Содержание к диссертации
Принятые сокращения 4
ВВЕДЕНИЕ 5
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12
1.1. Основные белковые факторы патогенности стрептококков группы А 12
1. 2. IgG Fc-связывающие белки стрептококков группы А 17
1.3. Иммунопатологические механизмы развития ревматизма 19
1. 4. Роль иммунопатологических механизмов в патогенезе острого постстрептококкового гломерулонефрита 25
1.5. Роль стрептококковых IgG Fc-рецепторных белков в развитии постстрептококковых иммунопатологических процессов 30
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 35
2. 1. Бактериальные штаммы 35
2. 2. Препараты 36
2. 3. Иммунизация кроликов 37
2. 4. Методы тестирования IgG Fc-связывающей активности у стрептококков 37
Радиоиммунологический метод (РИА) 37
Иммупофермеитный анализ (дот - блот) Ъ1
2. 5. Определение протеиназной активности 38
2. 6. Тест по выявлению антител к IgG в сыворотках иммунизированных кроликов 38
2. 7. Иммуноморфологическое и электронно-микроскопическое исследования тканей кроликов 39
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 41
3.1. Влияние условий культивирования стрептококков группы А на их IgG Fc-связывающую активность 41
3. 1.1. Влияние времени и атмосферных условий инкубации стрептококков на их IgG Fc-связывающую активность 42
3. 1.2. Влияние стрептококковой цистеиновой протеиназы на бактериальную IgG Fc связывающую активность 48
3. 2. Роль IgG Fc-связывающих белков стрептококков группы А в индукции экспериментального гломерулонефрита 52
3.2.1. Индукция антииммуноглобулинов у кроликов 52
3. 2. 2. Иммуноморфологические изменения при иммунизации кроликов IgG Fc-позитивными стрептококками группы А 54
3.3. Роль IgG Fc-связывающих белков стрептококков группы А в индукции экспериментального миокардита 60
3. 4. Экспериментальные иммунопатологические процессы, индуцируемые стрептококковыми изогенными мутантами 65
4. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 69
5. ВЫВОДЫ 89
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Введение к работе
Актуальность проблемы. По данным Комитета по стрептококкам и стрептококковым заболеваниям Всемирной организации здравоохранения заболевания, вызываемые гемолитическими стрептококками, занимают ведущее место среди инфекционных заболеваний человека бактериальной природы. Во всем мире ежегодно регистрируется около 100 млн человек, перенесших первичную стрептококковую инфекцию Носительство стрептококков достигает до 30%, особенно при сезонных подъемам заболеваемости [147]. Стрептококки серологической группы А являются причиной широкого спектра заболеваний как в форме острой инфекции (ангина, фарингит, скарлатина гнойничковые поражения кожи, некротизирующий фасцит, сепсис, токсический шоковые синдром), так и форме хронических заболеваний, среди которых наиболее тяжелыми являются острый постстрептококковый гломерулонефрит и ревматическая лихорадка поражающие в основном людей трудоспособного возраста и приводящие, как правило, к глубокой инвалидизации [1,30,143].
В настоящее время накоплена значительная информация о структуре стрептококка биологических свойствах его антигенов, токсинов и ферментов [24, 38, 91], но точные механизмы проявления патогенности микроба остаются и сегодня не до конца изученными і нуждаются в дальнейших исследованиях.
Можно считать установленным, что основными факторами патогенності стрептококков группы А являются М белок и белки, относящиеся к семейству М-подобны белков [57], значительное место в котором принадлежит стрептококковым поверхностный белкам, ответственным за связывание Fc-фрагмента молекулы IgG человека и некоторы млекопитающих, так называемым стрептококковым IgG Fc-рецепторам. За последние годь достаточно полно изучены функциональная активность IgG Fc-связывающих белков, и молекулярная структура и структура генов, ответственных за экспрессию данных белков [42, 48, 140]. Неоднократно осуществлялись также попытки определить биологическую значимость данного феномена как в проявлении патогенных свойств возбудителя, так и в ответных реакциях инфицированного макроорганизма [37, 130]. На основании результатов такого рода исследований, проведенных в Отделе молекулярной микробиологии НИИЭМ РАМН, сформулирована концепция о роли стрептококковых IgG Fc-рецепторов на различных этапах стрептококковой инфекции от момента формирования микробного очага до развития постстрептококковых осложнений иммунопатологической природы, к которым относятся постстрептококковый гломерулонефрит и ревматические поражения миокарда [2]. Однако проблема патогенеза постстрептококковых осложнений сохраняет и по сей день свою актуальность и значимость, особенно в плане выявления и изучения основных факторов, инициирующих и поддерживающих иммунопатологический процесс.
Все вышеизложенное определило цель и задачи настоящего исследования.
Целью данной работы явилось исследование роли IgG Fc-связывающих белков в развитии экспериментальных иммунопатологических процессов, индуцируемых IgG Fc-позитивными стрептококками группы А.
Для этого планировалось выполнить следующие задачи:
1. Показать зависимость экспрессии IgG Fc-связывающих белков стрептококковыми клетками от условий культивирования микробов и установить влияние стрептококковой цистеиновой протеиназы на их IgG Fc-связывающую активность.
2. Выявить в динамических исследованиях иммунологические и морфологические изменения у кроликов, иммунизированных IgG Fc-позитивными стрептококками группы А:
исследовать корреляцию между способностью стрептококков индуцировать синтез I крови антител к IgG и депозицию в тканевых структурах миокарда и почечны гломерул IgG и СЗ компонента комплемента; - выявить продукцию in situ основных провоспалительных цитокинов (IL-1(5, IL-6 и TNF-а);
исследовать характер морфологических изменений в почечной и сердечной тканях НЕ различных сроках иммунизации.
3. Сравнить характер иммуноморфологических изменений у кроликов, иммунизированны IgG Fc-позитивными микробами с различной специфичностью IgG Fc-связывающи? белков.
4. Изучить способность изогенных мутантов стрептококка группы А типа М21 индуцировать при иммунизации кроликов экспериментальный иммунопатологические процесс.
Научная новизна работы.
Впервые показано, что уровень экспрессии IgG Fc-связывающих белков зависит от условий культивирования стрептококков группы А. Установлено, что стрептококковая цистеиновая протеиназа ингибирует активность IgG Fc-связывающих белков как интактнь» микробных клеток, так и выделенных из них препаратов IgG Fc-рецепторов.
Впервые установлена роль IgG Fc-связывающих белков стрептококков группы А і качестве фактора инициации иммунопатологических процессов в почечной ткани и і миокарде иммунизированных кроликов.
Проанализирована динамика иммуноморфологических изменений в пораженнь» тканях животных. Наблюдаемые деструктивно-дегенеративные изменения в почечной ткаш сопоставимы с изменениями, обычно характерными для острого постстрептококковогс гломерулонефрита. Морфологические изменения в сердечной ткани сопоставимы изменениями, наблюдаемыми при ревматическом миокардите.
Впервые изучена активность генетических вариантов стрептококка группы А тип М22 в индукции иммунопатологического процесса у кроликов и подтверждена роль их Ig( Fc-связывающих белков в индукции экспериментальных гломерулонефрита и миокардита.
Теоретическая значимость работы.
Работа носит экспериментально-теоретический характер. Проведенное исследовани позволило раскрыть общие механизмы аутоиммунных процессов стрептококково этиологии. Полученные данные показали, что IgG Fc-связывающим белкам принадлежи ведущая роль в качестве факторов, инициирующих развитие экспериментальны гломерулонефрита и миокардита. Стрептококки группы А, экспрессирующие IgG Fc связывающие белки, индуцируют при иммунизации кроликов синтез в крови антител к IgG последующей депозицией в тканевых структурах почек и сердца иммунного глобулина литической фракции комплемента СЗ, что приводит к иммунному воспалению в очага выраженной депозиции. Этот процесс способствует активации in situ клеток и продукци провоспалительных цитокинов IL-1 (3, IL-6, TNF-a, приводящих к дальнейшей деструкци ткани с высвобождением тканевых детерминант, перекрестно-реагирующих с биологическ активными субстанциями микробной клетки, и возможным образованием тканевы аутоантигенов. При этом контрольные стрептококки групп А и В, не экспрессирующие Ig( Fc-связывающие белки, и кокковые микробы с иной специфичностью Fc-рецепторны белков вызывают лишь незначительные (обратимые) изменения в тканях иммунизированны кроликов. Изогенный мутант стрептококка, полностью лишенный генов, контролирующи синтез IgG Fc-связывающих белков, не индуцирует при иммунизации кролико экспериментальные гломерулонефрит и миокардит, что подтверждает инициирующую рол стрептококковых IgG Fc-связывающих белков в генезе аутоиммунных заболевание стрептококковой этиологии.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Экспрессия IgG Fc-связывающих белков стрептококками группы А обусловлен» условиями культивирования микробов и связана со временем инкубации і концентрацией СОг. Стрептококковая цистеиновая протеиназа, синтезируема) микробными клетками, снижает IgG Fc-связывающую активность последних.
2. IgG Fc-позитивные стрептококки группы А типов Ml, М4, Ml5 и М22 индуцируют прі иммунизация кроликов синтез антител к IgG в крови, вызывают депозицию IgG и С; компонента комплемента на базальной мембране клубочков, продукции провоспалительных цитокинов мезангиальными и эндотелиальными клетками, а такжі выраженные дегенеративно-деструктивные изменения в почечной ткани классифицируемые как экспериментальный гломерулонефрит. IgG Fc-негативны штаммы стрептококков групп А и В, а также IgG Fc-позитивные микробы (стрептокою группы G и Staphylococcus aureus), продуцирующие IgG Fc-рецепторные белки иноі специфичности, подобной активностью не обладают.
3. При иммуноморфологическом исследовании миокарда кроликов, иммунизированны стрептококками группы А типов Ml и М22, помимо обнаруженной депозиции IgG и С: комплемента в тканевых структурах миокарда и продукции цитокинов IL-ip, IL-6, TNF- миоцитами, идентифицированы выраженные морфологические изменение характеризующие развитие миокардита.
4. При введении кроликам изогенных мутантов стрептококка типа М22 показано, чт только мутант, полностью лишенный генов, контролирующих экспрессию IgG Fc связывающих белков, не индуцирует гломерулонефрит и миокардит. Достоверность полученных результатов подтверждается высокой специфичностыс использованных современных иммунологических, иммунохимических, морфологических и микробиологических методов (радиоиммунологический метод; иммуноферментный метод Е различных модификациях с использованием для постановки нитроцеллюлозных мембран и ультратонких тканевых срезов исследуемых органов экспериментальных животных: разноуровневая микроскопия тканевых препаратов от световой до электронной) Особенностью исследования является комплексный подход в применении все вышеперечисленных методов. Статистическую обработку результатов проводили с помощьк критерия Стьюдента. Применение для иммунизации стабильных изогенных мутантої стрептококков позволило получить достоверные результаты по доказательству рол стрептококковых IgG Fc-рецепторов в индукции иммунопатологического процесса. Вы эксперименты по иммунизации кроликов характеризовались высокой степеньк повторяемости и достаточно представительным количеством животных (126 кроликов), і том числе и контрольных.
Апробация работы.
По материалам диссертации опубликовано 13 работ. Результаты диссертационной исследования доложены на различных Российских и Международных конференциях і симпозиумах: Научной конференции к 100-летию А.И.Нестерова, Институт Ревматологи! РАМН, Москва, 1995; XIIIЛ Lancefield International Symposium on Streptococci and Streptococca diseases, Paris, France, 1996; XXXYIII Berzelius Symposium "Microbes, Autoimmunity and chronii inflammation. Clinical and experimental aspects and relevance for rheumatology", Stockholm, Sweden 1997; Конференции "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины посвященная 240-летию ММА им. И.М.Сеченова, Москва, 1998; XTV Lancefield Internatione Symposium on Streptococci and Streptococcal diseases, Auckland, New Zealand, 1999. Диссертационная работа апробирована на научной конференции Отдел; молекулярной микробиологии НИИЭМ РАМН 10 октября 2000 г.
Объем и структура диссертации.
Диссертация изложена на 107 страницах и состоит из введения, обзора литературы материалов и методов, собственных исследований, обсуждения полученных результатов выводов. Работа иллюстрирована 5 таблицами и 10 рисунками. Список литературы содержи-13 отечественных и 147 зарубежных источников.
