Введение к работе
Актуальность проблемы. Кооперативные взаимоотношения, возникающие между специфическими и неспецифическими защитными реакциями, составляют одно из важных направлений иммунологических исследований. В последние годы создание и подтверждение теории иммуноцитокиновой регуляции защитных реакций как важнейшего фактора интегративности иммунной системы вывело изучение этой кооперации на новый уровень. Одновременно имеются указания на участие белков пентраксинового семейства в регуляции как неспецифических, так и иммунных реакций. К пентраксинам относятся сывороточные белки неиммуноглобулинового происхождения с пентамерной (обычно гомопентамерной) структурой молекулы. Наибольшее число работ рассматривает роль С-реактивного белка (СРБ) и сывороточного амилоида Р (САР), связанных между собой общим происхождением и сходной структурой молекулы. Как правило, СРБ изучается и анализируется в аспекте острофазовых реакций и установленных иммунорегуляторных потенций , а также его эффектов в отношении фагоцитов крови. Анализ роли САР связан в основном с его участием в формировании амилоидных фибрилл различной локализации. В последние годы объемы исследований САР в мире существенно возросли, что связано с его обнаружением в амилоидных отложениях при болезни Альцгеймера, а также в составе атеросклеротических бляшек. Все это, а также огромный объем мировой литературы по проблемам острофазовых белков, является признаками актуальности данного исследования.
В отечественной литературе объем публикаций по иммунологическим и патофизиологическим аспектам влияний острофазовых белков весьма невелик. Одновременно уже в течение 10 лет полностью отсутствуют экспериментальные работы по цитотропным эффектам САР, его роли в патогенезе многих заболеваний и значимости оценки его уровня. Для отечественной иммунологии представляемая работа является одной из первых попыток анализа механизмов кооперации неспецифических защитных и иммунных взаимодействий сквозь призму взаимодействия СРБ и САР.
Несмотря на многолетнюю историю изучения и описание множества отдельных эффектов СРБ и САР, число обзорно-теоретических работ невелико. Это отражает отсутствие единой точки зрения на коренные иммунобиологические функции СРБ и САР, а в определенной степени - узость дифференциального подхода многих авторов, в течение длительного времени разрабатывающих конкретные точечные аспекты биологии и клинической роли этих белков. В результате для СРБ описано очень большое число эффектов в отношении нейтрофилов, мононуклеарных фагоцитов,
лимфоидных клеток, кровяных пластинок и гораздо меньшее - в отношении ш кооперативных взаимодействий между собой и с другими клеточными v, гуморальными факторами. Что касается САР, то не только механизмы егс взаимодействий с клетками, но и направление эффектов часто представляє! собой сплошное белое пятно.
Наконец, актуальность работы определяется и стремительным развитием теоретической иммунологии, в результате которого интерпретация множества полученных до 1992 г. результатов (а их большинство в литературе по СРБ и САР) перестала соответствовать современному состоянию иммунологической теории. Поэтому любая попытка пересмотра и обобщения данных прошлых лет актуальна и важна для дальнейшего прогресса в этой области.
Цель исследования. Целью настоящего исследования явилось раскрытие иммунобиологической роли главных пентраксинов человека - С-реактивного белка и сывороточного амилоида Р - в неспецифических защитных реакциях и общей системе иммунорегуляции.
Задачи исследования.
-
сравнить характер эффектов СРБ и САР в отношении широкого круга функций лейкоцитов крови in vitro;
-
оценить возможность синтеза иммуномедиаторов лейкоцитами крови под влиянием пентраксинов;
3) изучить механизм митогенного эффекта СРБ в отношении
лимфоцитов периферической крови;
4) исследовать характер влияния пентраксинов на синтез антител и
переключение их классов in vivo и in vitro;
5) изучить индукцию синтеза СРБ в гепатоцитах in vitro самим СРБ и его
тафтсиноподобными тетрапептидами;
6) определить значение пентраксинов для адгезии, пролиферации и
изменения морфологии фибробластов.
Научная новизна. Основными результатами проведенной работы являются доказательство центральной роли СРБ и САР в кооперации неспецифических и иммунных механизмов на разных этапах защитной реакции и расшифровка роли пентраксинов в общей системе иммунорегуляции и сетевых иммуномедиаторных взаимодействиях.
В ходе работы впервые проведена оценка взаимодействия СРБ и САР с базофильными и эозинофильными гранулоцитами периферической крови. Установлено, что эти белки замедляют дегрануляцию базофилов и, напротив, усиливают секрецию гранул эозинофилов.
Ряд новых эффектов СРБ и САР установлен при изучении их взаимодействия с нейтрофильными гранулоцитами. Впервые показано разнонаправленное действие пентраксинов на адгезию нейтрофилов, когда
СРБ усиливает адгезивность нейтрофилов к субстрату, а САР ингибирует ее. Эти данные, а также не описанные ранее в литературе хематтрактантные свойства СРБ и САР, подтвердили существование рецепторов для этих белков на мембранах нейтрофилов и впервые показали взаимосвязь между рецепторами для САР и адгезионными свойствами нейтрофилов. Также впервые было показано, что под действием СРБ усиливается секреторная дегрануляция нейтрофилов, об интенсивности которой судили по уровню лизосомально-катионного теста, при этом САР не обладает таким свойством. Впервые показан принципиальный факт модуляции уровня иммуномедиаторов в надосадках культур нейтрофилов под влиянием пентраксинов. Установлено, что оба белка повышают содержание IL-6, который в свою очередь индуцирует синтез этих белков в гепатоцитах, а также TNFa, что имеет важную роль в системе контроля и регуляции воспалительного процесса. Показано, что СРБ, но не САР, повышает уровень IL-ip в культурах нейтрофилов, о чем ранее также не упоминалось в литературе. Кроме того, впервые показано отсутствие влияния пентраксинов на уровень IFNa в культурах нейтрофилов.
Результаты изучения эффектов пентраксинов на функции
моноігуклеарньїх фагоцитов крови также принесли ряд новых результатов.
Подтверждена ассоциация рецепторов для СРБ с рецепторным комплексом
FcyRII и впервые показана ассоциация рецептора для САР с CRI рецептором.
Исследовано влияние пентраксинов на кислородный метаболизм
мононуклеарных фагоцитов. Полученные результаты подтвердили данные литературы по стимулирующему влиянию СРБ на спонтанный и индуцированный кислородный метаболизм этих клеток. Впервые показано отсутствие влияния САР на спонтанный и его ингибиция индуцированного кислородного взрыва моноцитов. В литературе ранее не содержалось сведений об индукции синтеза IL-6 в мононуклеарных фагоцитах под влиянием обоих пентраксинов.
Впервые доказана реализация митогенного эффекта СРБ в отношении лимфоцитов периферической крови через содержащие фосфорилхолин структуры мембраны или CD-25 антиген лимфоцитов. Также впервые установлен факт конкуренции пентамерного и мономерного СРБ с IL-2 за CD-25 антиген. В литературе ранее отсутствовали сведения о влиянии пентраксинов на синтез лимфоцитами IL-2, IL-4 и IFNa. Показано, что СРБ и САР ограничивают продукцию IL-2 и IFNa, а также продукцию IL-4 стимулированными митогеном клетками. Одновременно найдено, что СРБ усиливает продукцию IL-4 нестимулированными лимфоцитами, а САР не изменяет этот показатель. Также впервые показана возможность индукции іупрессорной активности под действием СРБ и ингибиция NK-клеточной активности под действием САР.
В рамках исследования впервые показана модуляция пролиферацк фибробластов со стороны обоих пентраксинов и тафтсиноподобных пептиде молекулы СРБ, а также влияние этих пептидов на адгезивные свойств фибробластов.
Впервые разработана модель культивирования гепатоцитов in vitro течение 3 и более суток, на которой подтверждены данные литературы возможности индукции синтеза СРБ самим СРБ и его тафтсиноподобным пептидами. Кроме того, в условиях культивирования in vitro подтвержден фак разнонаправленного влияния иммуномедиаторов и тафтсиноподобны пептидов на синтез СРБ, концентрация которого в сыворотке крови нарастае в острую фазу, и трансферрина, концентрация которого, напротив, снижаете при воспалении.
Теоретическая и практическая значимость работы. Работа носи' теоретический характер. Значение полученных данных состоит в раскрыта! роли С-реактивного белка и сывороточного амилоида Р в осуществленш кооперации механизмов специфической и неспецифической резистентности обосновании роли пентраксинов как группы противовоспалительных і иммуносупрессивных медиаторов. Проведенный анализ иммунобиологическю эффектов САР и его сравнение с эффектами СРБ позволили установить разнук роль этих пентраксинов в ходе защитной реакции. Результаты позволили внести важные дополнения в общую систему цитокиновой сети и регуляцию иммунного ответа, что теоретически обосновывает новый подход к оценке состояния иммунокомпетентных клеток и сывороточных уровней СРБ и САР при широком круге патологий соединительной ткани и амилоидозов различной локализации. В ходе работы разработаны новые модификации метода очистки сывороточного амилоида Р из сыворотки крови, позволяющие повысить выход белка и его чистоту. Предложена модель культивирования гепатоцитов in vitro, которая может найти широкое применение в экспериментальных и клинико-иммунологических исследованиях, а также при тестировании новых лекарственных препаратов.
Положения, выносимые на защиту.
1. СРБ и САР являются компонентами системы гуморальных
посредников между кровью и рыхлой соединительной тканью в осуществлении
защитных и репаративных процессов. Эти пентраксины модулируют функции
всех лейкоцитов крови и фибробластов рыхлой соединительной ткани.
2. На начальных этапах защитной реакции СРБ вызывает активацию и
мобилизацию клеточных факторов неспецифической защиты. Одновременно
СРБ осуществляет контроль остроты воспаления. САР также является
компонентом системы отрицательных обратных связей, обеспечивая
ограничение процесса воспаления и его контроль.
3. Пентраксины сдерживают развитие иммунного ответа, тормозя
переключение классов синтезируемых антител.
4. Тафтсиноподобные пептиды молекулы СРБ участвуют в регуляции
функций фибробластов и гепатоцитов. Эти пептиды модулируют синтез
острофазовых белков в печени.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы
доложены на 1 Всесоюзном иммунологическом съезде (Сочи-Дагомыс, 1989),
9 Международном симпозиуме по атеросклерозу (Иерусалим, 1991), 1 съезде
иммунологов России (Новосибирск, 1992), Международном симпозиуме по
аллергологии и клинической иммунологии (Алма-Ата, 1992), симпозиуме
"Пептидные биорегуляторы - цитомедины" (Санкт-Петербург, 1992),
конференции "Критерии и методы оценки жизнеспособности тканей в раневом
процессе" (Санкт-Петербург, 1993), симпозиуме "Нейроиммунология на
пороге XXI века" (Санкт-Петербург, 1993), 3-м Международном симпозиуме
"Иммунные последствия травмы, шока и сепсиса" (Мюнхен, 1994), на научной
конференции "Здоровье и болезни человека на пороге XXI века"
(Москва,1994), 2-й летней международной школе по иммунологии имени
Дж.Хамфри (Пущино, 1994), Всероссийском симпозиуме "Проблемы
иммунологии в оториноларингологии" (Санкт-Петербург,1994), конференции
"Кроветворение и физиологические функции иммунной системы организма"
(Санкт-Петербург, 1995), конференции молодых физиологов и биохимиков
России (Санкт-Петербург, 1995), 1(Х1) Международном совещании и школе по
эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 1996), 4-й международной
конференции "СПИД, рак и родственные проблемы" (Санкт-Петербург, 1996),
совещании по проблемам апоптоза (Москва, 1996), ХХХШ Международном
конгрессе по физиологическим наукам (Санкт-Петербург, 1997). Фрагменты
работы также докладывались на заседаниях городского общества
иммунологов (1988, 1989, 1995, 1997), конференциях профессорско-
преподавательского состава Санкт-Петербургского государственного
университета (1997) и Ветеринарной академии (1991, 1992), конференциях
молодых ученых и специалистов НИИЭМ РАМН.
Диссертационная работа апробирована на научной конференции отдела иммунологии НИИЭМ РАМН 19 сентября 1997 г.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 70 печатных работ, в том числе 3 обзора литературы, 32 статьи и 35 тезисов.
Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, 8 глав, в которых приведены данные литературы, сводка использованных материалов и методов и результаты собственных исследований, их обсуждения и выводов. Диссертация изложена на 280 страницах текста, включающего 76 рисунков и 39
таблиц. Библиографический указатель содержит 414 источников, из которых 74 принадлежит отечественным авторам и 340 -зарубежным.
