Содержание к диссертации
Список сокращений, используемых в работе 4
Введение 5
Обзор литературы 10
Глава 1. Миелопептиды- новый класс эндогенных иммуномодуляторов
История открытия МП 10
Биологическая активность и механизмы действия МП 12
Глава 2. Противоопухолевый иммунитет 16
2.1. Естественный и специфический иммунитет. Иммунологический надзор и
опухоли 16
2.2. Свойства и стратегия опухолевой клетки. Механизмы уклонения опухоли
от воздействия системы иммунитета 26
Заключение 36
Материалы и методы 40
Результаты исследований 46
Сравнительная оценка способности МП-2 и МП-5 восстанавливать пролиферативную активность Т-лимфоцитов периферической крови человека, подавленную продуктами опухолевых клеток 46
Характер связывания МП-5 с клеткой-мишенью 48
4.3. Влияние МП-2 и МП-5 на продукцию IL-2 и экспрессию IL-2 рецептора в
С04+-лимфоцитах, подавленные продуктами опухоли 51
4.4. Сдвиги в цитокиновой сети, происходящие при реализации
иммунокорригирующего эффекта МП-2 на Т-лимфоциты после воздействия
опухолевых агентов 54
4.5. Иммунокорригирующее действие МП-2 и МП-5 на Т-лимфоциты,
подавленные вирусом кори 58
Сравнительная оценка воздействия МП-2 и МП-5 на пролиферативную активность Т-лимфоцитов периферической крови человека, сниженную под воздействием вируса кори 58
Влияние МП-2 и МП-5 на продукцию IL-2 и экспрессию IL-2 рецептора в С04+-лимфоцитах, подавленные не только продуктами опухоли, но и вирусом кори 59
4.6. Сравнительное изучение связывания МП-5-FITC с СЭ4+-Т-лимфоцитами
периферической крови человека в норме и после воздействия продуктов
опухолевых клеток 62
Обсуждение результатов 64
Выводы 74
Список литературы 75
Список сокращений, используемых в работе
CD - "cluster of differentiation"
FITC — fluoroscein isothiocyanate
G-CSF - granulocyte colony-stimulating factor
GM-CSF — granulocyte-monocyte colony-stimulating factor
HLA - human leukocyte antigens
IL — interleukin
INF - interferon
KIR - killer Ig-like receptor
MHC - major histocompatibility complex
NK - natural killer
PE - phycoerythrin
TAP - transporter associated with antigen processing
Th - T-helper
TNF - tumor necrosis factor
Введение к работе
Актуальность работы. Известно, что иммунная система играет основную роль в защите организма против любых чужеродных агентов. К ним относятся бактерии и их токсины, вирусы, простейшие, паразиты, донорские ткани, мутированные собственные клетки организма (например, раковые) и т.п (Ройт А., Бростофф Дж., 2000).
В 50-х годах XX века. М. Burnet сформулировал положение об иммунологическом надзоре, согласно которому главная задача иммунологической системы сводится к контролю за постоянством внутренней среды и уничтожению всего чужеродного для организма (Burnet FM, 1970). Это положение было экстраполировано и на злокачественные опухоли: если в организме появляются злокачественно трансформированные клетки, это значит, что иммунологическая система не справляется со своими функциями. Однако, наряду с понятием иммунологического надзора существует такое понятие, как «стратегия опухолевой клетки», включающее множество возможностей, которые опухоль мобилизует для продолжения своего роста. Опухолевая клетка способна реализовать свою «стратегию» на всех этапах взаимодействия с организмом, начиная с момента её распознавания иммунной системой. Есть все основания говорить о большом разнообразии механизмов «ускользания» опухоли от иммунологического контроля (Дейчман Г.И., 2000; Seliger, 2005).
В проблеме злокачественных новообразований важны как изучение этиологии и патогенеза опухолей, так и разработка новых методов лечения и реабилитации онкологических больных. В течение последних десятилетий 20-го столетия интенсивно разрабатывался новый подход к лечению злокачественных опухолей - иммунотерапия. (Rosenberg SA, 2001) Иммунобиологические препараты используются в настоящее время на различных этапах онкологических заболеваний в целях восстановления и
поддержания противоопухолевого иммунитета (иммунореабилитации). При правильном выборе таких препаратов их терапевтическая эффективность не вызывает сомнений, свидетельством чему являются многочисленные работы по изучению механизмов иммунореабилитации и успешный практический опыт (Robin М, Schlageter МН, 2005; Roy Noy, Malka Eppel, 2005; . Одно из важнейших требований к такого рода препаратам - наличие противоопухолевых и отсутствие опухолестимулирующих свойств. По прогнозам специалистов такой метод лечения позволит, как минимум, в 2 раза снизить смертность от онкологических заболеваний. Используя иммунотерапию даже при самой запущенной, IV стадии рака, можно значительно продлить или спасти жизнь 5-20% пациентов (Rosenberg S.A., 2001).
В начале 1970-х годов группой российских иммунологов под руководством Р.В. Петрова впервые были обнаружены иммунорегуляторные пептиды костного мозга - миелопептиды (МП) (Михайлова А.А., Петров Р.В. 1972; Михайлова А.А., Петров Р.В., 1976). МП синтезируются клетками костного мозга человека и млекопитающих без какой-либо стимуляции антигенами или митогенами. Они лишены видовой специфичности и, таким образом, могут быть использованы для иммунокоррекции при различных заболеваниях человека. В настоящее время структурно охарактеризованы и синтезированы шесть МП, каждый из которых обладает собственной иммунокорригирующей активностью. Многочисленные экспериментальные данные по биологическим свойствам МП показывают, что функциональная активность этого класса эндогенных регуляторов направлена на поддержание иммунного гомеостаза организма. При возникновении сдвигов в иммунной системе определенный МП взаимодействует с соответствующей клеткой-мишенью и индуцирует цепь реакций, приводящих к исправлению возникших нарушений. Показано, что один из МП (МП-2) обладает способностью восстанавливать функциональную активность Т лимфоцитов, подавленную продуктами опухоли (Стрелков Л.А., Михайлова А.А.,1996), и, тем самым,
оказывает противоопухолевый эффект, подавляя рост различных типов трансплантированных опухолей in vivo (Михайлова А.А., Герасимова Г.К.,1998) . С помощью лазерной проточной цитометрии показано, что МП-2 действует на CD4+-, но не на С08+-клетки. Первичная структура гексапептида МП-2 (Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp) гомологична по четырем аминокислотным остаткам структуре пентапептида МП-5 (Val-Val-Tyr-Pro-Asp), что указывает на возможность наличия противоопухолевой активности и у МП-5. Для выяснения наличия такой возможности представляет интерес изучить влияние МП-5 на функциональную активность Т-лимфоцитов, подавленных продуктами опухолевых клеток, а также исследовать некоторые механизмы реализации этого явления.
Цель исследования: сравнительное изучение способности МП-2 и МП-5 восстанавливать функциональную активность Т-лимфоцитов, подавленную продуктами опухолевых клеток, и выяснение возможных клеточных и молекулярных механизмов реализации данного эффекта. Для выполнения этой цели решались следующие задачи.
Задачи исследования
Исследовать способность МП-5 восстанавливать пролиферативный ответ к митогену Т-лимфоцитов периферической крови человека, подавленный продуктами опухолевых клеток.
Определить клетку-мишень для МП-5 и изучить характер связывания этого пептида с клеткой-мишенью.
Исследовать влияние МП-2 и МП-5 на продукцию IL-2 и экспрессию IL-2R в С04+-лимфоцитах, сниженные под влиянием продуктов опухоли.
Исследовать сдвиги в цитокиновой сети, происходящие при реализации иммунокорригирующего эффекта МП-2 на Т-лимфоциты, поврежденные продуктами опухоли.
5. Изучить возможность иммунокорригирующего эффекта МП-2 и МП-5 на Т-лимфоциты после воздействия на них другого повреждающего фактора, вируса кори.
Научная новизна. Впервые было показано в системе in vitro, что МП-5 восстанавливает пролиферативный ответ митоген-стимулированных Т-лимфоцитов периферической крови человека, сниженный под влиянием продуктов опухолевых клеток. Впервые было показано, что МП-5, как и МП-2, способен восстанавливать уровень продукции IL-2 и экспрессию IL-2R в Т-лимфоцитах периферической крови человека, подавленные продуктами опухолевых клеток.
В работе определена неизвестная ранее клетка-мишень для МП-5, CD4+-лимфоцит, показано наличие специфического связывания этого пептида с клеткой-мишенью, построена изотерма полного насыщения для МП-5, рассчитана Kd (2.0 х 10"7М).
Экспериментально доказана общебиологическая значимость регуляторных пептидов МП-2 и МП-5: установлено, что эти пептиды исправляют нарушения в Т-лимфоцитах, вызванные различными повреждающими факторами (опухолевые клетки, вирус кори), если в основе этих нарушений лежит повреждение продукции IL-2 и экспрессии IL-2R.
Научная и практическая значимость. Расшифровка механизмов иммунокорригирующего эффекта МП-2 и МП-5 и доказательство общебиологической значимости этих регуляторных пептидов вносит вклад в понимание функционирования крайне сложной и совершенной системы иммунорегуляции. Выявление способности МП-2 и МП-5 восстанавливать продукцию эндогенного IL-2, подавленную в результате опухоль-индуцированной иммуносупрессии, указывает на перспективность использования данных пептидов в качестве препаратов, альтернативных
рекомбинантному IL-2, токсичность которого доказана и является одной из основных проблем при его использовании в клинической практике.
Установленная в ходе данной работы клетка-мишень для МП-5 позволит в дальнейшем использовать его в качестве иммуномодулятора направленного действия при заболеваниях, связанных с нарушением функционирования CD4+-iaieTOK.
