Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Укладка белка: актуальные проблемы и анализ предшествующих исследований 7
1.1. Общие сведения 7
1.2. Современное состояние исследований 8
1.3. Парадокс Левинталя 8
1.4. Парадигма энергетического ландшафта 9
1.5. Поверхность свободной энергии и модель энергетической воронки 10
1.6. Термодинамика и кинетика укладки системы с двумя состояниями 12
1.7. Ансамбль переходных состояний 13
1.8. Сворачивание белков через образование промежуточных состояний 14
1.9. Переходное состояние и ядро укладки 15
1.10. Представление белка при разных уровнях детализации 15
1.11. Компьютерное моделирование укладки белка 16
1.11.1. Молекулярная динамика 18
1.11.2. Метод Монте-Карло 21
1.12. Белки с усложненным механизмом укладки 21
1.12.1. Полимеры, содержащие узлы 21
1.12.2. Альтернативные стабильные состояния, прионовые белки и ошибки укладки22
Глава 2. Методика исследований 25
2.1. Решеточное представление белка 25
2.2. Энергетическая модель 25
2.3. Кодирование структуры белка, инвариантное сдвигам, поворотам и отражениям . 26
2.4. Алгоритм Метрополиса 27
2.5. Дизайн белков 28
2.6. Построение поверхности свободной энергии (ПСЭ) 29
2.7. Построение поверхности вероятности укладки 30
2.8. Идентификация бассейнов и переходных состояний 30
Глава 3. Белок, содержащий узел в составе нативной структуры 32
3.1. Методика 32
3.2. Результаты 32
3.3. Поверхности свободной энергии 34
3.4. Выводы 34
Глава 4. Белок с латентным состоянием 36
4.1. Поверхность свободной энергии 38
4.2. Поверхность вероятности укладки 39
4.3. Мутационный анализ 39
4.4. Определение бассейнов 39
4.5. Матрица переходов между бассейнами 41
4.6. Кинетическая модель 43
4.7. Выводы 46
Глава 5. Прионоподобный белок 47
5.1. Дизайн белка 47
5.2. Взгляд на укладку с точки зрения равновесного моделирования 51
5.2.1. Поверхности свободной энергии 51
5.3. Карты контактов 54
5.4. Вероятности укладки в нативное и латентное состояния 57
5.5. Результаты равновесного моделирования 57
5.6. Кинетическая модель 58
5.7. Распределения времени укладки 62
5.8. Влияние мутаций на укладку 65
5.9. Выводы 65
Глава 6. Влияние латентного состояния на процесс укладки в нативное 67
6.1. Методика 67
6.2. Результаты 67
6.3. Оценка в рамках теории переходного состояния 71
6.4. Детализация роли латентных контактов 72
6.5. Выводы 73
Глава 7. Гидродинамическое описание укладки белка 76
7.1. Методика 76
7.2. Поверхность свободной энергии 76
7.3. Потоки изображающих точек системы и линии тока 77
7.4. Результаты 78
7.5. Выводы 83
Основные результаты работы: 84
Литература 87
- Парадигма энергетического ландшафта
- Кодирование структуры белка, инвариантное сдвигам, поворотам и отражениям
- Поверхности свободной энергии
- Мутационный анализ
Введение к работе
Актуальность работы. Белки представляют собой широкий класс биологических макромолекул, интерес к которым вызван как изучением процессов жизнедеятельности организмов и растений, так и большой практической важностью при решении задач, связанных с биотехнологией и медициной.
Диссертационная' работа посвящена исследованию укладки белка - актуальнойv проблеме молекулярной биологии, привлекающей внимание специалистов из различных областей науки - биологии, физики, химии - более 4-х десятилетий. Укладка - сворачивание белковой цепи из развернутого состояния в нашивную структуру, обладающую биологической активностью. Укладка происходит в живой клетке, но при всем разнообразии механизмов укладки, подчиняется общему принципу - нативная структура белка определяется его аминокислотной последовательностью (Анфинсен, 1973).
Хотя общие принципы уже достаточно хорошо известны (Финкелыптейн, Птицын, 2002; Whitford, 2005), сценарии укладки конкретных белков варьируются в широких пределах: от простого процесса «ничего/все» до гораздо более сложного поведения, связанного с усложненной конформацией нативного состояния и/или наличием метастабильных промежуточных состояний (интермедиатов). В последние годы были обнаружены два новых класса белков: белки, содержащие узлы в составе нативной структуры (Taylor, 2000; Ann et al., 2003; Vimau et al., 2006) и белки, обладающие помимо нативного конкурирующим латентным состоянием, в частности, прионы (Prusiner, 1996).
Диссертация посвящена исследованию укладки этих двух белков с помощью компьютерного моделирования. Поскольку современные компьютеры не позволяют решить данную задачу на атомном уровне разрешения, для моделирования используется простейшее приближение - белок представляется в виде последовательности мономеров, моделирующих аминокислоты, которые размещены в узлах кубической решетки, а взаимодействие между мономерами определяется конфигурацией нативного (и латентного) состояния с помощью модели Го (Go, 1983). Хотя такое приближение является весьма грубым, оно хорошо себя зарекомендовало для выявления общих закономерностей укладки белков в ходе многочисленных исследований за последние 20 лет (Dill, 1985; Sail et al., 1994; Onuchic et al., 1996; Gutin et al., 1998; Pande, Rokhsar, 1999; Borrero, Escobedo, 2006), и, по-существу, является единственно возможным приближением, которое позволяет получить статистически значимые результаты по кинетике укладки за разумное время моделирования.
Цель работы состоит в изучении механизмов укладки узельного и прионоподобного белков и включает следующие задачи:
Дизайн решеточных моделей узельного и прионоподобного белков.
Разработка компьютерной программы для моделирования и визуализации укладки решеточных белков.
Изучение процесса укладки и определение механизма заузливания для узельного белка.
Изучение укладки прионового белка с акцентом на оценку критических моментов и факторов, влияющих на выбор между нативной и латентной конформациями.
Разработка «гидродинамического» подхода, дающего дополнительную информацию об укладке белка на основе рассмотрения распределения потоков изображающих точек системы в конформационном пространстве.
Основные защищаемые положения
Анализ моделей узельного белка, содержащих узлы различной степени сложности, зависимость поверхности свободной энергии (ПСЭ) и среднего времени укладки (СВУ) от сложности узла.
Модели белков с латентными состояниями - простая модель (27 мономеров) и более реалистичная (70 мономеров), содержащая структурные элементы, присущие природному прионовому белку. Карты контактов и ландшафт ПСЭ, обнаружение бифуркационного бассейна, представляющего собой область притяжения, в которой происходит выбор дальнейшего пути между нативным и латентным состояниями. Кинетика укладки, модель переходов между бассейнами, вычисление констант переходов.
Влияние энергии латентных контактов на время укладки в нативное состояние, эффект ускорения укладки в присутствии латентного состояния, изменение вероятности укладки в нативное состояние под действием точечных мутаций.
«Гидродинамический» подход к анализу кинетики укладки белков и его иллюстрация на примере решеточной альфа-шпильки, анализ потоков изображающих точек системы в конформационном пространстве, обнаружение «вихревой» зоны, представляющей собой новый тип тупикового интермедиата.
Научная новизна. Для изучения механизма укладки недавно обнаруженного узельного белка (Taylor, 2000) впервые предложено несколько решеточных моделей, содержащих узлы разной сложности в составе нативных структур, и исследована зависимость времени укладки от сложности узла.
Впервые проведено исследование укладки прионоподобного белка с учетом структурных особенностей природного белка. Обнаружено наличие неизвестного ранее
бифуркационного бассейна - области притяжения на поверхности свободной энергии, в которой происходит выбор путей в нативную и латентную структуры. Установлена зависимость СВУ в нативное состояние от энергии латентных контактов, показывающая, что примесь латентной структуры может не только замедлять укладку, но и наоборот, в определенном интервале значений энергии латентных контактов, значительно ускорять ее; предложен механизм, объясняющий природу данного эффекта.
Впервые введен и апробирован на примере решеточной модели альфа-шпильки «гидродинамический» подход к анализу кинетики укладки белков.
Практическая значимость. Выявленные закономерности в механизмах поведения заузленного и прионоподобного белков могут представлять интерес для разработки лекарств на основе искусственно создаваемых белков с заданными свойствами, а также для выявления механизмов, лежащих в основе- нейродегенеративньгх заболеваний человека и животных. В частности, наличие бифуркационного бассейна в прионоподобном белке быть использовано для разработки методов управления процессом укладки путем внесения мутаций.
«Гидродинамический» подход дает более детальную картину укладки и, соответственно, возможность выявить скрытые процессы, не видимые в рамках стандартного анализа на основе рассмотрения поверхности свободной энергии.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на следующих совещаниях и конференциях: Международная Научная Студенческая конференция (Новосибирск, 2002, 2003, 2004, 2005), Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure (Novosibirsk, 2002, 2004, 2006), Moscow Conference on Computational Molecular Biology (Moscow 2003,2005,2007), PanREC-conference - AIl-Rec Meeting, Kazan, 2004 (CRDF), Международная молодежная школа-конференция по актуальным проблемам химиии и биологии (Владивосток, 2005), the 21 Symposium of the Protein Society (Boston, 2007).
По теме диссертации опубликовано 11 работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых отечественных и зарубежных журналах.
Работа выполнена в рамках государственной целевой программы (гос. per. 01.2.007 05696), атак же грантов CRDF # RUP2-2629-NO-04, INTAS 2001-2126, РФФИ 02-03-32048 и РФФИ 06-04-48587.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, семи глав, заключения,и списка литературы из 143 наименований. В ней 93 страницы и 41 рисунок.
Парадигма энергетического ландшафта
Термин «энергетический ландшафт» был впервые введен в контексте рассмотрения поверхностей свободной энергии (Bryngelson, Wolynes, 1987). В современном понимании понятие энергетического ландшафта включает в себя рассмотрение как поверхности, потенциальной энергии (ППЭ), так и поверхности свободной энергии (ПСЭ). Расчет термодинамических и динамических свойств системы напрямую связан с этими поверхностями. Чтобы построить эти поверхности, многомерное конформационное пространство белка сводится к небольшому числу переменных (параметров порядка), которые, предположительно, удовлетворительно характеризуют состояние белка; в качестве таковых используются радиус инерции, число нативных контактов и др. Таким образом, данные поверхности являются «вырожденными», т.е. каждому набору значений параметров порядка соответствует большое число конфигураций. Локальное значение свободной энергии белка при температуре Т определяется как Ft = Ut- Si, где U, и S„
соответственно, средняя внутренняя энергия и энтропия конформаций при значениях параметров порядка, отвечающих данной точке / сокращенного конформационного пространства. Энтропия белка показывает, каким числом микроскопических состояний можно реализовать состояние при данных значениях параметров порядка. Таким образом, минимумы на ПСЭ показывают (мета-) стабильные состояния, в которых система может быть обнаружена с высокой вероятностью.
Термодинамические свойства белка зависят только от энергий локальных минимумов на ППЭ и объемов конфигурационного пространства, связанных с ними, тогда как динамическое поведение зависит от того, как эти минимумы связаны между собой. 1.5. Поверхность свободной энергии и модель энергетической воронки
Природные белки могут укладываться в хорошо определенное нативное состояние, тогда как искусственные белки, составленные из случайной последовательности аминокислот, не обладают таким свойством (Bryngelson, Wolynes, 1987), поскольку у них отсутствует структура, в которой большинство возможных энергетически выгодных взаимодействий могли бы быть осуществлены одновременно. Поскольку нативное состояние белка определяется его аминокислотной последовательностью, разница между последовательностями, способными и неспособными к укладке, должна быть отражена в соответствующих энергетических поверхностях. Корреляция энергии и структуры приводит к направленному движению в сторону нативного состояния, а так же к сдвигу, направленному против структур, значительно отличных от нативной. Эта корреляция ответственна за форму ландшафта (Рис. 1.3). Случайная последовательность не обнаруживает такой корреляции между энергией и конформацией, и соответствующая поверхность будет содержать лишь случайные неровности, систематический сдвиг в сторону нативной структуры будет отсутствовать (Рис. 1.3а). Для того чтобы при наличии нативного состояния существовала возможность успешной укладки, температура должна превышать так называемую температуру стеклования, при которой энергия белка сравнима с неровностями поверхности и кинетика процесса определяется ненативными ловушками, а не сдвигом к нативному состоянию. Таким образом, совместное влияние неровностей и ловушек вместе со сдвигом к нативному состоянию играет центральную роль в процессе укладки белка, приводя к разнообразию возможных сценариев укладки (Bryngelson et al., 1995; Onuchic et al., 1997; Nymeyer et al., 1998). Было высказано предположение, что природные белки эволюционировали, минимизируя фрустрацию (следствием которой является изрезанность энергетического ландшафта) насколько это возможно (Bryngelson et al., 1995), в результате чего нативное состояние стало низколежащим минимумом свободной энергии. Термин «фрустрация» относится к ситуации, когда белок не может одновременно реализовать все возможные контакты, т.е. имеет место конкуренция между структурными и энергетическими требованиями.
Присутствие хорошо определенного минимума по свободной энергии для нативного состояния само по себе не является достаточным для того, чтобы белок мог эффективно укладываться в него, поскольку минимум должен быть еще и кинетически достижим (Bryngelson, Wolynes, 1987).
Важно отметить, что если изменить определение параметров порядка, локальные минимумы по свободной энергии изменяться. Поэтому «тонкая» структура ПСЭ вряд ли значима для укладки белка. Например, для «идеальной» системы, в которой все нативные контакты отвечают за притяжение и равны по величине, энергия любой конфигурации пропорциональна числу нативных контактов (Onuchic et al., 2000). В такой ситуации не будет фрустрированных взаимодействий и возможности попадания в ловушки, отделенные энергетическими барьерами. Однако, что существенно, барьер по свободной энергии между бассейнами неупорядоченных и упорядоченных состояний (нативным), основанный на разности их энтропии, будет продолжать существовать.
Кодирование структуры белка, инвариантное сдвигам, поворотам и отражениям
Определенную проблему представляет собой сравнение структур. Структура определяется массивом троек чисел (X„ I,ZJ), задающих координаты каждого мономера. Анализируя структуры путем сравнения координат, надо учесть, что координаты двух одинаковых структур могут быть разными, если имеется сдвиг одной относительно другой в пространстве, а также поворот структуры как целого. Однако, можно воспользоваться тем, что вектора, задающие координаты мономеров, связаны между собой: каждый последующий получается из предыдущего путем добавлением вектора смещения на один узел решетки. Таких векторов смещения всего шесть - {1,0,0}, {0,1,0}, {0,0,1} и противоположные им {-1,0,0}, {0,-1,0}, {0,0,-1}. Они могут быть закодированы шестью числами, например,1 0, 1, 2, 3, 4 и 5. Воспользовавшись этим способом, мы получим для белка, состоящего из L аминокислот, вместо массива размером L 3 строку из L-\ цифр и приобретем инвариантность относительно сдвигов в пространстве.
Не столь тривиально обеспечить инвариантность к поворотам в пространстве и отражениям. Повороты дают 3x4 = 12 различных вариантов положения одной и той же структуры в пространстве (по 4 поворота — на 90, 180, 270 и 360 градусов вокруг каждой из 3-х осей X, Y и Z), т.е. такое число вариантов пришлось бы перебрать, чтобы выяснить идентичность двух структур, что замедлило бы скорость работы программы более чем на порядок.
Эта задача была решена следующим образом: Введем систему координат, привязанную не к пространству, а к структуре. Представим себе какую-нибудь структуру, например, показанную на Рис. 2.2. Двигаясь последовательно от первого мономера до 27го, рассматриваем вектора смещения 1-2, 2-3, 3-4 и т. д. Нам нужно задать три базовых вектора, ортогональных друг другу. Первый получается автоматически - это направление первого встретившегося вектора смещения, 1-2. Далее движемся вдоль цепи в поисках второго базового вектора, который должен быть ортогонален первому. Вектор 2-3 - такой же, как и 1-2, а вот следующий вектор 3-4 нам подходит. В завершение, мы ищем последний базовый вектор, который должен быть ортогонален уже найденным первому и второму. В данном случае это будет вектор 4-5. Обозначим первые три вектора цифрами 0, 1 и 2, а противоположные им - цифрами 3, 4 и 5, соответственно. Теперь вся структура кодируется в виде последовательности чисел, задающих вектора смещения один за другим. Таким образом, для структуры, показанной на Рис. 2.2, получаем следующий код: 00124455113442211532445511. Можно убедиться, что он будет одинаков для поворотов и зеркальных отражений этой структуры и что такой способ кодирования универсален.
Полимер, состоящий из L мономеров, кодируется L-1 векторами смещения. Отметим, что для данного способа кодирования первая цифра всегда будет 0 (а остальные, естественно, произвольны и определяются структурой), поэтому можно условиться вообще ее не писать, но иметь ввиду при декодировании.
Таким образом, мы избавились от необходимости проверять все возможные варианты взаимного расположения двух структур в пространстве и одновременно минимизировали размер записи о структуре без какой бы то ни было потери информации. Теперь, сравнивая две строки, в случае их совпадения мы можем утверждать, что структуры одинаковы, в противном же случае, они различны.
Для белка, обладающего двумя стабильными структурами - нативной и латентной, отличны от нуля все элементы матрицы e,j, для которых мономеры / и у образуют контакт в нативной или в латентной структурах. В общем случае, пары контактов i-j могут быть как полностью различными в нативной и латентной структурах, так и частично совпадать. Для модели прионоподобного белка значения є для нативных, латентных и общих контактов немного различаются (более подробно — в Главе 5, описывающей данную модель). В случае белка, обладающего двумя стабильными состояниями, нативным и латентным, укладка может происходить в любую из этих двух структур.
Для построения поверхности свободной энергии вводятся две переменные, параметры порядка, которые вовлекают изменения- большого числа степеней свободы и, предположительно, способны описать процесс укладки должным образом. Один из вариантов выбора — это полное число контактов N и число нативных контактов Nnai (Plotkin, Onuchic, 2002). Первая переменная характеризует компактность белка и служит прогресс-переменной для процесса укладки, вторая отражает степень сходства структуры с нативпой. Каждая из этих двух переменных может принимать для нашего белка дискретные значения от 0 до Nnat Далее, в ходе всего процесса моделирования укладки заполняется матрица Q(NJVnai), в которой каждое посещение приводит к увеличению значения Q(N,Nnai) на единицу. В итоге мы имеем число посещений каждого из состояний Q(N,Nna), а затем, нормируя на полное число посещений (т. е. на длину траектории моделирования, число шагов), получаем вероятность посещения этих состояний-ДЛуУпаО- Функция F(N,Nnat), задающая поверхность свободной энергии с точностью до постоянной, определяется как: F = -kBf\nP(N,NBai)+C где &в - постоянная Больцмана, которая во всех представленных расчетах принималась равной 1, т.е. температура измерялась в единицах энергии взаимодействия мономеров в белке.
Необходимо отметить, что рассмотренные переменные N и iVnat, равно как и любое другое число переменных, меньшее чем число степеней свободы системы, дает лишь редуцированную ПСЭ, в которой каждая точка многократно вырождена по числу состояний. К примеру, точке (N-0, Nnax=0) для 27-мера отвечает огромное число состояний, которое можно оценить сверху как 5 (5 - число вариантов пространственного расположения мономера относительно двух предыдущих по цепи, 25 - число таких последовательных троек в цепи длиной 27). Увеличение значений N и Nn3.t приводит к наложению все большего числа ограничений на структуру, но лишь нативное состояние, для которого JV=28 и JVnat = 28, является невырожденным. Также может возникнуть неверное представление о связности такой поверхности свободной энергии. Как мы уже видели на примере Рис. 2.2., переход за счет элементарного движения может приводить к изменению числа контактов до 5. В случае рассмотрения белка с латентной структурой для построения поверхности свободной энергии помимо пары N и N„at могут быть использованы N и N\at, или iVnat и iViat, где JVjat - число латентных контактов (т.е. число контактов в латентной структуре).
Для построения поверхности вероятности укладки, например, в нативную структуру, в зависимости от JVnat и N\at, мы делаем следующее: по ходу моделирования, через определенное число шагов, например, 1000, фиксируем текущее состояние и значения iVnat и N\at, а затем выпускаем последовательно несколько десятков траекторий, стартующих из этого состояния. Число траекторий, пришедших в нативную структуру, деленное на полное число траекторий, выпущенных из данного состояния, составит вероятность укладки в нативное состояние из точки (Nnat , N\at), которую мы будем обозначать Paat(Nm, N\ut). Число траекторий, пришедших в латентное состояние, деленное на полное число траекторий, мы обозначим как Pat(A at, -ЭДаО- Оно будет равно 1 - Pm(Nnax., N\at). Если система попадет в какую-либо точку (Nnat, N\at) более одного раза, значения Pmt(Nnat ДіаО и Pbi(Nmt , -Мы) будут усреднены по всем таким попаданиям. Процедура продолжается до тех пор, пока поверхность (/Vnat, N\at) не будет покрыта по меньшей мере один раз.
Поверхности свободной энергии
Для более детального исследования были рассчитаны также поверхности свободной (ПСЭ) энергии (см. 2.6), для каждой структуры при соответствующей оптимальной температуре укладки 7f (Рис. 3.4, Рис. 3.5 и Рис. 3.6) Поверхности построены на основе траекторий, стартующих из случайного развернутого состояния и заканчивающиеся при достижении нативного, т.е. соответствуют случаю неравновесного моделирования.
Характерное различие данных ПСЭ состоит в том, что в отличие от моделей без узла (Рис, 3.4) и с простым узлом (Рис. 3.5), на ПСЭ для белка с узлом (Рис. 3.6) появляется барьер между полукомпактной глобулой и нативным состоянием. Поскольку для задания взаимодействия между мономерами используется модель Го, в которой (потенциальная) энергия монотонно понижается с приближением к нативному состоянию, этот барьер носит энтропийную природу, являясь следствием структурных ограничений при формировании узла.
С помощью компьютерного моделирования показано, что сконструированный модельный решеточный белок может успешно формировать узел-восьмерку, а также, что время укладки для белка с узлом-восьмеркой существенно больше, чем для белков без узла и с простым узлом.
Рассмотрение поверхностей свободной энергии показало, что уменьшение времени укладки для белка с узлом-восьмеркой обусловлено появлением выраженного энтропийного барьера между бассейном полукомпактных состояний и нативной структурой, который является следствием структурных ограничений при формировании узла. нативное состояние полукомпактная глобула развернутые состоянии число нативных контактов Сценарии укладки белка могут быть существенно различными, начиная от сравнительно простого процесса, когда поверхность потенциальной энергии представляет собой воронку, и заканчивая весьма сложным поведением системы, в которой присутствуют интермедиаты по ходу прямого пути укладки и вне его, а так же параллельные пути (Dinner et al., 2000). Хотя нативная структура белка однозначно определяется последовательностью аминокислотных оснований, существуют белки, в которых имеются состояния, конкурирующие с нативным. Особый класс интермедиатов, лежащих вне пути укладки и стабильных настолько, что они могут конкурировать по стабильности1 и/или, по кинетической досягаемости с нативным состоянием, называют латентными состояниями, наиболее известными примерами которых являются серпины и прионы (Финкелыитейн, Птицын, 2002).
Проявления латентных состояний в процессе укладки различны и зависят от конкретного белка. Например, патогенное состояние (PrPSc) прионового белка (РгР) склонно к агрегации (Wang et al.,1996), белок serpin plasminogen activator inhibitor 1 (PAI-1) сворачивается в активную структуру с последующей медленной перестройкой в более стабильное, но менее активное состояние (Ye, Goldsmith, 2001; Sohr et al., 1998), белок alpha-Lytic protease сворачивается в неактивное, частично сформированное состояние в отсутствии про-области (Volkman et al.,2001), а нефосфорилированный сигнальный белок NtrC существует в двух, активной и неактивной, конформациях (Ни, Wang, 2006; Dobson, 2003). Однако, общее свойство всех этих систем состоит в том, что латентное состояние является альтернативной целевой структурой для укладки. Одно из возможных следствий этого, известное как "kinetic partitioning" (кинетическое разделение, декомпозиция) (Jimenez et al., 1999; Guo, Thirumalai, 1995; Abkevich et al., 1998), заключается в том, что траектории укладки разделяются на два класса: быстрые траектории, ведущие в нативное состояние напрямую, и медленные, которые сначала попадают в латентное состояние. В этом отношении латентное состояние выступает в роли долгоживущего интермедиата вне траектории укладки, как это наблюдается в некоторых решеточных модельных белках (Nakamura, Sasai, 2001; Abkevich et al., 1994; Dinner, Karplus, 1999).
В качестве модельной системы мы исследовали решеточный гетерополимер из 27 мономеров (Рис. 4.1). На Рис. 4.2 показана матрица контактов для данного белка. Система сконструирована таким образом, что имеются две минимальные и равные по энергии полностью компактные структуры, значительно различающиеся по геометрии. Одна из них, укладка в которую происходит быстрее, рассматривается как нативная (а), а вторая, в которую медленнее, как латентная (Ь). В качестве энергетической модели использовалась модель типа модели Го (Go, 1983), т.е. между мономерами, которые находились в контакте в составе нативной или латентной структуры, существовало притяжение (с энергией е = -1), а во всех других случаях взаимодействие отсутствовало. Процесс укладки моделировался методом Монте-Карло по схеме Метрополиса.
Для вычисления времен укладки моделировался ансамбль траекторий, каждая из которых начиналась в развернутом состоянии полимера и завершалась по достижению нативного или латентного состояния. По полученным данным вьшислялось среднее время укладки, в эти состояния напрямую, т.е. без посещения конкурирующей структуры. В обоих случаях оно имело U-образную зависимость от температуры, что типично для белков (Galzitskaya, Finkelstein, 1995), и достигало минимума при «оптимальной» температуре укладки 7 = 0.6. Время укладки бьшо также примерно одинаково, около 3.9-105 шагов, однако вероятности укладки в нативную и латентную структуры различались существенно - 0.61 и 0.39 для нативной и латентной структур, соответственно.
Для белка с латентным состоянием поверхность свободной энергии удобнее строить в зависимости от числа нативных контактов Nnat и числа латентных контактов N\at. На Рис. 4.3 показана полученная ПСЭ при оптимальной температуре укладки Т{ - 0.6 и характерные структуры, соответствующие ее основным областям. Данная поверхность представляет равновесные условия, т.е. траектория не обрывалась при достижении нативного или латентного состояний, а продолжалась дальше, пока не покроет большую часть пространства состояний, неоднократно посещая бассейны притяжения для нативной и латентной структуры. Были рассчитаны вероятности пребывания системы в состояниях с различным числом нативных (JVnat) и латентных (Л ) контактов. Эти данные позволили построить поверхности свободной энергии системы как функции пары переменных из N, Nnat и iViat, вычисляя свободную энергию как F(Nmlfl\a{) = -Т In P(Nnai,N\ai) + С, где Т -температура и Р - упомянутая выше вероятность (температура измеряется в единицах энергии контактов, т.е. постоянная Больцмана принята за единицу), константа С определялась из условия, что энтропия нативного состояния равна нулю, поскольку оно представлено единственной конформацией. Поверхность состоит из трех широких бассейнов; один из них отвечает полукомпактной глобуле (средние значения Nnut и Niat), а два других - нативному и латентному бассейнам (большие значения 7Vnat и N\at, соответственно). На Рис. 4.3 видно, что нативный и латентный бассейны связаны не напрямую, а через бассейн для полукомпактной глобулы, что впоследствии подтвердилось исследованием кинетики.
Процесс укладки характеризуется бифуркацией траекторий укладки на границе, разделяющей бассейны для полукомпактной глобулы и нативного и латентного состояний. При этом с большей вероятностью (0.61 против 0.39) траектории попадают в нативный бассейн, который отделен более низким барьером (Рис. 4.3). Рис. 4.4 показывает вероятность достижения нативного состояния из различных областей конформационного пространства, характеризующихся различным числом нативных и латентных контактов. Каждая точка этой поверхности отвечает набору состояний с данным числом нативных и латентных контактов и показывает среднюю вероятность укладки из данной точки в нативное состояние. Большая часть поверхности, которая захватывает область перехода из развернутого состояния в нативный бассейн, отвечает доминирующей вероятности укладки в нативную структуру. Область бифуркаций, в которой вероятности укладки в тот или иной бассейн примерно равны, находится вблизи границы перехода из бассейна полукомпактных состояний в латентный бассейн. И, наконец, укладка в латентную структуру доминирует только в окрестностях латентного бассейна.
Мутационный анализ
Было также рассмотрено влияние мутаций на вероятности и средние времена укладки в нативную и латентную структуры Мутации вводились путем «выключения» энергии взаимодействия в заданной паре мономеров. Расчеты показали, что мутации в нативных контактах незначительно увеличивают время и уменьшают вероятность укладки в нативное состояние, а мутации в латентных контактах приводят к таким же изменениям для укладки в латентное состояние (Рис. 4.5). Мутации в общих контактах практически не влияют на вероятности укладки, но существенно замедляют время укладки, как в нативное, так и латентное состояние.
Следующий этап состоял в определении нативного и латентного бассейнов (см. 2.8) на поверхности свободной энергии Рис.4.4. Поскольку при равновесном моделировании рассматривается одна непрерывная траектория, максимальное время система проводит в нативном и латентном состояниях, как наиболее стабильных. Времена переходов между бассейнами сравнимы по порядку величины с временами укладки. Таким образом, в случае равновесного моделирования мы можем изучать переходы между бассейнами. Для равновесного моделирования требуются времена много большие, чем среднее время укладки, т. е. » 105—10б шагов МК. Мы использовали времена большею шагов.
С помощью описанного в п. 2.8. алгоритма мы получили множества состояний, отвечающих нативному и латентному бассейнам и их границам. Для траектории длиной 109 шагов число найденных состояний составило 83664 для нативного бассейна и 28934 для латентного. Переходные состояния составили, соответственно, 6943 и 3592 для нативного и латентного бассейнов. Эти результаты удобно представить в виде спектра состояний (Рис. 4.6). При равных значениях потенциальной энергии нативного и латентного состояний свободная энергия нативного оказалась ниже, т. к. число состояний, а следовательно, и энтропия для нативного бассейна больше. Соответствие свободной энергии числу состояний показано на Рис. 4.7. Следует отметить, что найденные состояния не исчерпывают все множества состояний в бассейнах и на границах. Однако, как показали расчеты с увеличенной длиной траектории, на больших временах числа состояний растут приближенно пропорционально длине траектории ( /07). Поэтому можно предположить, что приведенные числа правильно отражают относительные свободные энергии нативного и латентного бассейнов и переходных состояний.
Зная множества состояний, принадлежащих нативному и латентному бассейнам, можно определить для любого состояния, относится ли оно к нативному или латентному бассейну, или лежит вне их, т.е. в бассейне полукомпактных и развернутых состояний. В ходе моделирования система перемещается между этими тремя бассейнами, и мы можем определить вероятности переходов между бассейнами. Как и предполагалось из ландшафта ПСЭ (Рис. 4.3), прямые переходы между нативным и латентным бассейнами отсутствуют; они могут осуществляться только через бассейн полукомпактных и развернутых состояний.
Сравнивая решение этой системы уравнений с результатами численного моделирования, можно оценить константы скоростей ка—р, входящие в уравнения. Для этой цели мы использовали зависимости п (0 и ni(t), характеризующие установление равновесия в системе, первоначально находившейся в нативном состоянии (Рис. 4.8). Минимизируя среднеквадратичное отклонение между данными зависимостями и соответствующими теоретическими распределениями, полученными путем численного решения системы уравнений (4.1), для Т = 0.6 были найдены: A//—NG 8.4-10", kNG- N 2.0-10" , km- G 3.0-10 , &с-»м7 4.4-10 , кс- ш 3.0-10"6, kia G 1.6-10 5, кщ ь 1.5-10 5 и к ш 1.0-10 6.
Для сравнения полученных констант переходов с данными таблицы рассчитаем константы равновесия Ка - р = ка- р/ ка р для переходов G - N и G -»L для этих случаев. Для табличных данных /CG N = 2.68 и ATG«-»L = 1.91, а на основе констант, полученных при рассмотрении кинетической схемы ATG«-»N = 3.49 И KQ L — 2.81, что достаточно неплохо согласуется. Заниженные значения констант равновесия для табличных данных по сравнению с кинетической схемой, которая отлично описывает систему, объясняются тем, что при регистрации переходов между бассейнами иногда происходят «ложные срабатывания» за счет диффузии системы на границе бассейна: система выходит из нативного или латентного состояния в глобулу (т.е. разрывает большую часть контактов), но в течение короткого время ( 104 шагов МК) снова возвращается в бассейн, из которого пришла.
Зная константы скоростей и используя систему уравнений (4.1), можно рассчитать поведение системы в интересующих условиях. В частности, можно вычислить распределение времен укладки в неравновесных условиях, когда траектория системы прерывается при достижении нативного состояния. Оно определяется как p/t) = dn (t)/dt, при этом при вычислении n (t) константа &N—NG В первом уравнении системы (4.1) полагается равной нулю. На Рис. 4.9 представлен такой расчет в сравнении с результатами прямого численного моделирования. Удовлетворительное согласие распределений свидетельствует о том, что описанный метод оценки констант скоростей вполне работоспособен. В качестве исходных зависимостей na(t) можно использовать и зависимости, получаемые в эксперименте (Gruebele, 2004). Такой тип распределений характерен для систем, обладающих тупиковыми интермедиатами (Chekmarev et al., 2005), роль какового в данном случае играет латентное состояние. При этом первая мода распределений (примерно соответствующая t 1-Ю6 на Рис. 4.9) отвечает траекториям укладки, которые следуют из полукомпактного глобулярного состояния в нативное непосредственно, а вторая мода (t 1-Ю6) - траекториям, которые проходят через метастабильное латентное состояние, возможно, посещая его неоднократно. Такой биэкспоненциальный характер распределений времен укладки свидетельствует, в частности, о том, что упомянутый метод параллельных копий (Voter, 1998; Shirts, Pande, 2001) не годится для исследования укладки в случае наличия латентной структуры.
