейся перекиси водорода
- Исследование фотоокисления НАДН, катализируемого пероксидазой хрена, методом химической поляризации ядер
Введение к работе
На современном этапе развития человечества и научной мысли трудно найти такую область науки, которая существовала бы обособленно. Исследования в различных областях науки привели к необходимости решения таких сложных проблем и задач, поставили перед наукой такие емкие вопросы, которые не могут быть объяснены в рамках простых существующих теорий из одной только области знания. Для понимания и решения многих из них необходимы разносторонние, объединенные в единую теорию, знания из различных областей фундаментальных наук: биологии, химии, математики и физики. Именно поэтому в последнее время важнейшие научные открытия сделаны благодаря взаимодополняющему применению законов и методов исследования всей совокупности естественных наук.
В настоящее время исследование химических и биологических процессов в различных условиях и средах невозможно без применения современных физических методов, в частности, радиоспектроскопии: ядерного магнитного резонанса, электронного парамагнитного резонанса, а также многих других. Их использование позволяет вывести ряд физических закономерностей протекания химической реакции, установить особенности электронного строения, структуру и скорость образования короткоживущих интермедиатов, а также исследовать особенности протекания всего процесса: от реагентов через промежуточные частицы и до продуктов.
Одной из наук, позволяющих с помощью физических методов исследовать элементарные акты химических реакций, является спиновая химия. Как раздел науки она сформировалась тогда, когда было установлено, что в элементарных химических актах может изменяться коррелированное состояние спинов и, что особенно важно, были найдены пути
целенаправленного влияния на спиновую динамику в ходе элементарных химических процессов, открыты возможности спинового, магнитного контроля химических реакций. Решающую роль сыграли открытие явления химической поляризации электронных и ядерных спинов в 1967 г. [1], открытие влияния внешнего магнитного поля на радикальные реакции в 1972 г. [2].
С помощью всего разнообразия методов спиновой химии, основанных на таких явлениях как химическая поляризация электронов и ядер (ХПЭ и ХПЯ), магнитный (МЭ) и магнитный изотопный эффекты (МИЭ), подробному описанию которых посвящен ряд обзоров и монографий [3, 4], становится возможным исчерпывающее исследование радикальных реакций с участием парамагнитных партнеров.
В последнее десятилетие, после завершения теоретического описания магнитных эффектов в модельных системах, все больший интерес стало представлять практическое применение знаний, полученных при изучении сложных химических и биохимических процессов методами спиновой химии. Такое направление исследований представляется весьма перспективным, поскольку установление строения и свойств короткоживущих интермедиатов химических реакций является одной из ключевых задач современной химии. Методы спиновой химии позволяют изучать парамагнитные интермедиаты, времена жизни которых лежат в диапазоне от нано- до микросекунд: ион-радикалы и нейтральные свободные радикалы, бирадикалы, карбены и их аналоги, а также молекулы в триплетном возбужденном состоянии.
На сегодняшний день существуют впечатляющие примеры успешного применения методов ХПЯ и МЭ для установления механизмов процессов, в которых участие ион-радикалов, радикалов и бирадикалов ранее только постулировалось. Особый интерес представляют современные исследования
с применением методик спиновой химии в биологии [5], в том числе для изучения колебательных ферментативных реакций [6] и структурных особенностей обратимого фолдинга белков [7]. Поскольку предполагается, что многие ферментативные системы участвуют в регулировании образования и гибели свободнорадикальных частиц, для установления точных механизмов данных реакций наиболее информативными могут оказаться методы спиновой химии. Исследуя влияние магнитного поля на процессы взаимопревращений активных парамагнитных интермедиатов в каталитических циклах таких ферментов, как пероксидаза хрена (ПХ) или цитохром Р450, можно установить механизм отдельных стадий каталитических циклов, а, применяя теоретическое описание к ферментативным многоспиновым системам - дать детальное описание этого механизма, который включает в себя образование парамагнитных пар в определенном спиновом состоянии, оценить степень связывания и расстояния в фермент-субстратном комплексе. Учет и величина обменного взаимодействия, которое закладывается в модельные теоретические расчеты, может указывать на степень связывания в парамагнитной паре. Совместное применение методов спиновой химии и расчетных методов квантовой химии позволяет получать важную информацию о механизмах реакций, катализируемых ферментами.
Знание детальных механизмов ферментативного катализа позволяет получить представление о факторах, определяющих эффективность и высокую степень специфичности и селективности реакций ферментов [8]. Спиновые состояния парамагнитных интермедиатов ферментативного каталитического цикла должны обеспечивать такую корреляцию электронных спинов, которая никоим образом (например, вследствие спинового запрета) не нарушила бы закономерной последовательности взаимопревращений в каталитическом цикле. Механизм, обеспечивающий
необходимую корреляцию электронных спинов, изучен слабо. В этой связи, методы спиновой химии представляют огромную ценность, поскольку именно их применение позволяет вскрыть роль спиновых состояний и факторы, определяющие селективность ферментативных процессов.
До сегодняшнего дня справедливость этого утверждения рассматривалась лишь в единственном исследовании, где методы спиновой химии применялись для изучения механизмов взаимопревращений парамагнитных интермедиатов пероксидазы хрена [9]. В этой работе было продемонстрировано, что в результате катализируемого пероксидазои хрена окисления енола изобутиральдегида, инициируемого перекисью водорода, образуется радикальная пара в триплетном состоянии. Синглет-триплетная конверсия, индуцированная локальными и внешними магнитными полями, приводит к двум различным спиновым состояниям, одно из которых является предшественником следующей стадии каталитического цикла, а второе возвращает его к предыдущей стадии.
Таким образом, в работе были поставлены следующие задачи:
1. Кинетическими методами и методами спиновой химии установить
элементарные стадии взаимодействия пероксидазы хрена с субстратами:
нативным - никотинамидадениндинуклеотидом (НАДН), и специфичным,
синтетическим аналогом НАДН - 1,4-дигидро-2,3-диметил-3,5-
дикарбометокси-4-нитрофенилпиридином, нифедипином (НФ).
2. Разработать кинетическую модель, описывающую
последовательность взаимопревращений интермедиатов каталитического
цикла пероксидазы хрена.
3. В рамках теории радикальных пар дать описание магнитных и
спиновых эффектов для многоспиновых ферментативных систем.
Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы.
В первой главе представлен обзор литературы, посвященный современным представлениям о реакциях, катализируемых пероксидазой хрена, а также методам спиновой химии как инструменту для исследования ферментативных процессов. Описаны процессы окисления енола изобутиральдегида и НАДН, катализируемые ПХ, окисление НАДН в колебательной пероксидазно-оксидазной реакции. Рассмотрены методы исследования элементарных процессов, приводящих к появлению свободных радикалов и особенности методов спиновой химии, применяемых для исследования сложных ферментативных систем в колебательном и стационарном режимах. Последний раздел литературного обзора содержит описание теории магнитных и спиновых эффектов, применяемой для квантово-механических расчетов вероятности рекомбинации парамагнитных пар в многоспиновых системах.
Во второй главе описаны экспериментальные установки, в частности:
быстросканирующий спектрофотометр остановленной струи,
модифицированный для проведения реакций смешения в магнитных полях различной напряженности, а также установка для исследования фотоиндуцированной химической поляризации ядер в ферментативных системах на базе серийного спектрометра ЯМР. Также приведена подробная методика приготовления образцов.
В третьей главе обсуждаются результаты кинетических исследований, а именно изучение скорости автоокисления НАДН в средах с различным значением рН и флуориметрическое определение перекиси водорода, накапливающейся при таком автоокислении. Также приведена оценка константы Михаэлиса в реакции ферментативного окисления НАДН, катализируемого пероксидазой хрена, и подобраны оптимальные концентрационные условия для проявления всей последовательности стадий процесса. Изучена стадия одноэлектронного переноса между ПХ и НАДН в
бескислородной среде. Кроме того, проведено математическое моделирование кинетической кривой окисления НАДН, катализируемого ПХ, в предположении определенной последовательности стадий взаимопревращений активных парамагнитных интермедиатов пероксидазы. На основании полученных результатов впервые обосновано предположение о том, что первой стадией окисления НАДН является акт одноэлектронного переноса между субстратом и нативным ферментом с образованием восстановленной формы ПХ, так называемой, ферропероксидазы.
Четвертая глава посвящена применению методов спиновой химии (МЭ и ХПЯ) для исследования реакций окисления НАДН и нифедипина, катализируемых ПХ в аэробных условиях в отсутствии перекиси водорода. Для обоих субстратов экспериментально получен магнитный эффект (МЭ), а для НАДН также зарегистрированы эффекты ХПЯ в условиях фотоиндуцированного окисления. В рамках теории радикальных пар, впервые применяемой для описания многоспиновых ферментативных систем, показано, что МЭ формируется на стадии одноэлектронного переноса между субстратом и ферментом с образованием пары в квартетном состоянии, которое не является реакционноспособным, в отличие от дублетного, рекомбинирующего состояния. Наличие и теоретическое обоснование эффекта ХПЯ подтверждает этот факт.
Научная новизна. Впервые проведено исследование детального механизма первой стадии каталитического цикла пероксидазы хрена. Показано, что при аэробном окислении субстратов без перекиси водорода, начальной стадией цикла является акт одноэлектронного переноса в фермент-субстратном комплексе с образованием ферропероксидазы. Впервые зарегистрированы эффекты ХПЯ в ферментативном процессе. Впервые использовались расчетные методы квантовой химии для описания многоспиновых ферментативных систем. С помощью такого подхода удалось
доказать формирование прочного фермент-субстратного комплекса, определить, что в акте одноэлектронного переноса дигидропиридиновый фрагмент НАДН в фермент-субстратном комплексе располагается близко к плоскости гема. Продемонстрировано влияние спинового состояния исходной парамагнитной пары на каталитический цикл пероксидазы хрена. Также получены доказательства одноэлектронного многостадийного окисления НАДН в биологических системах: НАДН —» НАДН*+ —* НАД' —> НАД*. При исследовании системы НАДН - ПХ методом ХПЯ показано, что неконкурентное ингибирование пероксидазы изменяет ее акцепторные свойства, но существенно не влияет на расстояния в фермент-субстратном комплексе.
Практическая ценность. Проведенное исследование вскрывает механизм действия пероксидазы хрена, как катализатора, в аэробных условиях в отсутствии инициатора окисления, перекиси водорода, и меняет представление о проявлениях стадии одноэлектронного переноса в реакциях гем-содержащих ферментов, а также имеет огромное значение для понимания селективного действия ферментов и роли спиновых состояний парамагнитных интермедиатов в обеспечении селективности. Тот факт, что парамагнитные интермедиаты могут находиться в двух состояниях, одно из которых является реакционноспособным и приводит к следующей стадии каталитического цикла, а второе возвращает реакцию к исходным реагентам, создает предпосылки для использования этих знаний для разработки новых биотехнологических процессов с использованием моделей активных центров ферментов.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на следующих международных конференциях и симпозиумах: 8 International Symposium on Spin and Magnetic Field Effects in Chemistry and Related Phenomena, Chapel Hill, NC, USA, September, 2003; Международная научная
студенческая конференция «Студент и научно-технический прогресс», Новосибирск, Россия, 2004; Biological Research Trust Workshop, The Royal Society, London, United Kingdom, January 15, 2004; 2 International Conference on Natural Products and Physiologically Active Substances, Novosibirsk, Russia, 2004; XVIII Симпозиум «Современная химическая физика», Туапсе, Россия, 22 сентября - 3 октября, 2006.
Публикации. Основное содержание диссертации изложено в 3 статьях, 1 обзоре и 3 тезисах международных научных конференций и симпозиумов.
Afanasyeva M.S., Taraban М.В., Purtov P.A., Leshina T.V., Grissom СВ., Magnetic spin effects in enzymatic reactions: radical oxidation of NADH by horseradish peroxidase II J. Am. Chem. Soc. - 2006. - V. 128, No. 26. - P. 8651-8658.
Afanasyeva M.S., Taraban M.B., Polyakov N.E., Purtov P.A., Leshina T.V., Grissom СВ., Elementary steps of enzymatic oxidation of nifedipine catalyzed by horseradish peroxidase II J. Phys. Chem. B. - 2006. - V. 110, No. 42. - P. 21232-21237.
Афанасьева M.C., Пуртов П.А., Тарабан М.Б., Лешина Т.В., Гриссом Ч.Б., Исследование фотоокисления NADH, катализируемого пероксидазой хрена, методом химической поляризации ядер // Изв. РАН, Сер. хим. - 2006. - № 7. -С. 1090-1094.
Афанасьева М.С., Пуртов П.А., Тарабан М.Б., Лешина Т.В., Спиновая химия ферментативных процессов // Усп. хим. - 2007. - V. 76, No. 6. - С. 651-668.
Афанасьева М.С., Применение методов спиновой химии для изучения цикла окисления NADH, катализируемого пероксидазой хрена. Тезисы докладов XLII Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс», секция «Химия», Новосибирск, Россия. - 2004. - С. 132.
Afanasyeva M.S., Taraban M.B., Purtov P.A., Leshina T.V., Grissom C.B., New reactive intermediates in enzymatic oxidations studied by means of spin chemistry methods. Book of Abstracts of 2nd International Conference on Natural Products and Physiologically Active Substances. Novosibirsk, Russia. September 12-17, 2004. - P.33.
Афанасьева M.C., Тарабан М.Б., Пуртов П.А., Лешина Т.В., Гриссом Ч.Б., Магнитные эффекты в процессах ферментативного окисления пероксидазой хрена. Тезисы докладов XVIII Симпозиума «Современная химическая физика», Туапсе, Россия. 22 сентября - 3 октября 2006. - С. 85.
Личный вклад автора в рамках задач исследований, сформулированных совместно с научным руководителем, заключался в планировании и постановке экспериментальных работ, получении и интерпретации результатов, представленных в диссертации.
Структуры основных парамагнитных интермедиатов пероксидазы хрена
Пероксидаза хрена представляет собой белок, состоящий из гемовой группы железа, трехсот восьми аминокислотных остатков и двух ионов Са2+. Молекулярный вес в зависимости от присутствия Сахаров в молекуле лежит в диапазоне от 40000 до 44000 [23]. Пероксидаза хрена существует в двух формах: активной и неактивной. Активная форма представлена нативной пероксидазой и пятью короткоживущими интермедиатами, а неактивная -интермедиатом Р-670, который инертен в реакциях с субстратами нативной пероксидазы [24].
В исходной активной форме пероксидазы железо находится в степени окисления +3. В литературе эта форма известна как феррипероксидаза [24]. В реакции окисления гема в присутствии перекиси водорода при удалении двух электронов из Рег3+ образуется свободнорадикальная форма, Рег5+, так называемый компаунд І, в активном центре которого находится я-катион-радикал оксо-формы гема (Felv=0+ ). Одноэлектронное восстановление компаунда I приводит к компаунду II (FeIV=0) (формальная степень окисления железа +4). Другим важным интермедиатом пероксидазы является компаунд III, в котором молекула кислорода связана с железом гема фермента (степень окисления +6). Еще один интермедиат ПХ, ферропероксидаза (Per ), образуется при переносе электрона от субстрата к исходной пероксидазе [25].
На сегодняшний день наиболее полно изучен каталитический цикл пероксидазы хрена, протекающий как в среде с достаточным количеством перекиси водорода, которая является инициатором образования наиболее реакционноспособного интермедиата ПХ, компаунда I (при окислении изобутиральдегида) [28], так и в отсутствии Н202 при окислении нативного субстрата пероксидазы, восстановленного никотинамидадениндинуклеотида, НАДН [24,26]. 1.3 Окисление изобутиральдегида пероксидазой хрена в условиях инициирования перекисью водорода/надкислотами
Подробный анализ реакции ПХ с изобутиральдегидом в присутствии кислорода [28] проводился в рамках исследования промежуточных электронновозбужденных состояний карбонильных соединений, образующихся в ходе этого процесса. Рассматривалось также влияние соотношения концентраций изобутиральдегида и перекиси водорода на скорость реакции окисления субстрата. Было показано, что при низкой концентрации изобутиральдегида, а, следовательно, и низкой концентрации инициатора каталитического цикла - надкислоты, которая образуется в результате автоокисления альдегида растворенным кислородом, добавление перекиси существенно влияет на скорость реакции. В то время как при высокой концентрации альдегида добавление перекиси не оказывает существенного влияния на скорость процесса. Таким образом, при высокой концентрации изобутиральдегида инициирование каталитического цикла происходит за счет образующейся надкислоты, которая играет роль перекиси, превращая ПХ в компаунд I. При низкой же концентрации субстрата цикл инициируется только реакцией нативной пероксидазы с перекисью водорода. Классическая схема реакции окисления субстрата ПХ в присутствии перекиси водорода включает последовательное взаимопревращение компаунда I, компаунда II и исходной пероксидазы (рисунок 1.2). Per компаунд I
Исходя из концентрации изобутиральдегида, при которой происходит реакция образования компаунда I, можно оценить концентрацию надкислоты, необходимой для инициирования каталитического цикла, которая составляет 49 мкМ. При такой концентрации надкислота является эффективным окислителем для пероксидазы (/:-10 М" с") [30]. Полученный результат является однозначным доказательством образования компаунда I на первой стадии каталитического цикла в рассматриваемой реакции (рисунок 1.3). Затем, в соответствии с предложенной схемой компаунд I реагирует с енольной формой изобутиральдегида, в результате чего образуется компаунд II и а-радикал изобутиральдегида. Реакция компаунда II и енольной формы изобутиральдегида приводит к регенерации нативной пероксидазы и формированию еще одного сс-радикала изобутиральдегида. Таким образом, окисление нативной пероксидазы надкислотой инициирует интерконверсию пероксидазы, компаунда I и компаунда И. Кроме того, образуется еще одна парамагнитная частица - «-радикал изобутиральдегида.
Первые попытки подробного кинетического анализа образования парамагнитных интермедиатов пероксидазы хрена при окислении её природного субстрата, НАДН, в отсутствии инициирующих частиц или перекиси водорода относятся к 1965 году [31]. Было высказано предположение, что инициирующий стадией в данном случае является медленная реакция автоокисления НАДН, в результате которой образуются следовые количества перекиси водорода (1.1), реакция которых с нативной пероксидазой, в свою очередь, приводит к образованию компаунда I (рисунок 1.2). НАДН + 02 + Н -» НАД+ + Н202 (1.1)
Для подтверждения этого предположения исследовались зависимости скорости взаимопревращения активных парамагнитных интермедиатов ПХ от концентрации НАДН [26]. При изменении концентрации НАДН в диапазоне 150-500 мкМ при постоянной концентрации фермента.
Полученная иррегулярная зависимость объяснялась разной скоростью накопления перекиси водорода в процессе автоокисления НАДН при его различных концентрациях. Так, по мнению авторов, при малых концентрациях НАДН практически отсутствует автоокисление НАДН, следовательно, это будет приводить к медленному накоплению перекиси водорода. При увеличении же концентрации субстрата, увеличивается и скорость автоокисления, и количество образующейся перекиси, что приводит к возрастанию скорости инициирующей стадии, образования компаунда I. Последующими стадиями являются реакция компаунда I и молекулы НАДН с образованием компаунда II и реакция полученного компаунда II со второй молекулой НАДН, в результате чего происходит регенерация нативной пероксидазы и образование двух радикалов НАД". Образовавшиеся радикалы в аэробных условиях реагируют с молекулой кислорода, приводя к образованию конечного продукта, катиона НАД+, и супероксидного анион-радикала (02") (1.2) [26,31].
Установка остановленной струи для исследования кинетики быстрых ферментативных процессов
Кинетика ферментативных реакций в предстационарном режиме их протекания изучается в основном «струевыми» методами, которые позволяют смешать два раствора за доли миллисекунды. Принципиальная схема установки остановленной струи представлена на рисунке 2.1. Спектрофотометр остановленной струи является системой для быстрого смешивания двух растворов и измерения изменения их суммарного поглощения в зависимости от времени. При максимальной частоте регистрации 1000 скан/с - максимальная продолжительность эксперимента составляет 10-14 с. Спектральный диапазон установки - от 300 до 600 нм. Установка оснащена термостатом, позволяющим проводить эксперименты при постоянной температуре (от 4 до 70 С), что имеет принципиальное значение при исследовании ферментативных процессов, скорость которых зависит от температуры окружающей среды. Для исследования магнитных эффектов установка была модифицирована: кювета смешения реагентов была помещена между полюсами электромагнита с разомкнутым ярмом, который позволяет варьировать приложенное магнитное поле в диапазоне от 0 (земное поле, равное 0.5 Гс достигается за счет компенсации остаточной намагниченности сердечника магнита) до 4000 Гс.
Описанная выше модифицированная установка остановленной струи (рисунок 2.1) использовалась для проведения экспериментов по изучению влияния магнитного поля на ферментативные реакции окисления различных субстратов, например, НАДН (частота регистрации - 62 скан/с) и нифедипин (1 скан/с), катализируемые пероксидазой хрена, исследование кинетики окисления НАДН пероксидазой при различных концентрациях субстрата (62 скан/с), а также исследования реакции между ПХ и НАДН (62 скан/с) в бескислородной среде.
Метод химической поляризации ядер (ХПЯ) с временным разрешением позволяет получать информацию о кинетике формирования ядерной поляризации в диамагнитных продуктах радикальных реакций в наносекундом временном диапазоне. Ядерная поляризация, создаваемая в ходе химических реакций, протекающих в диапазоне 10-9-10"3 с, затем переходит в диамагнитные продукты реакции и сохраняется в них в течение времен ядерной спин-решеточной релаксации (от единиц до десятков секунд). При этом появляется возможность исследовать формирование поляризации в микросекундном диапазоне на продуктах фотоиндуцированного процесса.
Излучение лазера направляется в датчик ЯМР спектрометра через оптическую систему, которая состоит из поворотной призмы, двух собирающих линз и световода, подводящего свет к исследуемому образцу. Все элементы системы изготовлены из оптического кварца.
Система контроля синхронизации ЯМР спектрометра с лазером обеспечивает точную привязку радиочастотного импульса регистрации к моменту запуска лазера, что позволяет проводить времяразрешенные эксперименты. Система контроля синхронизации включает магнитную антенну, фотодатчик на лавинном фототранзисторе и осциллограф С1-75 (рисунок 2.2). Фотодатчик установлен на оптическом пути света лазера. В момент импульса света в фото датчике, с фронтом 10 не наводится ток, который подается на запускающий вход осциллографа. В магнитной антенне, установленной рядом с катушкой резонансного контура датчика, в момент радиочастотного импульса регистрации наводится ток, который подается на вход осциллографа. Взаимная временная привязка импульсов света и регистрации контролируется по осциллографу и регулируется программно. Установка точной временной привязки производится изменением параметров в теле программы импульсной последовательности.
Импульсная последовательность во времяразрешенном эксперименте (рисунок 2.3) позволяет регистрировать неравновесные сигналы ЯМР исследуемого образца через различные промежутки времени после индуцирования фотохимической реакции импульсом лазера, и, таким образом, наблюдать кинетику образования поляризованного продукта. Рисунок 2.3. Времяразрешенный эксперимент: (1) преднасыщение (серия дефазирующих неселективных импульсов, с переменными задержками) обеспечивает подавление равновесного сигнала исходных соединений; (2) лазерный импульс, инициирующий фотохимическую реакцию; (3) варьируемая временная задержка; (4) регистрирующий радиочастотный импульс; (5) регистрируемый спад свободной индукции. В настоящей работе в экспериментах по ХПЯ раствор НАДН и ПХ облучался непосредственно в датчике ЯМР-спектрометра при комнатной температуре. Накопление спектров ХПЯ с разрешением во времени проводили при длине радиочастотного импульса 4 мкс без задержки между импульсом и регистрацией и с задержкой в 100 мкс. Использовалась импульсная последовательность для времяразрешенного эксперимента, приведенная на рисунке 2.3. Спектры растворов до и после реакции анализировались методом ЯМР НнаЯМР -спектрометре Bruker DPX200.
Автоокисление НАДН при различных рН и флуориметрическое определение образующейся перекиси водорода
Таким образом, возможность переноса электрона между НАДН и нативной ПХ нуждается в экспериментальной проверке. В первую очередь необходимо определить скорость окисления НАДН в средах с различным значением рН и непосредственно установить, образуется ли в этих условиях при автоокислении НАДН заметное количество перекиси водорода, например, не менее 50 мкМ, которого, согласно работе [28], достаточно для инициирования каталитического цикла при реакции с ПХ, приводящей к компаунду I.
Мониторинг, проводимый в течение часа, показал, что максимальное разложение НАДН (7%) происходит в кислом MES буфере при рН = 5.56, тогда как в фосфатном буфере и в слабокислой среде (NaOH+HCl, рН = 6.4) относительное изменение поглощения составляет 0.03 и 0.02 соответственно, что указывает на 2.5% и 1.81% разложение НАДН. Что касается щелочной среды, то окисления НАДН не происходит вовсе. Таким образом, окисление НАДН регистрируется только в кислых средах и по данным работы [31] протекает с образованием перекиси водорода (1.1), которая и инициирует первую стадию каталитического цикла ПХ. Для дальнейшей проверки гипотезы о возможности инициирования каталитического цикла ПХ малыми количествами перекисных частиц, которых по данным работы [28] должно быть примерно 50 мкМ, было проведено флуориметрическое определение перекиси водорода, которая может накапливаться в процессе окисления НАДН при различных рН.
Применяемый флуориметрический метод основан на детектировании флуоресценции 4-гидроксибензойной кислоты (ОНС6Н4СООН), которая образуется в присутствии даже незначительных количеств перекиси по следующему механизму [61]: Fe(II) + Н202 - Fe(III) + ОН" + ОН (3.1) ОН + С6Н5СООН р-ОНедСООН (3.2) ОН + Fe(II) - Fe(III) + ОН" (3.3) Для количественного определения перекиси водорода, образующейся при автоокислении НАДН, строили калибровочную кривую интенсивности флуоресценции на 413 нм при различных концентрациях перекиси водорода. Для построения калибровочной кривой (рисунок 3.2) использовали стандартные растворы перекиси водорода в диапазоне концентраций от 0.035 до 35 мкМ.
Таким образом, из полученных данных можно сделать вывод о том, что даже в кислых средах при выдерживании раствора при комнатной температуре концентрация образующейся перекиси столь мала, что только через двухчасовой промежуток времени становится возможным процесс окисления НАДН в результате превращения ИХ в компаунд I. Что касается нейтрального и щелочного значений рН, то в данных условиях концентрация образовавшейся перекиси на два порядка ниже, чем в кислых средах, что недостаточно для инициирования каталитического цикла, включающего превращение ПХ в компаунд I.
Основываясь на полученных данных о пренебрежимо малой скорости автоокисления НАДН в нейтральных и щелочных средах, не приводящего к достаточным концентрациям перекиси, а также принимая во внимание термодинамические и кинетические особенности данной реакции, разумно было предположить, что в отсутствии перекиси водорода инициирующей стадией является акт одноэлектронного переноса в фермент-субстратном комплексе [Per "НАДН] с образованием ферропероксидазы (Per ). Как отмечалось выше, возможность этого процесса обсуждалась ранее для реакции окисления фотовозбужденного НАДН, катализируемого ПХ [60].
Из литературных данных известно, что ферропероксидаза, образующаяся в акте одноэлектронного переноса, быстро {к = 5.8x104 M V1) [31] реагирует с растворенным кислородом буферного раствора (рисунок 1.5), что приводит к образованию компаунда III.
Для определения соотношения концентраций фермента и субстрата, при котором наблюдается оптимальное связывание в фермент-субстратном комплексе, был проведен анализ по методу Михаэлиса-Ментен. Реакцию окисления НАДН, катализируемую ПХ, в отсутствии перекиси водорода исследовали с помощью методики остановленной струи со спектрофотометрической регистрацией на длине волны максимального поглощения компаундов II и III (418 нм). В эксперименте при фиксированной концентрации фермента 1 мкМ регистрировались кинетические зависимости при различных концентрациях НАДН: 50 мкМ, 100 мкМ, 150 мкМ, 200 мкМ, 250 мкМ и 600 мкМ (рисунок 3.3). 0,15-, 600 мкМ 250 мкМ 200 мкМ 150 мкМ 100 мкМ 50 мкМ —і 100 40 60 Время, сек Рисунок 3.3. Зависимости скорости окисления НАДН ПХ от концентрации субстрата. Условия реакции (все концентрации после смешения): 100 мМ фосфатный буфер (КН2Р04, рН = 7.0); [Рег3+] = 1 мкМ, [НАДН] = 50 мкМ, 100 мкМ, 150 мкМ, 200 мкМ, 250 мкМ и 600 мкМ; 25С. В соответствии с высказанным выше предположением, начальным актом каталитического цикла, кинетические зависимости для которого при разных концентрациях субстрата приведены на рисунке 3.3, является перенос электрона с молекулы донора (НАДН) на акцептор - гем активного центра ПХ согласно уравнению 3.4. .2+ Рег3+ + НАДН - Per2+ + НАДН4 (3.4)
Из литературных данных известно, что в аэробных условиях ферропероксидаза (Рег2+) быстро реагирует с кислородом, растворенным в буферном растворе с образованием компаунда III, который по данным работы [26] имеет максимальное поглощение на 418 нм (ц8 = 115 мМ см") (рисунок 3.4), что приводит к быстрому росту оптического поглощения (рисунок 3.3, участок 1). Необходимо отметить, что при разных концентрациях субстрата максимальная концентрация компаунда III достигается в один и тот же момент времени, поэтому эта величина может использоваться как показатель текущей скорости образования и гибели фермент-субстратного комплекса в процессе окисления НАДН. Эффективность связывания в фермент-субстратном комплексе можно определить из кинетики Михаэлиса-Ментен, построенной в координатах: максимальная концентрация компаунда III - концентрация субстрата (рисунок 3.5).
Исследование фотоокисления НАДН, катализируемого пероксидазой хрена, методом химической поляризации ядер
Для исследования стадий одноэлектронного переноса при фотоиндуцированном окислении НАДН пероксидазой хрена и установления детального механизма данного процесса наиболее информативным является один из методов спиновой химии, ХПЯ [65]. Поскольку равновесные концентрации парамагнитных частиц в ферментативных процессах обычно незначительны, для изучения реакции между НАДН и Рег3+ приходится применять фотохимическую активацию процесса окисления, которая на основании постулата о том, что механизм взаимодействия частиц не зависит от способа их генерации, будет лишь облегчать процесс переноса электрона с донора - НАДН на акцептор - пероксидазу, не влияя на дальнейший механизм превращения этих веществ.
За время приготовления образца для эксперимента по ХПЯ при смешении НАДН и пероксидазы хрена фермент катализировал окисление НАДН до НАД . Основываясь на том, что конечный продукт метаболического пути (НАД1) может ингибировать первый фермент (Рег3+) последовательности [66], в исходную смесь, перед продуванием добавлялось различное количество НАД1" и только при 10% содержании конечного продукта реакцию смешения удалось полностью остановить. В этих условиях и проводилось исследование фотоиндуцированного переноса электрона в реакции между НАДН и ПХ методом ХПЯ.
В спектре ХПЯ присутствуют две линии: эмиссионный сигнал в области S 2.75 м.д., который относится к НАДН, и сигнал при д 4.75 м.д., принадлежащий HDO. Поляризованная линия со сдвигом 3 2.75 м.д. становится заметной после 16 накоплений и достигает максимальной интенсивности после 128 накоплений. Более длительное облучение приводит к значительному уменьшению относительной интенсивности поляризованного сигнала НАДН, что, вероятно, связано с подавлением ферментативной реакции из-за инактивации пероксидазы радикалами [24], а также, поскольку пероксидаза, как и большинство ферментов, инактивируется при температурном нагреве и действии излучения, она может подвергаться частичной денатурации под действием лазерного излучения. Структура поляризованной линии при S 2.75 м.д. в области С(4) протонов молекулы НАДН отличается от равновесного сигнала этих протонов (ср. рисунки 4.1 (1, 2)), что предположительно связано с усреднением сигналов от двух протонов при атоме С(4) в результате ускорения конформационных переходов в дигидропиридиновом фрагменте молекулы НАДН в условиях лазерного нагрева. Действительно, в модельном эксперименте было показано, что при термическом нагреве раствора НАДН в отсутствии пероксидазы хрена в температурном диапазоне 22-50 С форма и ширина равновесного сигнала протонов при атоме С(4), наблюдаемые при 50 С совпадают с характеристиками поляризованного сигнала.
Отсутствие ядерной поляризации протонов при атомах С(2), С(5) и С(6) молекулы НАДН может быть связано с низкими значениями констант СТВ в катионе-радикале НАДН+ равными (0.26 мТл, -0.62 мТл и 0.2 мТл, соответственно) по сравнению с константами СТВ на протонах при атоме С(4)(4.6мТл)[67].
Приведенные результаты и предлагаемое объяснение хорошо согласуются с данными по ХПЯ, полученными [67, 68, 69, 70, 71] при исследовании модельных фотоинициированных реакций НАДН с флавином и реакций фотоокисления синтетических аналогов НАДН — 1,4-дигидропиридинов - электронными акцепторами. Однако необходимо отметить, что наблюдаемый коэффициент усиления ХПЯ в данной работе значительно меньше, чем соответствующий коэффициент в работах [67, 68, 69, 70, 71], где поляризация наблюдалась на всех протонах исходного НАДН и/или 1,4-дигидропиридинов.
Чтобы объяснить причину такого расхождения, следует, прежде всего, проверить, принадлежит ли детектируемый поляризованный сигнал внутриклеточному продукту — исходному НАДН. С этой целью эксперименты с разрешением во времени проводились без задержки между радиочастотным импульсом и регистрацией и с задержкой равной 100 мкс. Обнаруженное в этих опытах абсолютное совпадение спектров, позволяет сделать вывод, что наблюдаемый эффект ХПЯ формируется в акте геминальной рекомбинации. Таким образом, с большой вероятностью можно утверждать, что поляризация наблюдается на внутриклеточном продукте — исходном НАДН.
Чтобы выяснить, не формируется ли поляризация в результате переноса электрона между аминокислотными остатками активного центра ПХ и НАДН, были исследованы модельные реакции между НАДН и набором активных ацил-замещенных аминокислот, входящих в активный центр ПХ: М-ацетил-Ь-РЬе, М-ацетил-L-His, N-aneTM-L-Arg; а также между N-ацетил-Ь-Туг и N-ацетил-Ь-Тф и НАДН; и с короткими олигопептидами: Glyyr, Gly-Leu-Val, Ala-Gly-Gly. Кроме того, в модельных экспериментах исследовалась возможность формирования ХПЯ при взаимодействии НАДН с поверхностью пероксидазы хрена. С этой целью исследовалась реакция между НАДН и транспортным глобулярным белком альбумином. Ни в одном из модельных экспериментов эффектов ХПЯ не наблюдалось. Таким образом, можно заключить, что при связывании ПХ с НАДН перенос электрона происходит не между субстратом и аминокислотными остатками активного центра фермента, а именно между НАДН и Fe(III) гема. На основании полученных данных можно утверждать, что поляризация формируется в первичной радикальной паре, которая образуется в акте переноса электрона с НАДН на ПХ и включает восстановленную форму пероксидазы хрена, Рег2+, и катион-радикал НАДН +, то есть в радикальной паре (Рег2+ НАДН,+).
Такой вывод совпадает с ранее полученными результатами [60], где, однако, катион-радикал НАДН,+ не рассматривался как кинетически независимый интермедиат из-за быстрой реакции депротонирования, приводящей к радикалу НАД (см. схему 3.1). Позже, факт поляризации протонов НАДН, образующегося на стадии обратного переноса электрона [67], позволил предположить, что время жизни НАДН + значительно превышает время, необходимое для спиновой эволюции (несколько наносекунд), и скорость депротонирования оказывается меньше скорости обратного переноса электрона, что позволяет наблюдать эффект ХПЯ исходного НАДН.
