Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5
ВВЕДЕНИЕ 8
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ : 13
1.1. РСВ и вирус-индуцированная бронхиальная астма 13
Респираторные вирусные инфекции и бронхиальная астма 13
Противовирусный иммунитет у человека 15
Механизмы ухода вирусов от иммунологического контроля 18
Клиническая значимость РСВ-инфекции 19
Особенности восприимчивости макроорганизма к РСВ-инфекции....21
Связь РСВ-инфекции с бронхиальной астмой. Роль баланса между ТЫ и Th2 типами иммунного ответа 24
1.2. Интерференция РНК 28
История открытия 28
Механизм интерференции РНК 31
1.3. Проблема терапии и профилактики РСВ-инфекции и перспективы
использования механизма интерференции РНК 37
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 39
2.1. Материалы 39
Культуральный штамм вируса и клеточная линия 39
Экспериментальные животные 39
Основные реактивы, использованные в работе 40
2.1.4. Программное обеспечение и аппаратное оборудование,
использованное в работе 41
2.2. Методы 41
Культивирование клеток и вируса 41
Трансфекция клеток МА104 siRNA и заражение респираторно-синцитиальным вирусом 42
Контроль трансфекции siRNA 43
Титрование вируса в культуральной жидкости по ЦПД определением конечной точки 44
Определение количества вирусной РНК в культуральной жидкости методом обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени с использованием интеркалирующего красителя SYBR Green-1 44
Концентрирование вируса преципитацией полиэтиленгликолем 45
Экспериментальная модель инфекции РСВ на мышах 46
Титрование вируса в смывах из легких мышей 47
Определение количества вирусной РНК в гомогенатах легких мышей методом ОТ и ПЦР-РВ с использованием флуоресцентно-меченного зонда TaqMan Assay 48
2.2.10. Статистический анализ 51
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 52
Изучение генома РСВ 52
Дизайн siRNA против мРНК белка Р РСВ 55
3.3. Оценка антивирусной активности siRNA против мРНК белка Р РСВ в
культуре клеток 59
Микроскопическая оценка состояния зараженных вирусом клеток, обработанных специфическими и неспецифическими siRNA 59
Оценка противовирусной активности siRNA методом титрования 64
Оценка противовирусной активности siRNA путем определения в культуральнои жидкости количества вирусной РНК методом ПЦР в реальном времени 68
3.4. Оценка антивирусной активности siRNA против мРНК белка Р РСВ в
экспериментальной модели инфекции на мышах 73
Титрование вируса в бронхоальвеолярных смывах их легких мышей и патологоанатомическая оценка состояния легких 73
Определение количества вирусной РНК в гомогенатах легких методом ПЦР в реальном времени 76
3.5. Выявление наиболее эффективных siRNA против мРНК белка Р РСВ ....78
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 80
ВЫВОДЫ 92
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 94
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
РСВ - респираторный синцитиальный вирус
PC-вирусный - прил., связанный с РСВ
РНК - рибонуклеиновая кислота
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
А — аденозиновое нуклеиновое основание
G — гуанозиновое нуклеиновое основание
С - цитозиновое нуклеиновое основание
Т - тимидиновое нуклеиновое основание
U - урациловое нуклеиновое основание
dA - дезоксиаденозиновое нуклеиновое основание
dG - дезоксигуанозиновое нуклеиновое основание
dC - дезоксицитозиновое нуклеиновое основание
dT - дезокситимидиновое нуклеиновое основание
R - пуриновое нуклеиновое основание
Y - пиримидиновое нуклеиновое основание
N - любое нуклеиновое основание
мРНК - матричная РНК
siRNA - малая интерферирующая РНК (от small interfering RiboNucleic Acid)
dsRNA - двухцепочечная РНК (от double-stranded RNA)
RISC - саиленсирующий комплекс, индуцируемый интерференцией РНК (от
RNA-induced silencing complex)
PKR - протеинкиназа
ПЦР - полимеразная цепная реакция ОТ - обратная транскрипция ПЦР-РВ - ПЦР в реальном времени кДНК - кодирующая дезоксирибонуклеиновая кислота дНТФ - дезоксинуклеозидтрифосфат ЦПД - цитопатическое действие ТЦД50 - 50% тканевая цитопатическая доза вируса ОРВИ - острая респираторная вирусная инфекция NK-клетки - натуральные киллеры IFN - интерферон
IRF — фактор регуляции активности интерферона TLR - Toll-подобный рецептор CD - кластер дифференцировки Ig - иммуноглобулин
МНС - главный комплекс гистосовместимости (от Major Histocompatibility Complex)
SP - сурфактантный протеин Th - Т-хелпер ТЫ -Т-хелпер 1-ого типа Th2 - Т-хелпер 2-ого типа IL - интерлейкин ЛПС - липополисахарид
GFP - зеленый флюоресцирующий протеин (от Green Fluorescent Protein)
МІР - макрофагальный воспалительный белок (от Macrophage Inflammatory
Protein)
RANTES - хемокин, экспрессируемый и секретируемый нормальными Т-
клетками и регулируемый процессами активации (от - Regulated on Activation,
Normal T-cell Expressed and Secreted Chemokine)
Tel - цитотоксическая клетка 1-ого типа
Tc2 - цитотоксическая клетка 2-ого типа
MEM - среда Игла (от Minimal Essential Medium)
DMEM - среда Игла в модификации Дальбекко (от Dulbecco's Modification of
Minimal Essential Medium)
ПЭГ - полиэтиленгликоль
RdRP - РНК-зависимая РНК-полимераза (от RNA-dependent RNA polymerase)
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Респираторно-синцитиальный вирус является одним из главных этиологических факторов вирус-индуцированной бронхиальной астмы [10,86]. Доказано, что перенесенная в детском возрасте РСВ-инфекция, приводит к развитию гиперчувствительности дыхательных путей у детей и к развитию бронхиальной астмы в дальнейшей жизни [108]. РСВ-инфекция - одна из главных причин тяжелых заболеваний верхних и нижних дыхательных путей у новорожденных и детей раннего возраста. Инфекция РСВ у новорожденных сопряжена с высокой смертностью, что отчасти связано с недостатком эффективных лекарственных средств. Ежегодно в мире в результате заболеваний нижних дыхательных путей, связанных с РСВ, умирает несколько миллионов детей младше 5 лет. РСВ вызывает инфекцию нижних дыхательных путей в примерно 40% случаев первичного инфицирования [149]. Показано, что РСВ является основной причиной заболеваемости и смертности у пожилых людей, взрослых и детей с ослабленным иммунитетом [47,49].
Хорошо известно, что вирусные инфекции являются важными факторами возникновения дыхательной обструкции у больных бронхиальной астмой. Это в первую очередь связано с колонизацией вирусами эпителия дыхательных путей, клетки которого продуцируют большое количество провоспалительных цитокинов и медиаторов, усиливающих воспалительный процесс [56]. Установлено, что у больных атопической бронхиальной астмой респираторная
вирусная инфекция усиливает гиперреактивность бронхов [42,46]. По различным данным от 60% до 85% обострений бронхиальной астмы у детей и до 50% обострений бронхиальной астмы у взрослых связаны с респираторными вирусами [58,86,118]. В связи с этим появилось основание для характеристики обострений бронхиальной астмы, ассоциированных с ОРВИ, термином вирус-индуцированная бронхиальная астма.
Подходы к терапии вирус-индуцированных обострений заболеваний респираторного тракта недостаточно эффективны [24,149]. На сегодняшний день не существует эффективной вакцины против РСВ. В клинической практике для лечения РСВ-инфекции, в том числе тяжелых состояний, таких как бронхиолит и пневмония, обычно используется только симптоматическая терапия. Эффективность рибавирина по результатам последних исследований поставлена под сомнение. Противовирусные средства на основе моноклональных антител обладают очень высокой стоимостью и не доступны для повсеместного клинического применения. Таким образом, во всем мире существует острая потребность в создании нового эффективного средства против респираторно-синцитиальной вирусной инфекции.
В 2006 году лауреатами Нобелевской премии в области физиологии и медицины за открытие интерференции РНК стали американские ученые Эндрю Файр и Крег Мелло [52,53,111]. Интерференция РНК - это РНК-зависимый механизм регуляции экспрессии генов, в котором двухцепочечная рибонуклеиновая кислота ингибирует экспрессию генов с комплементарной нуклеотидной последовательностью. Среди прочих важных функций этот
механизм позволяет клетке защищаться от чужеродного генетического материала, прежде всего от вирусов. При попадании в клетку двухцепочечной РНК она разрезается РНКазаШ-подобным ферментом, который называется Dicer, на короткие двухцепочечные РНК длиной 21-23 пары нуклеотидов - siRNA (от англ. small interfering RNA) [20,163]. Эти siRNA включаются в состав сложного эффекторного белкового комплекса RISC (RNAi-induced silencing complex), обнаруживающего и разрушающую мРНК-мишень, соответствующую данной siRNA [106]. Это значит, что введение в клетку siRNA против конкретной мРНК-мишени приводит к сайленсингу соответствующего белка, в том числе и вирусного белка. В связи с этим, возможность разработки нового антивирусного средства специфического действия против РСВ на основе механизма интерференции РНК является весьма перспективной.
Цель работы: разработка подхода, основанного на использовании
механизма интерференции РНК, для подавления репликации РСВ - основного
этиологического фактора возникновения бронхиолита у детей, а также
причинозначимого фактора, предраспологающего к развитию
бронхообструктивного синдрома и бронхиальной астмы, и одной из основных причин вирус-индуцированных обострений бронхиальной астмы у детей и взрослых.
Задачи:
Проанализировать геном РСВ.
Произвести дизайн siRNA против мРНК кандидатного белка-мишени РСВ.
Оценить антивирусную активность siRNA против мРНК белка-мишени РСВ in vitro в культуре клеток.
Оценить антивирусную активность siRNA против мРНК белка-мишени РСВ in vivo на мышах.
5. Выявить наиболее эффективные siRNA против мРНК белка-мишени РСВ.
Научная новизна.
Впервые в Российской Федерации экспериментально изучена возможность использования средств на основе siRNA против вирусов на клеточной модели и на экспериментальных животных.
Проведен дизайн siRNA против мРНК белка Р РСВ, спроектированы 6 уникальных экспериментальных образцов siRNA, получивших рабочие названия siOl, si03, si05, si07, si09 и sil 1, нацеленных к различным участкам мРНК белка Р РСВ в пределах открытой рамки считывания.
На модели РСВ-инфекции в культуре клеток МА104 проведена оценка противовирусного действия 6 экспериментальных образцов и препарата смеси этих образцов, названного siMix, при помощи микроскопического наблюдения за состоянием монослоя клеток, методом титрования вируса и определением количества вирусной РНК в культуральной жидкости методом ПЦР в реальном времени по сравнению с неспецифической siRNA к мРНК белка VP4 риновируса 16 серотипа. Подобранные специфические siRNA эффективно подавляют репродукцию РСВ в культуре клеток.
Получена экспериментальная модель РСВ-инфекции на мышах BALB/C. На основании полученных данных о противовирусной активности siRNA в культуре
клеток, выбраны 3 наиболее эффективные последовательности siRNA (siOl, si03, si07), действие которых испытаны на мышиной модели инфекции РСВ. Специфичность действия siRNA контролировали посредством использования siRNA к мРНК белка VP4 риновируса 16 серотипа. Оценку противовирусной активности проводили путем определения количества вирусной РНК РСВ в гомогенатах легких мышей методом ПЦР в реальном времени, а также патологоанатомической оценкой состояния легких мышей и при помощи титрования вируса из легочных смывов. Полученные во второй части работы данные согласуются с эффективностью siRNA, полученными нами в культуре клеток.
Проведенные исследования in vitro и in vivo продемонстрировали противовирусную активность испытанных экспериментальных образцов посредством подавления репликации РСВ, что дает возможность для создания специфических противовирусных средств на основе механизма интерефернции РНК.
Практическая значимость.
На сегодняшний день в мире не существует эффективных лекарственных средств для лечения РСВ-инфекции, являющейся основной причиной таких тяжелых состояний как бронхиолит у детей, пневмония у детей и взрослых, а также одной из главных причин вирус-индуцированной бронхиальной астмы. Для решения этой актуальной проблемы в данной работе показана возможность применения механизма интерференции РНК для создания эффективных лекарственных средств сиквенс-специфического действия против РСВ.
