Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 5
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ 5
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ 7
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ 7
НАУЧНАЯ НОВИЗНА 8
НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ 9
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ 10
ПУБЛИКАЦИИ 10
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ 10
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11
ГЛАВА 1 Апоптоз его молекулярные механизмы
Введение 11
Роль каспаз в качестве исполнительного звена иммунитета 17
1.3. Механизмы запуска апоптоза 20
Запуск апоптоза через «рецепторы смерти» 20
Альтернативный путь запуска апоптоза 21
1.4. Внутриклеточная регуляция апоптоза 23
Белки семейства Вс1-2 и регуляция их функции 23
Белки-ингибиторы апоптоза и их блокатор 26
Белки теплового шока и их роль в модуляции апоптоза 27
Экстраклеточная регуляция апоптоза 29
Гибель и выживание Т-лимфоцитов 31
ГЛАВА 2 Факторы выживания Т-лпмфоцитов
Введение 33
Факторы выживания Т-лимфоцитов
Выживание покоящихся Т-лимфоцитов 38
Выживание активированных Т-лимфоцитов 42
Выживание регуляторных Т-лимфоцитов 45
Роль энергетического метаболизма в.выживании клеток 46
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 3. Материалы и методы исследования 50
СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
ГЛАВА 4 Влияние плотности культуры на выживание Т-
лимфоцитов 58
Выживание клеток цитотоксической линии CTLL-2 в культурах низкой плотности 59
Выживание клеток линии CTLL-2 после их культивирования в
культурах высокой плотности 62
4.2.1. Подбор экспериментальных условий 63
Определение характера гибели клеток CTLL-2 67
Оценка роли энергетического метаболизма в контроле
выживания клеток CTLL-2 72
ГЛАВА 5. Роль энергетического метаболизма Т-лимфоцитов в
механизме контроля их выживания аутокринными факторами
5.1. Влияние переноса клеток CTLL-2 из ВП-культур в свежую
среду на уровень внутриклеточного АТФ. . 74
Влияние холодовой инкубации клеток CTLL-2 на их выживание после переноса из ВП-культур в НП-культуры 76
Протективное действие кондиционированной среды на
уровень внутриклеточного АТФ и выживание клеток CTLL-2 79
5.4. Определение пути энергетического метаболизма, включенного
в механизм поддержания клеток CTLL-2 аутокринными факторами 81
Сравнительный анализ регуляции уровня АТФ в нормальных и трансформированных Т-клетках аутокринными факторами
Влияние дефицита аутокринных факторов на выживание
клеток CTLL-2 в условиях окислительного стресса 92
Роль аутокринных факторов в восстановлении энергетического метаболизма клеток CTLL-2 в условиях гипоксии 97
Влияние дефицита аутокринных факторов на протекание
апоптоза в клетках CTLL-2 - 99
ГЛАВА 6 Разделение аутокринных факторов клеток CTLL-2 и определение их физико-химических характеристик
Ультрафильтрация кондиционированной среды клеток линии CTLL-2 и определение активности фракций 104
Гель-фильтрация кондиционированной среды клеток линии CTLL-2 и тестирование активности полученных фракций 106
Получение физико-химических характеристик аутокринных
факторов клеток линии CTLL-2 109
ВЫВОДЫ 111
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 113
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ
Выживание клеток в многоклеточном организме находится под контролем множества цитокинов различной природы. Согласно концепции «социального» контроля выживания и гибели клеток М. Рэффа (Raff, 1992) все клетки многоклеточного организма для своего выживания постоянно нуждаются в поступлении сигналов от других клеток этого организма. В случае отсутствия таких сигналов клетка погибает, выбывая из клеточного сообщества. Такой контроль выживания клеток необходим для поддержания гомеостаза тканей, который достигается за счет баланса между скоростями клеточной пролиферации и клеточной гибели.
Как и другие клетки в многоклеточном организме, Т-лимфоциты зависят от специальных сигналов для своего выживания, причем для покоящихся и для активированных Т-клеток эти сигналы различны. Покоящиеся Т-клетки чувствительны к своему микроокружению и постоянно поддерживаются in vivo факторами выживания, такими, как IL-6 и IL-7. Когда покоящиеся Т-клетки встречаются с антигеном, они активируются и проходят несколько циклов деления, а на завершающей стадии ответа на антиген большинство Т-клеток, участвовавших в ответе, элиминируется путём апоптоза. Часть активированных Т-клеток гибнет из-за того, что они теряют восприимчивость к IL-6, фактору выживания, который поддерживает их покоящихся предшественников. Для выживания активированных Т-лимфоцитов необходимо присутствие таких лимфокинов, как IL-2, IL-4, IL-7 и IL-15. В результате взаимодействия этих лимфокинов с рецепторами на клеточной поверхности либо усиливается экспрессия и
функция антиапоптозных белков семейства Вс1-2, либо угнетается функция проапоптозных белков этого семейства.
Регуляция энергетического метаболизма является другим важным механизмом, с помощью которого цитокины и факторы роста осуществляют контроль выживания клеток. Цитокины и факторы роста стимулируют экспрессию транспортера глюкозы и его активность, вследствие чего поддерживается метаболизм клетки через усиление процесса гликолиза. Кроме того, цитокины контролируют работу таких ферментов гликолиза, как гексокиназа и фосфофруктокиназа-1. В лимфоцитах в отсутствие экзогенных факторов выживания происходит снижение внутриклеточного АТФ вследствие снижения транспорта глюкозы и активности ферментов гликолиза, что может приводить к апоптозу клеток, а в некоторых случаях к атрофии клеток и их гибели независимым от каспаз образом.
Наряду с данными об участии в контроле клеточного выживания паракринных факторов, т.е. факторов, * которые клетка получает от клеток других типов, имеются данные, указывающие на то, что контроль выживания клеток могут осуществлять также аутокринные факторы (АФ), т.е. факторы, продуцируемые клетками того же типа. Главной трудностью при изучении участия АФ в различных процессах, протекающих в клетках, является их постоянное присутствие в среде, окружающей клетки, вследствие чего, эффекты АФ могут проявляться в скрытом виде при любом исследовании физиологии клеток.
Т-лимфоциты, характеризующиеся интенсивным обновлением, постоянной миграцией и циркуляцией в организме, подвержены значительным метаболическим перестройкам и регулярным воздействиям изменяющихся условий микроокружения, в том числе и неблагоприятным для жизнедеятельности. Поэтому именно Т-лимфоциты являются тем типом клеток, для которых поддерживающее
влияние АФ должно быть наиболее выраженным. Анализ участия АФ в процессах выживания Т-клеток не ограничивает круг задач, связанных с исследованием роли АФ в физиологии Т-лимфоцитов. Поскольку есть основания полагать, что АФ способны осуществлять контроль энергетического метаболизма Т-клеток, то следует ожидать влияния АФ на функциональную активность Т-лимфоцитов.
Таким образом, накопленные в последнее время данные свидетельствуют, что контроль выживания и энергетического метаболизма клеток различными цитокинами и факторами роста играет ключевую роль в физиологии всей иммунной системы и Т-лимфоцитов в частности. Однако в настоящее время совершенно не изученным остается вопрос о контроле выживания и энергетического метаболизма активированных Т-лимфоцитов аутокринными факторами. Вследствие постоянного присутствия АФ в среде, окружающей клетки, актуальной является разработка экспериментального подхода, позволяющего минимизировать эффекты эндогенных АФ таким образом, чтобы стало возможным исследование АФ, добавляемых к клеткам извне.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ
Выяснение роли АФ в контроле выживания активированных Т-лимфоцитов и регуляции их энергетического метаболизма в физиологических условиях и в условиях клеточного стресса, анализ вовлеченности АФ в процесс программированной гибели Т-клеток.
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Охарактеризовать влияние плотности клеточной культуры, как параметра, который определяет содержание АФ в культуре, на выживание клеток интерлейкин-2 (ИЛ-2)-зависимой линии CTLL-2 в отсутствие сыворотки.
2. Разработать экспериментальную систему для тестирования
способности экзогенных АФ к поддержанию выживания клеток.
Проанализировать роль энергетического метаболизма в механизме контроля выживания клеток линии CTLL-2 и охарактеризовать его путь.
Провести сравнительный анализ активности АФ, осуществляющих регуляцию энергетического метаболизма нормальных и трансформированных Т-клеток.
Проанализировать роль АФ в поддержании выживания клеток линии CTLL-2 и в сохранении их энергетического метаболизма в условиях клеточного стресса.
Изучить влияние АФ на протекание апоптоза в клетках линии CTLL-2.
7. Провести анализ фрізико-химических характеристик АФ клеток
линии CTLL-2.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА
Роль аутокринных факторов (АФ) в физиологии иммунной системы и, в частности, в контроле выживания Т-лимфоцитов, совершенно не изучена. Поэтому все основные результаты данного исследования обладают высокой степенью научной новизны. Разработана оригинальная экспериментальная система для тестирования эффектов экзогенных АФ, в которой клетки сначала подвергали адаптации к высокому уровню АФ, а затем переносили в условия дефицита АФ. Исследована роль АФ в регуляции энергетического метаболизма нормальных активированных Т-лимфоцитов и клеток линий Т-ряда. Впервые показано, что в условиях дефицита АФ наблюдается временное нарушение гликолиза Т-лимфоцитов, которое сопровождается падением уровня АТФ в клетках
с последующим его восстановлением в течение нескольких часов.
Показано, что в условиях дефицита АФ клетки приобретают большую
чувствительность к клеточному стрессу (гипотермия, окислительный
стресс), что сопровождается значительным снижением клеточного
выживания и гибелью клеток преимущественно по пути некроза. Кроме
того, установлено, что при индукции апоптоза в клетках дефицит АФ
приводит к изменению в протекании апоптоза, завершение которого
прерывается наступлением вторичного некроза. Также
продемонстрировано восстанавливающее действие АФ на энергетический метаболизм Т-клеток в условиях гипоксии. Проведено разделение АФ методом гель-фильтрации и получены физико-химические характеристики отдельных молекул АФ.
НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ
Состояние энергетического метаболизма клеток иммунной системы определяет их функциональную активность и таким образом может быть определяющим в эффективности работы иммунной системы. Полученные в работе данные расширяют существующие представления о роли АФ в функционировании иммунной системы, особенно в вопросе контроля энергетического метаболизма Т-лимфоцитов. Наиболее важным с практической точки зрения является обнаруженный в работе эффект восстановления энергетического метаболизма Т-клеток в условиях гипоксии в присутствии избыточного количества АФ. Весьма существенными для практической значимости данной работы являются факты, свидетельствующие о роли дефицита АФ в механизме гибели клеток в условиях окислительного стресса и при индукции апоптоза. Значительный интерес для возможного практического применения имеет разделение аутокринных полипептидных факторов и получение их функциональных и физико-
химических характеристик. Частный интерес для практики культуральной работы представляют полученные в работе данные о стрессирующем действии кратковременной холодовой инкубации на клетки в условиях дефицита АФ.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ
Материалы диссертации представлены на 3-й, 5-ой, 6-ой, 8-ой и 11-ой научных конференциях с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 1999, 2001, 2002, 2004, 2007), на чтениях, посвященных памяти Ю.А. Овчинникова (Москва, 1998, 2004), на школе-конференции «Горизонты физико-химической биологии» (Пущино, 2000), на 5-ой и 8-ой международных иммунологических летних школах им. Дж. Хэмфри (Пущино, 2000, 2007), на 17-ой зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2005).
ПУБЛИКАЦИИ По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ.
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ
Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 142 страницах машинописного текста, содержит 25 рисунков, 2 таблицы. Список литературы включает 280 источников, из которых 274 иностранных.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава 1
АПОПТОЗ И ЕГО МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ
1.1. Введение
Исследователи в процессе изучения развития и функционирования многоклеточных организмов сталкивались не только с явлением роста и размножения их клеток, но и явлением их массовой гибели. Массовая гибель клеток происходит, например, в процессе метаморфоза некоторых животных, как беспозвоночных, так и позвоночных. Так, при взрослении головастика уничтожаются ткани его хвоста и жабр, органа боковой линии. Массовая гибель клеток такого рода получила название «программируемой клеточной гибели» (ПКГ). Понятие программированной клеточной гибели нашло применение и в иммунологии. Так например, по механизму ПКГ протекает гибель кортикальных тимоцитов во взрослом организме (Woronicz et al., 1994). Появление всё большего количества данных о гибели клеток не вследствие действия токсических веществ или других каких-либо неблагоприятных факторов, а вследствие активного процесса, вызванного физиологическими сигналами, передаваемыми с мембранных рецепторов в ядро, способствовало появлению новой теории о месте ПКГ в физиологии многоклеточных организмов (Wu et al, 1995; Kerr et al., 1972).
Механизм элиминации нежелательной клетки для многоклеточного организма имеет принципиальное значение. Он эволюционно консервативен и запускается в ответ на гомеостатические или морфогенетические сигналы и в клетках животных, и в клетках растений. (Potten, 1992; Bowen, 1993; Самуилов и др., 2000). Гибель клеток в организме может происходить по механизму некроза, апоптоза
или аутофагии. Некроз и апоптоз сильно различаются на последних стадиях процесса гибели. Для протекания некроза не требуется ни затрат энергии со стороны погибающей клетки, ни реализации какой-либо из её генетических программ. В процессе некроза клетка раздувается, в ядре хаотично конденсируется хроматин. Ядро разбухает, целостность ядерной мембраны нарушается. Митохондрии сильно увеличиваются в размерах, их мембраны повреждаются. Затем происходит разрушение органелл и внешней мембраны, ДНК неупорядоченно деградирует. На самом позднем этапе хроматин, протеолитические ферменты цитоплазмы и содержимое лизосом, вытекает наружу, в результате чего повреждаются соседние клетки, что приводит к воспалительным процессам в тканях, окружающих некротизированные клетки. Наконец, клетка исчезает, оставляя после себя лишь куски детрита, которые поглощаются макрофагами (Самуилов и др., 2000). Содержимое клетки, в случае некроза окрашивается суправитальными красителями и при электрофорезе ДНК на дорожке можно видеть не упорядоченную картину типа «лесенки», а размытое пятно (Burgoyne, 1999).
В естественных условиях гибель клеток по механизму некроза происходит при действии разрушительных для клеток факторов (отравление различными химическими агентами, недостаток питательных веществ, высокая температура и др.) и долгое время считалось, что некротическая гибель является следствием лишь патологических процессов. Однако, в последние годы появляется все больше данных, указывающих на то, что некроз может играть существенную роль при нормальной жизнедеятельности, например, при эмбриогенезе, оогенезе, клеточном обновлении (Barkla и Gibson, 1999; Chautan et al, 1999; Mayhew et al., 1999; Proskuryakov et al., 2003). Некротические программы могут быть запущены физиологическими
веществами при вполне физиологических концентрациях. Например, цитокины, синтезирующиеся при воспалении и инфекционных поражениях, способствуют некротической гибели Р-клеток поджелудочной железы (Saldeen, 2000; Laster и Mackenzie , 1996).
Другими физиологическими индукторами некротической гибели клеток являются некоторые липиды. Так, установлено, что церамиды вызывают некроз при добавлении к Т- и В- клеткам человека, макрофагам мыши, а сфингозин способен приводить к некрозу клеток линии НК-2, полученной из почек человека (Lakics, Vogel, 1998). В зависимости от вида воздействия или стресса в клетке включаются различные пути прохождения некротической программы. В случае воздействия TNF-a, TGF-P, нейротрофических факторов для запуска некроза необходимо присутствие их рецепторов на клеточной поверхности, экспрессия которых может происходить как конститутивно, так и вызываться паракринной и аутокринной индукцией (Ashkenazi, Dixit, 1999). Взаимодействие с рецепторами приводит к накоплению активных форм кислорода в митохондриях, падению уровня АТФ, вслед за которым происходит ядерная гомогенизация (Pavlovic et al., 2000; Vercammen et al., 1997; Faraco et al., 1999; Baker, Reddy, 1998; Boone et al., 2000; Проскуряков, 2002).
Такие белки, как БТШ70, БТІІІ90, БТШ10, калретикулин, выделяясь из некрозной клетки,' стимулируют активацию антигенпрезентирующих клеток (Basu, Srivastava , 2000), что способствует развитию Т-ответа. Предполагается, что эволюционно программа некротической гибели клетки могла возникнуть для быстрой мобилизации организма (активации дендритных клеток, моноцитов, нейтрофилов) в случае инфекции или травмы (Fiers et al., 1999; Melcher et al, 1999; Sauter et al., 2000).
Апоптоз в организме происходит либо в ответ на физиологический стимул, либо в ответ на слабый повреждающий фактор. Для реализации апоптоза существует генетический аппарат, ответственный за включение и функционирование биохимических механизмов деструкции клеток животных (Ellis, Horvitz, 1986). Однако для апоптоза не является обязательной генная экспрессия, апоптозная гибель может происходить и в цитопластах, вовсе не имеющих ядра (Jacobson, 1996; Nagata, Golstein, 1995). Причиной запуска апоптоза может быть наличие сигнала, воспринимаемого рецепторами клетки например, гибель тимоцитов под действием глюкортикоидов (Wu, 1996), а также активированных Т-лимфоцитов при связывании Fas-рецептора с Fas-лигандом, или, наоборот, отсутствие нужного сигнала (например, ростового фактора). Так, некоторые факторы, необходимые для пролиферации клетки, являются одновременно и факторами выживания (Ham, McKeehan, 1979) и при их недостатке клетки погибают вследствие запуска внутренней суицидальной программы.
В соответствии с концепцией «социального» контроля выживания и гибели клеток М. Рэффа они запрограммированы к самоубийству при длительном отсутствии сигнала от других клеток (Raff, 1992). Развивающимся нейронам, например, требуются нейтрофические факторы (Oppenheim, 1991), клетки миелоидного ряда нуждаются в колоние-стимулирующих факторах (Williams, 1990; Кошу, Bondurant, 1990), развивающиеся олигодендроциты и их предшественники также нуждаются в специфических ростовых факторах и цитокинах (Barres et al, 1992). В случае недостатка факторов выживания эти клетки погибают по механизму ПКГ (Searle, 1982).
Морфологически процесс апоптоза выглядит следующим образом: сначала клетки уменьшаются в размерах, хроматин
уплотняется и фрагментируется. Затем в ядерной оболочке происходят инвагинации, и хроматиновые фрагменты отделяются от ядра (они называются апоптотическими тельцами). В цитоплазме конденсируются и сморщиваются гранулы, которые, однако, не разрушаются, плазматическая мембрана теряет свою нормальную складчатость и клетка отделяется от субстрата. Лизис клетки происходит приблизительно через 12 часов после начала развития апоптоза (Duvall et al., 1985; Wyllie, 1987). Еще одним механизмом ПКГ в организме, отличным от апоптоза, является аутофагия, исследование которой наиболее интенсивно развернулось в последние годы. Аутофагией называют регулируемый механизм лизосомной деградации долгоживущих белков, клеточных органелл и самих клеток (Klionsky, Emr, 2000).
Запуск механизма аутофагии происходит в целом ряде случаев:
-в филогенезе при удалении большого количества клеток (метаморфоз у насекомых, инволюция гланд (Levine, Yuan, 2006));
-удаление гормонов от гормонзависимых тканей (инволюция простаты при кастрации, при антиэстрагеновой терапии у клеток карциномы молочной железы (Bursch et al., 1996));
-удаление ростовых факторов (у симпатических нейронов при лишении их фактора роста нервов (Xue et al., 1999));
-удаление сыворотки (у клеток линии PCI2 и гранулярных клеток мозга (Canu et al., 2005; Uchiyama, 2001));
-добавление TNF-a к Т-лимфобластам лейкемии человека (Ла et al., 1997);
-голодание — в большинстве случаев (Levine, 2006);
-другие причины (содержание кислорода в среде, температура, клеточная плотность (Lum et al., 2005)).
Когда механизм аутофагии запущен, предсуществующая в клетке преаутофагосома начинает окружать цитоплазматический материал и органеллы (эндоплазматический ретикулум, митохондрии, рибосомы), образуя изолирующую мембрану. Получившаяся аутофагосома сливается с лизосомои. Возникает аутолизосома, в которой происходит деградация содержимого до аминокислот и жирных кислот, которые могут быть использованы для синтеза новых белков и АТФ и последующего выживания клетки, либо деградация содержимого происходит до полной клеточной элиминации (Levlne, 2006). В отличие от апоптоза при аутофагии происходит ранняя деградация оргапелл, а цитоскелет сохраняется до последней стадии. Активация каспаз (Lockshin, Zakeri, 2004) и деградация ДНК (Schweichel, Merker, 1973) тоже происходят на самых последних стадиях.
Аутофагия - один из механизмов ПКГ в многоклеточном организме, в то же время она является древним механизмом выживания, который особенно важен при голодании. Так, одноклеточные эукариоты с мутациями в генах, ответственных за аутофагию, вполне жизнеспособны в нормальных условиях, но быстро, гораздо быстрее, чем дикие формы, погибают при дефиците питательных веществ (Tsukada, Ohsumi, 1993; Otto, et al. 2004; Otto et al., 2003). Мыши с мутациями в таких генах погибают во время неонатального периода, когда прекращается поступление плацентарной крови. При этом у них уменьшается содержание аминокислот и падает продукция АТФ в клетках сердца, что вызывает гибель миокарда (Kuma et al., 2004). Запуск механизма аутофагии может способствовать клеточному выживанию при удалении ростовых факторов. В результате удаления 1L-3 от клеток отмечалось уменьшение экспрессии транспортеров питательных веществ и общий дефицит питательных веществ внутри клетки (Kuma et al., 2004). Обычно клетки, лишенные
ростовых факторов, очень быстро погибают при апоптозе. Но клетки с дефицитом по генам Вах и Вак выживали при удалении от них IL-3, как показано, за счет запуска механизма аутофагии и поддержания их энергетического статуса (Lum et al., 2005). Уменьшение экспрессии Bcl-2 активизирует аутофагию (Saeki et al., 2000). Сверхэкспрессия Bcl-2 в условиях удаления ростовых факторов, сыворотки и ионов кальция подавляет прохождение и аутофагии, и апоптоза.
1.2. Роль каспаз в качестве исполнительного звена апоптоза
Множество морфологических изменений, наблюдаемых в апоптозных клетках, происходит благодаря действию специфических, активирующихся при апоптозе протеинов - каспаз (Leist, Jaattela, 2001; Hengartner, 2000). Ингибирование действия каспаз с помощью фармакологических препаратов или мутации способны замедлить или даже предотвратить апоптоз ( Green, Вееге, 2000).
Каспазы - высоко консервативные белки, гомологичные друг другу, и практически не различаются у самых разных организмов (человека, насекомых, червей и др.) (Leist, Jaattela, 2001; Hengartner, 2000). У человека найдено около дюжины каспаз, причем установлено, что около двух третей из них участвуют в процессе апоптоза (Guimaraes, Linden, 2000). Каспазы подразделяются на подсемейства по предпочтительным для них субстратам, степени идентичности последовательностей и структур. Выделяют следующие подсемейства:
-инициаторов апоптоза: каспазы -1, -2, -4, -8, -9, -10,
-исполнителей апоптоза: каспазы -3, -6, и -7,
-процессоров цитокинов: каспазы -1, -4, -5, -11, -12, -13 и -14.
Все каспазы имеют аминокислоту цистеин в своём активном центре и расщепляют белки-мишени по аспарагиновому остатку. Каспазы-инициаторы предсуществуют в виде предшественников,
которые разрезаются по аспарагиновому остатку другими каспазами и
тем самым активируются, другими словами, происходит
индуцированный олигомеризацией аутопроцессинг (Butt et al. ,1998; Li
et al.,1997; Martin et al., 1998; Srinivasula et al., 1998; Yang et al., 1998).
Каспазы-исполнители активируются другими протеазами:
инициаторными каспазами и гранзимом В (Green, Amarante-Mendes, 1998; Stroh et al., 1998; Wolf, Green, 1999). Таким образом, при апоптозе возникает самоусиливающийся каскад, где каспазы активируют друг друга в определённой последовательности.
Каспазы работают с определённым набором белков, разрезая их по специфической последовательности, расположенной после аспарагина, в результате чего некоторые белки становятся неактивными, а другие белки напротив — активируются в случае инактивации или отрезания регуляторного домена. Многие субстраты каспаз идентифицированы (Nicholson, 1999).
Одним из таких субстратов является нуклеаза (caspase-activated nuclease, пли CAD), которая разрезает геномную ДНК по межнуклеосомным участкам, в результате чего возникают фрагменты, кратные 180 парам оснований. При электрофорезе такой ДНК её фрагменты составляют своеобразную "лесенку", которая является маркёром апоптоза. Нуклеаза CAD пребывает в живых клетках в виде неактивного комплекса со своей ингнбирующей субъединицей (ICAD). Каспаза отсекает эту субъединицу, в результате чего происходит высвобождение и активация каталитического центра (Grutter, 2000). Другими известными субстратами каспаз являются белки ядерной оболочки (Yang, 1998), а также белки цитоскелета - фодрин и гелсолин (Wolf, Green, 1999). Расщепление этих белков приводит к разрушению ядерной мембраны, изменению формы умирающей клетки, потере контактов с соседними клетками.
Как и большинство протеаз, каспазы синтезируются в виде
неактивных зимогенов, состоящих из трёх доменов: N-концевого
продомена и доменов р20 и рЮ. Во всех случаях, изученных до сих
пор, зрелый фермент представляет собой гетеротетрамер, включающий
два гетеродимера р20/р10 и имеющий два активных центра (Earnshaw
et al., 1999). Большинство каспаз активируется в результате разрезания
зимогена между доменами р20 и рЮ, а также между продоменом и
доменом р20. Места разрезания представляют собой аспарагин,
связанный со специфической для каждой каспазы
последовательностью. Это позволяет каспазам активировать друг друга и образовывать самоусиливающиеся каскады (Raff, 1998). Такие каскады используются для запуска коротких прокаспаз-3, -6 и -7. Эти исполнительные каспазы являются своеобразными «рабочими лошадками» семейства каспаз, поэтому по сравнению с другими каспазами они присутствуют в клетке в изобилии (Hengartner, 2000).
Другой механизм используется для активации прокаспазы-8. Этот механизм реализуется при запуске апоптоза через «рецепторы смерти», такие как Fas-рецептор (см. ниже). Для него характерно то, что в результате процессов, протекающих при его реализации, создаются условия, при которых молекулы прокаспазы приводятся в положение непосредственной близости, и низкой протеазной активности, присущей прокаспазе-8, оказывается достаточно для взаимного расщепления соседних молекул и их взаимной активации (Muzio, 1998; Yang et al, 1998; Salvesen , 1999).
Третий механизм реализуется при активации прокаспазы-9. Ключевым событием в активации прокаспазы-9 является ее ассоциация с двумя белками: кофактором Apaf-1 (apoptosis protease activating factor-1) и высвобождаемым из митохондрий цитохромом с (Li et al., 1997). Apaf-1, белок с молекулярной массой 130 кДа, играет роль арматуры,
на которой происходит автокаталитический процессинг каспазы-9 (Zhou et al., 1999; Adrain et al., 1999). Предполагается, что в результате зависимого от гидролиза АТФ конформационного изменения Apaf-1 приобретает способность связывать цитохром с. Связав цитохром с, Apaf-1 претерпевает дальнейшее конформационное изменение, способствующее его олигомеризации и открывающее доступ так называемого CARD-домена (caspase activation and recraiment domein) молекулы Apaf-1, с которым связывается прокаспаза-9. Так образуется конструкция, называемая апоптосомой, с молекулярной массой более 1,3 млн. Да. Пространственное сближение молекул прокаспазы-9 на мультимерной арматуре из комплексов Apaf-1-цитохром с, по-видимому, приводит к межмолекулярному протеолитическому процессингу прокаспазы-9 с образованием активной каспазы-9 (Zhou et al., 1999; Adrain et al., 1999, Stennicke et al., 1999).
1.3. Механизмы запуска апоптоза
1.3.1. Запуск апоптоза через «рецепторы смерти»
Сигнал апоптоза может приходить к клетке через «рецептор смерти». Рецепторы смерти- члены семейства белков, подобных рецептору к TNF-a. Все члены этого семейства содержат от одного до пяти богатых цистеином регионов в своей внеклеточной части. Цитоплазматическая часть этих молекул представляет собой домен, непосредственно связанный с проведением сигнала апоптоза. Для клеток иммунной системы таким рецептором является CD95 (Fas). Это гликопротеин 45-52кДа, широко представленный на поверхности клеток иммунной системы. Экспрессия CD95 стимулируется действием цитокинов INF-y и TNF-a и активацией лимфоцитов. Лигандом CD95 является CD95L (Fas-лиганд), TNF-подобная молекула,
распространенная меньше, чем CD95 (van Parijs et al., 1998; Hildeman et al., 2002).
В течение нескольких секунд после образования комплекса CD95-CD95L, CD95 олигомеризуется, составляя тример. К тримеру присоединяется комплекс белков, образуя DISC (death induced signal complex) - индуцирующий смерть сигнальный комплекс. Затем FADD (Fas-associated death-effector domain protein) присоединяет свой «домен смерти» к образовавшемуся «домену смерти» DISC. На комплексе FADD находится домен, обозначаемый DED (death-effector domain), содержащий прокаспазу-8. DISC взаимодействует с DED, расщепляет прокаспазу-8, тем самым, активируя её (Gupta et al, 2001). Активная каспаза-8 выходит в цитоплазму в виде гетеротетрамера, составленного двумя большими единицами и двумя малыми. Каспаза-8 расщепляет различные белки, в том числе и прокаспазу-3, которая образует самоусиливающийся каскад и завершает апоптоз. В числе прочих белков каспаза-8 разрезает проапоптотический белок Bid. С-концевой фрагмент этого белка (tBid) встраивается в митохондрию, где активирует Вах и другие ему подобные белки, способствующие выходу цитохрома с. Кроме того, tBid способен самостоятельно стимулировать выход цитохрома с. Оказавшись в цитозоле, цитохром с связывается с Apaf-1 и АТФ и активирует каспазу-9 (Bouillet et al., 1999; Newton, Strasser, 1998).
1.3.2. Альтернативный путь запуска апоптоза
При повреждении ДНК, при лишении клеток их ростовых факторов или факторов выживания, а также при других стрессовых воздействиях происходит апоптоз по второму, альтернативному пути. В механизме реализации этого пути активно участвуют митохондрии и белки семейства Вс1-2, подсемейства Вах, которые располагаются на
внешней мембране митохондрии или в цитозоле. Белки, члены подсемейства Bid, Bad, Bim, Harikari, Noxa в ответ на стрессовые внешние воздействия активируют белки подсемейства Вах (Newmeyer, Ferguson-Miller, 2003). Если апоптоз начинается из-за повреждения ДНК, белки подсемейства Вах активирует р53. Белки Вах олигомеризуются и встраиваются в мембрану митохондрии, где комплекс способствует выходу цитохрома с и других белков в цитозоль. На сегодняшний день нет единого мнения, чем обусловлен выход цитохрома с, существуют три гипотезы, объясняющие этот процесс (Hengartner, 2000).
Первая гипотеза предполагает, что белки Вах способствуют запиранию анионного канала VDAC (voltage-dependent anion channel), вследствие чего ухудшается обмен АТФ-АДФ и F]Fo- АТФ-азная активность ингибируется, а значит и уменьшается проход протонов через внутреннюю мембрану в матрикс. Трансмембранный потенциал митохондрий увеличивается и происходит осмотическое разбухание матрикса. Поскольку внешняя мембрана митохондрии значительно меньше внутренней, внешняя мембрана разрывается, и содержимое выходит в цитозоль, в том числе и цитохром с (Shimizu, 1999).
Вторая гипотеза подразумевает, что выход цитохрома с происходит через проницаемые транзиторные поры РТР (permeability transition роге), неспецифический канал, который образуется взаимосвязанным расположением трансмембранных молекул на внешней и внутренней мембранах митохондрий. Точный состав комплекса неизвестен, но предполагается, что он формируется из ANT (adenosine nucleotide transporter), VDAC и растворённого в матриксе белка циклофилина D. Кроме белков Вах открывание поры могут вызывать изменение концентрации Са~+, адениновых нуклеотидов,
->?
фосфатов, ионов пероксида, изменение рН или потенциала митоходрий (Loeffler, Kroemer, 2000).
Согласно третьей гипотезе поры для выхода цитохрома с образуются самими белками В ах, Вак и преобразованным из Bid белком tBid. В подтверждение этой гипотезы была продемонстрирована способность белков подсемейства В ах образовывать поры в липидных везикулах и липидных слоях (Zong et al., 2001, Kuwana et al., 2002).
Итак, тем или иным способом цитохром с выходит из митохондрии в цитозоль, и это событие является ключевым для апоптоза, поскольку, если инактивировать цитохром с в цитоплазме антителами, апоптоз останавливается. Высвобожденный цитохром с связывается с молекулами Apaf-І, находящимися в цитозоле, что приводит к началу олигомеризации Apaf-І, образованию апоптосомы и активации прокаспазы-9. Активная каспаза-9 активирует каспазу-3, которая и завершает процесс апоптоза (Newmeyer, Ferguson-Miller, 2003).
1.4. Внутриклеточная регуляция апоптоза
1.4.1. Белки семейства Вс1-2 и регуляция их функции
Семейство Вс1-2 представлено большим количеством белков (15 у млекопитающих), осуществляющих как проапоптозную, так и антиапоптозную функцию. Семейство' получило название от гена фолликулярной В-клеточной лимфомы (B-cell lymphoma). Продукт гена имеет массу 26кДа и располагается в основном на мембране митохондрий, реже — на плазматической мембране (Hockenbery et al., 1990, Adams, Kaelin, 1998, Antonsson, Martinou, 2000).
Внутри семейства выделяют три группы, объединенные по структурному сходству и функциям. Первая группа представлена
белками, ингибирующими апоптоз. Это Bcl-2, Bcl-X],, Bcl-w, А1 и Mcl-1. Все члены группы имеют четыре высококонсервативных домена (ВН1, ВН2, ВНЗ, ВН4), образованных а-спиралями, они имеют С-концевые гидрофобные хвосты, которые позволяют им находиться у внешней стороны мембраны митохондрии или эндоплазматического ретикулуума (Hengartner, 2000).
Среди клеток иммунной системы ген bcl-2 активно экспрессируется в юных кроветворных клетках, зрелых долгоживущих Т- и В- лимфоцитах, клетках памяти, но отсутствуют на лимфоцитах в процессе реаранжировки генов антигенраспознающих рецепторов, а также на эффекторных клетках (Perandones et al., 1993; Illera et al., 1993). Вне кроветворной и иммунной систем bcl-2 обнаруживается в быстро делящихся эпителиальных клетках, клетках секреторного эпителия, нейронах (Hockenbery et al., 1991).
Впервые защитный эффект bcl-2 был обнаружен при апоптозе клеток IL-3-зависимой пре-В-лимфоцитарной линии, наступающем в отсутствии IL-3 (Vaux et al., 1988). Гиперэкспрессия bcl-2 защищает клетки от апоптоза, связанного с активацией через TCR-CD3, с действием глюкокортикоидов, с дефицитом ростовых факторов. Защитное действие bcl-2 может не проявляться при Fas-зависимом апоптозе, цитолизе киллерными лимфоцитами, при отрицательной селекции клонов тимоцитов. Согласно одной из трактовок продукция bcl-2 обеспечивает выживание . активированных клеток, экспрессирующих ген с-тус, в отсутствие цитокинов, замещая их. Так, трансфекция гена bcl-2, приводящая к его повышенной экспрессии, вызывает у мышей волчаночный синдром с аутоиммунными проявлениями и способствует прогрессии опухолей, но не достаточна для их индукции (Korsmeyer, 1992; Strasser et al., 1991). У гибридов
мышей, трансгенных по bcl-2 и с-тус, развивается лейкоз, отсутствующий у каждого из родителей (Strasser et al., 1990).
Вторая группа семейства Вс1-2 - это белки Вах, Вок, и Вак. Они имеют структуру, сходную со структурой первой группы, в том числе и гидрофобные хвосты, но только с N-конца. У них отсутствует домен ВН4, вместо него находится большой район, состоящий из ос-спиралей, который, как полагают, совершает встраивание в мембрану. Все члены второй группы способствуют совершению апоптоза. (Hengartner, 2000).
К третьей группе принадлежат белки Bid, Вік, Bad, Bim, Harikari,
и Noxa (Hengartner, 2000). Эти белки содержат только ВНЗ домен,
гомологичный другим членам семейства Вс1-2. Некоторые из них
имеют гидрофобные концы (например Вік), другие, такие как Bid, их
не имеют. Обычно белки третьей группы выполняют функцию
поддержания апоптоза. Белки Bid, Bad и Bim находятся в цитозоле и
перемещаются в митохондрию во время апоптоза. Они выполняют
функцию проведения сигнала из цитозоля в митохондрию. Регуляция
их местонахождения определяется специфическими
посттрансляционными модификациями (например,
дефосфорилирование Bad или разрезание каспазой-8 белка Bid) (Guimaraes, Linden, 2004).
Члены семейства Bcl-2 способны образовывать гомо- и гетеродимеры. Антиапоптотические белки Bcl-2 гетеродимеризуются с проапоптотическими белками Вах, предотвращая их гомодимеризацию, необходимую для их проапоптозной деятельности. Баланс между гомо-и гетеродимерами определяет, по какому пути пойдет клетка - апоптоза или выживания (Hildeman et al., 2002). Факторы выживания и лиганды «рецепторов смерти» используют протеинкиназы и фосфатазы для изменения соотношения про- и антиапоптозных белков семейства Bcl-2 таким образом, чтобы привести клетку к апоптозу или способствовать
ее выживанию. Кроме членов семейства Вс1-2, способствующих апоптозу, Вс1-2 взаимодействует с другими проапоптозными белками: R-Ras, H-Ras, Raf каспазами и треонин-сериновой фосфатазой PPloc, модулируя их действие (Broker et al., 2005).
Активность белков семейства bcl-2 может регулировать повышение или уменьшение экспрессии гена, кодирующего сами эти белки или белки, их модифицирующие. Разрезание bcl-2 каспазами, инактивирует bcl-2-ингибиторную способность, тогда как разрезание каспазами белка bid, способствующего апоптозу, высвобождает фрагмент, который, в свою очередь, высвобождает цитохром с. Оба эти события усиливают процесс гибели (Luo et al., 1998; Li et al., 1998; Korsmeyer et al., 2000).
1.4.2. Белки-ингибиторы апоптоза и их блокатор
Работой каспаз - исполнителей апоптоза управляет семейство белков - ингибиторов апоптоза (IAP, inhibitor of apoptosis proteins). У человека их шесть: ХІАР, сІАРІ, СІАР2, NAIP, livin, and survivin. Один из этих белков XIAP (X-chromosome-linked inhibitor of apoptosis protein) связывает и ингибирует протеиназную активность каспазы-9. Он также может связывать и ингибировать каспазу-3. Эти функции выполняются BIR-доменом данного семейства (Martins, 2002; Van Loo et al., 2002). Другие ингибиторы апоптоза, сІАРІ и СІАР2, обеспечивают связь на путях прохождения клеточного цикла, и блокируют прохождение сигнала от «рецепторов смерти». Сверхэкспрессия этих белков наблюдается при злокачественной трансформации клеток иммунной системы: хронической миелоидной лейкимии, лимфоцитарной лейкимии, В-клеточной лимфомы (Grzybowska-Izydorczyk, Smolewski, 2008).
Белки- ингибиторы каспаз-исполнителей в свою очередь подвергаются регуляции со стороны молекулы Smac/DIABLO (second mitochondria derived activator of caspase) (Du et al., 2000). Эта регуляторная молекула высвобождается из митохондрий вместе с цитохромом с и способствует активации каспаз, стимулирует их взаимодействие с Apaf-І- апоптосомой и ингибирует XIAP. Например, когда активация каспазы-3 каспазой-8 блокирована белком IAP, Smac/DIABLO снимает этот блок и способствует созданию активной каспазы. Известно, что Smac/DIABLO связывает cIAP 1 и СІАР2, но пока не ясно, связано ли это с антиапоптозной активностью (Hengartner, 2000). Механизм выхода Smae/DIABLO из митохондрии отличается от такого у цитохрома с и способ регуляции его до конца не ясен. Выходу Smac/DIABLO способствует Bid-связывание. Белки Вс1-2 и Bcl-xL ингибируют выход Smac/DIABLO (Newmeyer, Ferguson-Miller, 2003, Guimaraes, Linden, 2004).
1.4.3. Белки теплового шока и их роль в модуляции апоптоза
Высококонсервативные белки теплового шока накапливаются в клетках, подвергнутых тепловому стрессу, радиации, ишемии, другим стрессирующим воздействиям. Легкие стрессы способствуют активации и транслокации в ядро одного или нескольких транскрипционных факторов белков теплового шока, начинается экспрессия белков теплового шока и клетка выживает (Santoro, 2000). Более сильные стрессы ведут к апоптозу, а совсем сильные - к некрозу (Jaattela, 199).
Белки теплового шока были открыты в 1962 году и выяснилось, что в клетке они играют роль молекулярных шаперонов для других клеточных белков. Выделяют четыре группы белков теплового шока: БТШ90, БТШ70, БТШ60 и БТШ низких молекулярных масс (в том
числе и БТШ27). Антиапоптозное действие оказывают БТШ70 и БТШ27 (Garrido et al., 2001). Белок БТШ27 синтезируют различные типы клеток и тканей на стадии развития и дифференцировки. Защитная роль БТШ27 выражается в том , что он стабилизирует окисленные белки, в том числе и актин. Как и Вс1-2, БТШ27 предотвращает активацию прокаспаз-9 и -3. БТШ27 взаимодействует с цитохромом с в цитоплазме и препятствует образованию апоптосом (Garrdo et al., 2000).
Группу БТШ70 составляют наиболее консервативные белки. БТШ75 конститутивно экспрессируются в митохондриях, GRP78 - в эндоплазматическом ретикулууме. БТШ70 действует как АТФ-зависимый молекулярный шаперон, стабрілизирующий вновь синтезируемые белки и способствующий трансмембранному транспорту протеиновых комплексов (Beckmann et al., 1990, Shi, Thomas, 1992). Белок БТШ70 способствует выживанию клеток при различных стрессирующих факторах: трансфекции AIF (apoptosis inducing factor) , удалении сыворотки, теплового шока, воздействии этопозидом (ингибитор топоизомеразы II, который повреждает ДНК и блокирует митоз) и др. Показано, что БТШ70 способствует выживанию клеток в условиях энергетического голодания (Wrong et. al, 1998). Повышенный уровень БТШ70 уменьшает или блокирует активацию каспаз: было показано, что он напрямую связывается с молекулой Apaf-І, препятствуя её превращению в апоптосому и активации прокаспазы -9 (Saleh 2000; Beere et al., 2000; Mosser et al., 2000). Для совершения этой функции очень важен АТФ-азный домен БТШ70 (Saleh et al., 2000). БТШ70 останавливает повреждение митохондрий и фрагментацию ядра. Это связано с его взаимодействием с AIF, которое препятствует индукции конденсации хроматина (Buzzard et al., 1998). Белок БТШ70 воздействует на ранние стадии апоптоза, предотвращая
активацию JNK-киназ (Gabai et al., 1998). Он также спасает клетки от гибели на самых поздних стадиях апоптоза, когда другие белки уже недейственны (Jaattela, 1998). Белок БТШ70, взаимодействуя со своим кошапероном Bad-І, активирует Вс1-2 и Raf-І, в свою очередь способствующих выживанию клеток (Song et al., 2001).
Белок БТШ90 тоже оказывает влияние на выживание клеток. Замечено, что БТШ90 взаимодействует с фосфорилированной серин-треонин киназой АКТ/РКВ, проводящей сигнал к выживанию от различных факторов роста. БТШ90 защищает АКТ от фосфатазы 2А, предотвращая тем самым ее инактивацию (Sato et al., 2000).
1.5. Экстра клеточная регуляция апоптоза
«Сигналы смерти» у многоклеточных, посылаемые одним клеткам, подвергаются регуляции со стороны других клеток, которые могут как усиливать их, так и супрессировать. Эти клеточные взаимодействия - часть комплексного социального контроля, который управляет индивидуальным поведением клетки для блага всего организма. Таким образом, клетки выживают, когда в них есть потребность, и убивают себя, когда не нужны организму. Например, хвост головастика исчезает при метаморфозе и происходит это из-за присутствия тироидного гормона в крови.
В других случаях смерть клетки происходит потому, что не приходят сигналы от других клеток, супрессирующие апоптоз. Такие молекулы называют факторами выживания. Если клетки изолировать от их соседей и не снабдить факторами выживания, клетки погибают. В естественных условиях (в организме) они остаются живыми только потому, что постоянно получают факторы выживания от других клеток. Этот порядок способствует тому, что клетка выживает только там, где это необходимо, и тогда, когда необходимо. Так, во время
развития позвоночных нервных клеток продуцируется намного больше, чем необходимо, однако, клетки- партнеры продуцируют ограниченное количество факторов выживания, и только некоторые нервные клетки могут потребить их в достаточном для выживания количестве. Не получившие нужного количества факторов выживания нервные клетки проходят апоптоз. Таким образом, число нервных клеток автоматически приводится в соответствие к числу клеток- партнеров.
Факторы выживания связываются со своими рецепторами на поверхности клеток-мишеней. В ряде случаев это активирует продукцию антиапоптозных белков (например, Вс1-2 и Bcl-Х). В других случаях это блокирует работу проапоптозных белков, например Bad, путём активации протеиновых киназ, 'которые фосфорилируют эти белки. Так, нефосфорилированный белок Bad ингибирует и связывает супрессирующие апоптоз белки Вс1-2 и Bcl-Х , но будучи фосфорилирован, он выпускает их и они могут остановить прохождение апоптоза (Zha et al., 1996.). Однако в большинстве случаев механизмы действия факторов выживания еще не выяснены.
Еще одну группу молекул, осуществляющих экстраклеточную регуляцию апоптоза, образуют галектины. Галектины-семейство гликопротеинов, связывающих р-галактозиды на поверхности клеток (Barondes et al., 1994). Одни галектины имеют один карбогидрат-связывающий домен и функционируют как мономеры. Это галектин -5, -7, и -10 (Camby et al., 2006). Другие представляют собой гомодимеры (галектины -1,-2,-11,-13,-14,-15) и олигомеры (галектин -3) (Camby et al., 2006). Галектины-4, -6, -8, -9 и -12 имеют два карбогидратсвязывающих домена, связанных между собой коротким пептидом (Camby et al., 2006).
Большинство галектинов, связываясь с поверхностными рецепторами клеток, вызывают их смерть по механизму апоптоза:
происходит деполяризация мембранного потенциала митохондрий, выход цитохрома с и et. аі.активация каспаз (Hsu et al., 2006; Matarrese et al., 2005; Ion et al., 2005; Hahn et al, 2004). Установлено, что галектины вызывают апоптоз у активированных Т-клеток (Perillo et al., 1995; Не, Baum, 2004).
Клеточные рецепторы, связывание галектинов с которыми запускает апоптоз, очень разнообразны. Так, апоптоз клеток линии Jurkat индуцирует связывание галектина-1 с CD2/CD3 (Расе et al., 1999), а гибель Т-клеток вызывает связывание галектина 3 с CD7. Причем клетки Т-клеточной лимфомы, у которых на поверхности отсутствовали рецепторы CD7, были резистентны к апоптозу, запускаемому этим галектином (Perillo et al., 1995). Связывание галектина-1 с рецепторами CD43, CD45 также приводит к апоптозу активированных Т-клеток (Symons et al., 2000). Эпителиальные клетки тимуса синтезируют галектин-1, который приводит незрелые кортикальные тимоциты к апоптозу, что, видимо, играет роль в негативной селекции тимоцитов (Camby et al., 2006).
1.6. Гибель и выживание Т-лимфоцитов
Апоптоз играет значительную роль в формировании репертуара и в регуляции размеров пула зрелых лимфоцитов. Элиминируются как аутореактивные Т-клетки, так и клетки, слабо взаимодействующие со своим антигеном. В периферических лимфоидных органах на завершающей стадии ответа на антиген большинство Т-клеток, участвовавших в ответе, элиминируются путём апоптоза.
Наиболее известными регуляторами апоптоза Т-клеток являются белки семейств Fas(CD95) и bcl. При этом Fas- и FasL- опосредованные механизмы участвуют в удалении зрелых аутореактивных Т-лимфоцитов, а Bel-белки способствуют выживанию Т-клеток при
взаимодействии с факторами роста и различными активирующими стимулами. Эти положения были подтверждены экспериментами Van Parijs с соавторами (1998). Как выяснилось, дефектные по Fas Т-клетки не погибают при активации, а Т-клетки, избыточно экспрессирующие Вс1-2, не погибают при удалении от них ростовых факторов. Мыши с чрезмерной экспрессией Вс1-2 при отсутствии антигена накапливают большое количество Т-лимфоцитов в тимусе и лимфоидных тканях, но при появлении антигена большинство' этих клеток элиминируется. Напротив, у мышей с Fas-дефектом при отсутствии антигена не наблюдалось увеличения числа зрелых Т-клеток, но с появлением в организме антигена количество Т-клеток значительно увеличивалось, более того, происходило накопление аутореактивных Т-клеток в периферийных лимфоидных тканях. Таким образом, как Всі, так и Fas поддерживают гомеостаз в лимфоидной системе. Вместе с тем, тимоциты, как сверхэкспрессирующие Вс1-2, так и тимоциты с недостаточной экспрессией Fas при взаимодействии с аутоанти геном погибали, показывая, таким образом, что Fas и Вс1-2 не являются необходимыми для негативной селекции тимоцитов. Таким образом, пока не найден путь передачи сигнала к апоптозу с аутореактивного
антигенного рецептора, но известно, что очень сильное связывание с
«
лигандом антигенного рецептора тимоцитов приводит к транскрипции Віт, а негетивная селекция тимоцитов прекращается при активации РІЗК-киназного пути одним из способов (Suzuki, Nakano, 2001).
Другим агентом, способствующим гибели Т-клеток, является TNF-a, фактор некроза опухоли. Показано, что гибель активированных клеток и гибридом in vitro в гораздо большей степени происходит через TNF-a-рецепторы, чем через Fas-рецепторы (Lenardo et al., 1999). TGF-(3 тоже способствует гибели Т лимфоцитов (Bright et al., 1997), но тем не менее делает их более резистентными к Fas-зависимому апоптозу:
клетки с дефицитом по TGF-[3 в меньшей степени накапливают FLIP (FLICE inhibitory protein) - антиапоптозный протеин, инертный гомолог каспазы-8 (Schlapbach et al., 2000).
Установлено, что в результате действия соответствующих лигандов (TNF-a, TGF-J3, FasL) на «рецепторы смерти» большинство активированных Т-клеток погибает от проапоптозной активности ВІт, который нуждается в Вах и Вак для проведения апоптоза в Т клетках (Plas, Thompson, 2002; Plas et al., 2002).
