Содержание к диссертации
Введение
1. Лигнинные вещества производственных и сточных вод предприятии цбп (обзор литературы) 9
1.1. Основные пути образования и трансформации лигнинных веществ в технологических средах ЦБП (на примере ОАО «Архангельский ЦБК») 10
1.2. Методы определения лигнинных веществ в жидких средах 17
1.3. Применение ферментов для контроля содержания лигнинных веществ в сточных и природных водах 22
1.3.1. Общая характеристика пероксидаз 22
1.3.2. Особенности строения пероксидаз и обобщенная схема окисления их субстратов 24
1.3.2.1. Особенности строения пероксидаз 24
1.3.2.2. Обобщенная схема окисления субстратов пероксидазы 29
1.3.3. Механизм пероксидазного окисления лигнина и родственных ему соединений 32
1.4. Выводы. Постановка цели и задач исследования 43
2. Методическая часть 45
2.1. Реактивы и Материалы 45
2.2. Оборудование 48
2.3. Методы исследований 49
2.3.1. Спектрофотометрические измерения 49
2.3.1.1. Определение характеристических длин волн модельных соединений лигнина 50
2.3.1.2. Определение зависимости начальной скорости реакции от рН среды
2.3.1.3. Определение зависимости начальной скорости реакции от концентрации пероксидазы хрена 52
2.3.1.4. Определение зависимости начальной скорости реакции от концентрации пероксида водорода 53
2.3.1.5. Определение зависимости начальной скорости реакции от концентрации модельного соединения лигнина 53
2.3.1.6. Методика исследования кинетики пероксидазного окисления модельных соединений лигнина в условиях одновременного варьирования концентраций субстратов (Н2О и PhOH) 54
2.3.1.7. Методика исследования процесса пероксидазного окисления препаратов лигнина 54
2.3.1.8. Расчет кинетических параметров реакции пероксидазного окисления модельных соединений лигнина / препаратов лигнина 56
3. Экспериментальная часть 58
3.1. Каталитическая активность пероксидазы хрена в реакциях окисления лигнинных веществ 58
3.2. Кинетика пероксидазного окисления родственных лигнину фенольных соединений гваяцильного ряда 71
3.2.1. Влияние рНраствора на кинетику процесса окисления 72
3.2.2. Влияние на кинетику ферментативного процесса концентраций
пероксидазы и ее субстратов 74
3.3. Кинетическая модель и механизм пероксидазного окисления
модельных соединений лигнина 87
3.3.1. Исследование кинетики пероксидазного окисления модельных соединений
лигнина приразньїхпостоянньтх концентрациях пероксида водорода 89
3.3.2. Исследование кинетики пероксидазного окисления модельных соединений лигнина при разных постоянных концентрациях модельных соединений лигнина 96
3.4. Изучение закономерностей пероксидазного окисления препаратов лигнина
3.4.1. Влияние природы и функционального состава препаратов лигнина на эффективность их пероксидазного окисления
3.4.2. Влияние молекулярно-массовых характеристик выделенных образцов лигнина на их окислительную способность 116
Выводы 121
Список литературы 123
- Методы определения лигнинных веществ в жидких средах
- Оборудование
- Кинетика пероксидазного окисления родственных лигнину фенольных соединений гваяцильного ряда
- Изучение закономерностей пероксидазного окисления препаратов лигнина
Введение к работе
Актуальность темы
Одними из основных компонентов технологических сред целлюлозно-бумажных предприятий (ЦБП) являются лигнинные вещества, представляющие собой группу родственных высокомолекулярных соединений ароматической природы. Они не относятся к опасным токсичным соединениям, однако, при попадании в природный водоем группа конденсированных и малотрансформируемых лигнинных веществ склонна к накоплению и образованию опасных для здоровья и жизни компонентов. Таким образом, актуальными задачами химической технологии древесины являются поиск и создание новых экологически чистых способов химической переработки лигносодержащих материалов и совершенствование системы производственного экологического контроля путем разработки и внедрения новых высокочувствительных, информативных и экспрессных методов анализа.
В соответствии с «Перечнем приоритетных направлений развития науки, технологий и техники в РФ» и «Перечнем критических технологий РФ» по направлению «Биокаталитические, биосинтетические и биосенсорные технологии», перспективным для решения указанных задач является использование ферментативных систем; создание новых высокоэффективных, стабильных и специфичных биокатализаторов и разработка на их основе ферментативных методов делигнификации и анализа технологических растворов.
Большой интерес в связи с этим вызывают ферменты класса оксидоредуктаз, а именно пероксидазы. Этот класс широко применяется для контроля примесей в объектах пищевой, микробиологической и фармацевтической промышленности, в мониторинге окружающей среды, для решения некоторых медицинских и биохимических задач. Кроме того, в литературе представлены сведения о возможности применения пероксидаз в ЦБП, а именно в процессе делигнификации древесины, так как одной из основных биологических функций этих ферментов является окисление фенольных соединений и участие в процессе биосинтеза веществ лигнинной природы.
Цель диссертационной работы – установление основных закономерностей окисления лигнинных веществ в водной среде в присутствии катализатора - пероксидазы из корней хрена.
Для достижения этой цели необходимо решить следующие задачи:
1) исследовать основные закономерности протекания процесса пероксидазного окисления модельных соединений структурного звена лигнина в водной среде;
2) определить оптимальные условия проведения процесса пероксидазного окисления модельных соединений лигнина гваяцильного ряда в водной среде;
3) изучить влияние природы, функционального состава и полимолекулярных свойств препаратов лигнина на эффективность их пероксидазного окисления;
4) разработать схему механизма и кинетическую модель процесса ферментативного окисления лигнинных веществ.
Работа выполнена в рамках гранта Министерства науки и образования Российской Федерации, Федерального агентства по науке и инновациям (Государственный контракт № 02.444.11.7036) и гранта Администрации Архангельской области по поддержке научно-исследовательской работы молодых ученых (Проект № 04-04).
Научная новизна
Установлены основные закономерности пероксидазного окисления родственных лигнину фенольных соединений гваяцильного ряда в водной среде (влияние рН раствора, концентрации катализатора, концентрации субстрата-окислителя, концентрации субстрата-восстановителя); показано, что основным реакционным центром, участвующим в редокс – превращениях структурных единиц лигнина, является фенольный гидроксил.
Экспериментально определены кинетические параметры (Kmэф, Vmэф, kэфф, kcat, kcat/ Kmэф) позволяющие расположить модельные соединения лигнина по способности к пероксидазному окислению в следующий ряд: гваякол > ванилиновый спирт > ацетованилон > феруловая кислота.
Показано, что полимолекулярные свойства и форма макромолекул лигнина являются важными факторами процесса биохимического окисления.
Теоретически обоснована и экспериментально доказана применимость модели неупорядоченного присоединения субстратов по типу Random Bi Uni для интерпретации процесса пероксидазного окисления лигнинных веществ в широком диапазоне концентраций.
Практическая ценность
Получены новые данные (кинетическое описание процесса, модель и схема механизма пероксидазного окисления соединений структурного звена лигнина), создающие необходимую теоретическую основу для разработки эффективных биокаталитических систем, применимых в сфере эколого-аналитического контроля.
Определены и обоснованы оптимальные условия пероксидазного окисления соединений фенольного ряда (гваякола, феруловой кислоты, ацетованилона, ванилинового спирта) в водной среде.
На защиту выносятся
Основные закономерности пероксидазного окисления лигнинных веществ в водной среде на основе результатов исследования влияния рН раствора, концентрации окисляемого вещества, окислителя и катализатора на кинетику процесса.
Схема механизма и кинетическая модель процесса пероксидазного окисления соединений фенольного ряда пероксидом водорода в водной среде.
Обоснование влияния электроноакцепторных свойств пара - заместителей на активность фенольного реакционного центра структурных единиц лигнина в процессах пероксидазного окисления.
Обоснование влияния полимолекулярных свойств и формы макромолекул лигнина на процесс их биохимического окисления.
Апробация работы
Основные положения диссертационной работы докладывались и получили положительную оценку на международных конференциях «Аналитика России 2007» (Краснодар, 2007 г.); «Ломоносов - 2008» (Москва, 2008 г.); «Северные территории России: проблемы и перспективы развития» (Архангельск, 2008 г.); «10th European Workshop on Lignocellulosics and Pulp «EWLP 2008» (Stockholm, Sweden, 2008); «Физикохимия лигнина» (Архангельск, 2009 г.); на международном форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2008 г.); на всероссийской конференции «ЭКОАНАЛИТИКА-2009» (Йошкар-Ола, 2009 г.); а также на ежегодных научно-технических конференциях Архангельского государственного технического университета.
Публикации По теме диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 2 статьи.
Структура и объем диссертации
Методы определения лигнинных веществ в жидких средах
Определение лигнинных веществ имеет важное практическое значение для технологического процесса (интенсификация процесса делигнификации древесины), а также для системы эколого-аналитического контроля качества сбрасываемых сточных вод. К настоящему времени разработано большое число методов качественного и количественного определения лигнинных веществ, но; ни один из них не является полностью универсальным и не отвечает всем следующим требованиям: - небольшая продолжительность анализа; - простота аппаратурного оформления; - высокая чувствительность; - широкий диапазон определяемых концентраций; - возможность автоматизации. Основными причинами этого являются многообразие видов лигнифицированных материалов, различия не только в породном составе растительных материалов, но и составе одной и той же породы в зависимости от возраста, района произрастания. Все методы определения лигнина подразделяют на прямые [27-29] и косвенные [30-32].
Для определения лигнинов в жидких средах - щелоках и сточных водах, при исследовании процессов делигнификации и оценке качества очистки сточных вод широко применяют метод электронной спектроскопии в ИК, УФ [33-38] и видимой областях спектра [39-47]. Наиболее широко для определения лигнинов применяют метод нитрозирования по Пирлу-Бенсону [46]. Однако отмечено [47, 48], что этим методом нельзя оценить истинное содержание лигнинных веществ в поверхностных водах.
Помимо представленных выше методов для определения лигнинных веществ часто используют электрохимические методы анализа, в основе которых лежат донорно-акцепторные свойства отдельных групп и фрагментов макромолекулы лигнина, обусловливающие их способность к различным окислительно-восстановительным взаимодействиям. Примером такого метода является редоксиметрия, используемая в различных отраслях промышленности для технологического и экологического контроля [49-56].
Однако, использование перечисленных выше методов в производственных условиях осложнено рядом факторов, таких как: низкая чувствительность методов, высокая погрешность определения, длительность анализа, а также затрата большого количества реагентов. Одним из возможныхпутей устранения этих недостатков является использование биохимических процессов в электрохимических методах анализа в результате создания биосенсоров. В связи с этим, в настоящее время интенсивно разрабатываются биосенсоры, направленные на решение различных задач в сфере экологического контроля.
Электрохимические биосенсоры предсталяют собой удачную альтернативу традиционным аналитическим системам благодаря высокой селективности (высокой специфичности биораспознающего элемента), простоте реагирующих устройств и быстроте получения выходного сигнала.
Биосенсоры состоят из двух компонетов: системы биохимического распознавания и преобразователя первичного сигнала (трансдъюсера). Как правило, в качестве биораспознающего реагента используют ферменты и другие специфические биологические объекты — антитела или антигены, отдельные клетки, микроорганизмы - в иммобилизованном состоянии. Одним из наиболее часто используемых ферментов, в качестве биокатализатора или в качестве метки, является пероксидаза хрена [57].
Для преобразования первичного сигнала в биосенсорах широкоиспользуются электрохимические методы детекции отклика.
Электрохимическая детекция в прямых (безмедиаторных) биосенсорах основана на прямом каталитическом переносе электронов от активного центра биораспознающего реагента к чувствительному элементу сенсора - электроду. Перенос электронов может происходить непосредственно на поверхности электрода либо на предварительно модифицированной его поверхности, обеспечивающей прямой перенос электрона (рисунок 1.5.).
Для улучшения условий обмена электронами между активным центром фермента и электродом в сенсорную систему можно вводить специальное диффузионно-подвижное вещество, которое служит переносчиком электронов. В этом случае происходит так называемый медиаторный перенос электронов (рисунок 1.6.).биосенсоры на основе пероксидазы хрена, иммобилизованной на графитовых электродах, для определения фенолов и их производных [59-63]. Суть определения состоит в том, что фенокси - радикалы, образующиеся при ферментативном окислении производных фенола в присутствии пероксида водорода, могут быть восстановлены электрохимически; ток восстановления пропорционален их концентрации в растворе, а потенциал, при котором происходит электрохимическое восстановление фенокси - радикалов, зависит от электронодонорных свойств заместителей в п-положении в молекуле производного фенола. Была достигнута высокая чувствительность определения 2-амино-4-хлорфенола (85 нА/см мкмоль/л) и 4-хлор-З-метилфенола (14 нА/см МКМОЛЬ/Л).
Также в литературе представлены сведения о биосенсорах с использованием медиаторов, основу действия которых составляют сопряженные реакции между различными ферментами. Это позволяет существенно повысить чувствительность анализа, а также упростить детектирование определяемого вещества. В биосенсорах этого вида на поверхности электродов иммобилизуют совместно два разных фермента; а конечные продукты реакции определяют электрохимическими методами. На основе сопряженных полиферментных систем разработан ряд биосенсорных устройств для определения L- аминокислот, глюкозы, лактата, оксалата и других соединений [64]. В этих биосенсорах на поверхности электродов соиммобилизованы глюкооксидаза и пероксидаза. Окисление глюкозы сопровождается образованием пероксида водорода, ферментативное восстановление которого под действием пероксидазы детектируется электрохимически. В качестве медиатора использовали гидрохинон. Принцип совместной иммобилизации глюкозооксидазы и пероксидазы реализован также в биосенсорах для определения сахара в грейпфрутовом соке и в белом вине [65], предел обнаружения глюкозы 4,37 мкмоль/дм . В качестве медиатора использовали ферроцианид калия. Преимущества использования рассмотренных методов очевидны: - за счет «точечного» воздействия биокатализаторов на основные реакционные центры макромолекулы лигнина и зависимости этого действия от изменения
Оборудование
Лигнин, являясь полифункциональным полимером с глобулярной структурой, содержит в своем составе функциональные группы, различающиеся по доступности к действию различных реагентов и следственно, по способности к окислению. Отмеченный факт затрудняет изучение механизмов окисления лигнина, поэтому для исследования этих процессов удобно использовать низкомолекулярные модельные соединения,содержащие те функциональные группы, за счет которых происходит окисление лигнина в выбранных условиях.
В данной работе в качестве объектов исследования были использованы фенольные соединения гваяцильного ряда: гваякол, феруловая кислота, ванилиновый спирт и ацетованилон, моделирующие структурные фрагменты хвойных лигнинов, содержащие различные заместители в пара-положении к фенольному гидроксилу.
Наличие в строении данных молекул двойных связей и кольцевойструктуры делает возможным эффективное применениеспектрофотометрических методов для изучения кинетики пероксидазного окисления выбранных субстратов. Это обусловлено тем, что в результате рассматриваемого превращения у субстрата и продукта реакции значительно изменяется спектр поглощения. Поэтому оказывается возможным найти такую длину волны, при которой в результате рассматриваемой ферментативной реакции поглощение изменяется наиболее значительно. Измеряя величину этого изменения, можно изучать течение конкретной ферментативной реакции на количественном уровне, измеряя начальную скорость реакции по количеству превращенного субстрата или образовавшегося продукта реакции. За кинетикой процесса окисления в большинстве экспериментов наблюдали по изменению концентрации субстрата (исключение составляет гваякол, так как в результате его пероксидазного окисления наблюдается образование интенсивно окрашенного продукта реакции (см. п. 1.3.3)).целью разработки методики кинетических исследований были записаны УФ-спектры (Specord 200 Analytik Jena) нейтральных растворов окисляемых веществ (рисунок 3.1.- 3.12.), установлены характеристические полосыпоглощения использованных фенольных соединений .в водной среде; определены молярные коэффициенты поглощения и сопоставлены с данными, приведенными в работах других авторов (таблица 3.1.).
Кинетические измерения проводили циклично в течение 300 секунд с временным интервалом в 60 секунд в режиме автоматической записи спектров. Время первого измерения оптической плотности с момента приготовления анализируемого раствора составляло 20 секунд. Полученные спектры были обработаны с помощью компьютерной програмы WinASPECT ver. 1.7.0.79 Analytik Jena AG, рассчитаны их вторые производные. Концентрация окисляемого вещества (модельного соединения лигнина) составила 1-Ю"3 моль/л, концентрация окислителя (пероксида водорода) 1-10" моль/л, катализатора (пероксидазы хрена) 2-Ю"9 моль/л. Определение характеристических длин волн проводили при постоянном значении рН в среде фосфатного буферного раствора (рН 6,0).
Пероксидазное окисление модельных соединений лигнина проводили следующим образом. В стеклянную пробирку с притертой пробкой вводили последовательно необходимое количество буферного раствора, растворов пероксидазы хрена, субстрата-восстановителя (модельного соединения лигнина) и пероксида водорода. Общий объем реакционной смеси составлял 5 мл. После добавления пероксида водорода раствор перемешивали и фиксировали время начала реакции. Далее раствор помещали в кварцевую кювету (/=1 см) и после истечения 20 секунд с момента начала реакции (для корректного последующего сопоставления полученных экспериментальных данных) начинали регистрацию спектров поглощения продуктов реакции окисления через определенное время (15 секунд).
Большинство ферментов очень чувствительны к условиям внешней среды и инактивируются в растворах с рН 4 или 9. Поэтому кинетическиеисследования проводили в диапазоне рН от 4,5 до 8,0 единиц рН. Для поддержания необходимого значения рН использовали ацетатный буферный раствор (рН 4,5...5,5) и фосфатный буферный раствор (рН 5,5...8,0). Изучение влияния рН на скорость окисления модельных соединений пероксидом водорода проводили по вышеописанной методике (см. 2.З.1.1.).2.3.1.4. Определение зависимости начальной скорости реакции от концентрации пероксида водорода
С целью установления кинетической схемы пероксидазного окисления модельных соединений структурного звена лигнина пероксидом водорода были выполнены исследования с варьированием концентрации одного из субстратов при постоянной концентрации другого; концентрация катализатора (пероксидаза хрена) во всех экспериментах была постоянна.
Диапазон варьирования концентраций субстратов представлен в таблице 2.9.Исследование процесса каталитического окисления препаратов лигнина проводили в водной среде. Из-за ограниченной растворимости препаратов лигнина в воде, использовали предварительное их растворение в ДМСО. Затем, аликвоту раствора препарата лигнина, растворенного в ДМСО, переносили в водный раствор (рН 6,0 фосфатный буферный раствор).
Процесс окисления препаратов лигнина контролировали в течение 30 минут с временным интервалом записи спектров изменения оптической плотности - 5 минут по следующей методике.В стеклянную пробирку с притертой пробкой вводили последовательно необходимое количество буферного раствора, раствора пероксидазы хрена, раствора субстрата-восстановителя (препарата лигнина) и раствора субстрата-окислителя (пероксида водорода). Общий объем реакционной смеси составлял 5 мл. После добавления пероксида водорода раствор перемешивали и фиксировали время начала реакции. Далее раствор помещали в кварцевую кювету (/ = 1 см) и по истечении 30 секунд с момента начала реакции (для корректного последующего сопоставления полученных экспериментальных данных) начинали регистрацию спектров поглощения продуктов реакции окисления.
Концентрация лигнина в реакционной среде составляла 0,02 - 0,04 мг/мл. Все измерения проводили при оптимальном значении рН равном 6,0. Концентрация пероксида водорода составляла 0,034 мг/мл. Концентрация пероксидазы хрена составляла 2-Ю" моль/л (0,008 мг/мл). Все измерения проводились без дополнительного термостатирования.Полученные спектры поглощения были обработаны с помощью
Кинетика пероксидазного окисления родственных лигнину фенольных соединений гваяцильного ряда
Литературные данные, представленные в обзоре, свидетельствуют о перспективности использования пероксидазы хрена в качестве катализатора процессов биодеградации лигнина. Это связано с рядом ее уникальных свойств, таких как: 1) высокая каталитическая активность в довольно мягких условиях температур, давлений "и кислотности среды; 2) специфичность (избирательность) действия в отношении структуры субстрата, типа реакции и условий ее проведения. Перечисленные свойства обусловлены структурной сложностью пероксидазы и многостадийностью механизма ее действия, в том числе тем, что в пероксидазном катализе большую роль играет образование фермент-субстратного комплекса (Cpd I), обеспечивающее сближение и правильное ориентирование реагирующих частиц относительно активных центров фермента. Представленные на рисунках спектры поглощения продуктов окисления лигнинных веществ в присутствии и отсутствие катализатора - пероксидазы хрена (рис. 3.1. - 3.22.), свидетельствуют о ее высокой каталитической активности по отношению к выбранным субстратам: в присутствии катализатора значительно понижается оптическая плотность раствора при характеристических полосах поглощения, чего не наблюдается в растворе без катализатора. Отсутствие окисления субстратов собственно пероксидом водорода связано с тем, что пероксид водорода в нейтральной среде находится в неионизированной форме, а, следовательно, не способен координироваться с активными реакционными центрами рассматриваемых лигнинных веществ, которые также находятся в молекулярной форме (рКагв = 10,04; рКаФК = 9,40; рКаФК (для СООН) = 4,43; рКавс= 9,80; рКаАЦ= 7,90). Таким образом, окисление лигнинных веществ достигается за счет образования промежуточного фермент-субстратного комплекса (Е-Н202), который в дальнейшем и взаимодействует с окисляемыми субстратами. Рисунок 3.19 - Спектр поглощения продукта окисления ДЛ пероксидом водорода в отсутствие катализатора пероксидазы хрена (Сдл - 0,04 мг/мл). Рисунок 3.20 - Спектр поглощения продукта окисления ДЛ пероксидом водорода в присутствии катализатора пероксидазы хрена (Сдл 0,04 мг/мл). 330 нм 2!Ю 575 с см 0,015 п 0,01 0,005 -0,005 -0,01 -0,0 280 НМ 2nd 20 сек 2nd 1800 сек Рисунок 3.21 - Вторая производная спектра поглощения продукта окисления ДЛ пероксидом водорода в присутствии катализатора пероксидазы хрена. 0,85 0,6 500 1000 1500 время, сек Рисунок 3.22 - Изменение оптической плотности при X = 280 нм в спектре поглощения продукта окисления ДЛ пероксидом водорода в присутствии катализатора пероксидазы хрена. Из представленных на рисунках 3.1. - 3.22. данных следует, что: - в ходе пероксидазного окисления гваякола наблюдается максимальное изменение поглощения при А, 274 и 470 нм. Руководствуясь литературными данными, представленными в обзоре, для дальнейших исследований мы выбрали А, - 470 нм, которая соответствует образующемуся в ходе реакции окисления при различных концентрациях субстратов использовали графический метод линеаризации уравнения Михаэлиса - Ментен в координатах ст02 о от концентрации пероксида водорода (стот) (рисунок 3.30. - 3.33.). В этом случае наклон прямой равен 1/ v и она пересекает ось ординат в точке К J v. Анализ полученных экспериментальных данных, показал, что максимальная каталитическая активность пероксидазы в реакциях окисления модельных соединений лигнина пероксидом водорода достигается при различных соотношениях концентрации катализатора, субстрата-восстановителя и субстрата-окислителя, другими словами реакционная способность выбранных модельных соединений лигнина в изучаемых реакциях различна. Полученные значения Кт эф по субстрату окислителю (Н2О2), Кт эф по субстрату восстановителю (PhOH), а также Vm Эф свидетельствуют о том, что пероксидазное окисление выбранных субстратов протекает с разной эффективностью. Рассчитанные кинетические константы кЭфф, ксаь kcat/Km эф (таблица 3.5.), характеризующие эффективность ферментативного окисления изучаемых субстратов и активность самого катализатора в этой реакции, показывают, что наиболее «быстро окисляемым» субстратом является гваякол, а наиболее «медленно окисляемым» - феруловая кислота.
Этот факт можно объяснить с позиции структурных особенностей молекул модельных соединений лигнина, выбранных для исследования. Известно, что основным реакционным центром указанных субстратов является фенольный гидроксил, а содержащиеся в молекуле группировки, находящиеся в а - положении пропановой цепи, обусловливают различный характер распределения электронной плотности в молекуле. [136].
Так, при введении в молекулу пара - заместителей, обладающих сильно выраженными электроноакцепторными свойствами (например -СН=СН-СООН у феруловой кислоты и -СО-СНз у ацетованилона), электронная плотность в ароматическом кольце понижается, что способствует эффективной делокализации избыточного отрицательного заряда кислородного атома в сопряженной системе. Это приводит к упрочнению связи О-Н в фенольном гидроксиле, а значит, к снижению способности модельных соединений окисляться под действием пероксидазы. Если же в молекулу ввести пара -заместитель со слабовыраженными электроноакцепторными свойствами (например -СНгОН в ванилиновом спирте), то понижения реакционной способности модельных соединений не происходит [137-139].
Для подтверждения различного влияния заместителей на реакционную способность модельных соединений можно использовать значения с-констант Гаммета, пред ставленых в таблице 3.4. [140]. Обнаружено, что фенолы, имеющие меньшее значение а, легче подвергаются пероксидазному окислению. Исключение составляет феруловая кислота, что может быть связано с наличием в ее молекуле заместителя, содержащего сопряженную с ароматическим ядром двойную связь. Это приводит к отличиям в распределении электронной плотности и, следовательно, в реакционной способности. На основе вышесказанного, можно предположить, что реакционная способность модельных соединений к пероксидазному окислению убывает в ряду гваякол > ванилиновый спирт > ацетованилон > феруловая кислота.
Таким образом, проведенные исследования по изучению кинетики пероксидазного окисления модельных соединений лигнина свидетельствуют о том, что введение пара - заместителей с различными электроноакцепторными свойствами в молекулу модельного соединения в значительной степени влияет на активность реакционного центра - фенольной гидроксильной группы, а, следовательно, и на способность органического соединения к пероксидазному окислению.
Изучение закономерностей пероксидазного окисления препаратов лигнина
Лигнин представляет собой аморфное полифункциональное высокомолекулярное соединение ароматической природы, построенное из фенилпропановых единиц. Его макромолекулы, благодаря поливариантности связей и нерегулярности строения, наличия разнообразных функциональных групп (ароматических колец, гидроксильных, карбонильных и винильных, простых эфирных групп) чувствительны к довольно большому числу окислителей, действующих самостоятельно или посредством образования активных комплексов с различными катализаторами.
Нами исследован процесс каталитического окисления лигнинных веществ пероксидом водорода с использованием в качестве катализатора пероксидазы хрена.
Выбор данной каталитической системы обусловлен тем, что природными деструкторами лигнина является фенолоксидазно-пероксидазный комплекс ферментов, а также сведениями, рассмотренными в литературном обзоре по применению ферментов суперсемейства пероксидаз растительного и грибного происхождения в качестве катализаторов процесса окисления лигнина и его модельных соединений пероксидом водорода.
В связи с тем, что лигнин - это полимер, макромолекула которого построена из полизамещенных функциональных единиц бензола, фенольного, гваяцильного и сирингильного рядов, для него характерно наличие в его составе большого числа хромофорных групп (хинонных и хинонметидных структур). Такие структуры весьма неустойчивы и легко вступают в химические превращения, что существенно изменяет спектральные характеристики лигнина и делает перспективным использование спектрофотометрических методов анализа для исследования процесса окисления лигнина с применением метода производной спектроскопии (т.к.спектры поглощения лигнина состоят из большого количества сильно перекрытых пол ос) [149-151].
На этом основании, в нашей работе для исследования процесса пероксидазного окисления препаратов лигнина, использованы те же подходы, что и при изучении процесса окисления модельных соединений структурного звена лигнина.Типичный спектр лигнина представляет собой функциональную зависимость интенсивности поглощения от длины волны падающего излучения, снижающуюся от максимума около 250 нм к минимуму около 260 нм с явно выраженным плечом при 230 нм. Для этого спектра характерно наличие второго максимума, соответствующего 280 нм, при котором интенсивность снижается в сторону видимой области спектра с плечом при 300-360 нм. Однако, известно, что препараты лигнина, выделенные различными методами существенно различаются по целому ряду физико-химических характеристик, что главным образом связано с различным соотношением функциональных групп в выделенном образце.
Поэтому для исследования влияния природы и функционального состава препаратов лигнина на эффективность их пероксидазного каталитического окисления в качестве препаратов лигнина были использованы лигнины, выделенные различными методами.Для исследования влияния природы и функционального состава лигнина на эффективность его пероксидазного окисления были использованы препараты диоксанлигнина (ДЛ), сульфатного хвойного лигнина (СХЛ) и восстановленного сульфатного хвойного лигнина (ВСХЛ). Характеристика этихпрепаратов и условия проведения эксперимента приведены в п. 2.1. и пп. 2.3.1.7.
При пероксидазном окислении препарата диоксанлигнина наблюдается снижение интенсивности поглощения при X = 280 нм и увеличение интенсивности поглощения при X — 330 нм. Отмеченные спектральные изменения по всей видимости связаны с образованием наиболее вероятных продуктов окисления диоксанлигнина - хинонов.
При пероксидазном окислении препарата сульфатного хвойного лигнина наблюдалось снижение интенсивности поглощения в видимой области спектра при X = 420 нм, что связано с распадом образующегося фермент-субстратного активного комплекса (Е-Н202). Такое предположение подтверждается экспериментом, проведенным в аналогичных условиях, но в отсутствие препарата поглощения в диапазоне длин волн 480 - 520 нм, что также можно связать с образованием продуктов окисления ВСХЛ хинонной структуры поглощающих в видимой области спектра.
Расчет скорости реакции пероксидазного окисления препаратов лигнина подтверждает различную эффективность протекания этого процесса. Таблица 3.8 - Рассчитав скорость реакции пероксидазного окисления препаратов лигнина (таблица 3.8.) и сопоставив полученные значения с данными по функциональному составу исследуемых препаратов и спектров поглощения, полученных в ходе их пероксидазного окисления можно сделать вывод о том, что на скорость реакции окисления оказывает существенное влияние содержание в образцах карбоксильных групп и фенольных гидроксилов. Выделенный препарат диоксанлигнина характеризуется низким содержанием карбоксильных групп и высоким содержанием ОНфен по отношению к препарату сульфатного хвойного лигнина.
В образце СХЛ наоборот наблюдается высокое содержание карбоксильных групп и пониженное ОНфен- Это объясняется технологией сульфатной варки за счет конкурентно протекающих процессов гетеролитического расщепления и конденсации фрагментов макромолекул лигнина.
