Введение к работе
Актуальность проблемы. Функционирование системы естественной цитотоксичности (ЕЦТ) в организме человека и животных в качестве универсального механизма контроля пролиферации и дифференцировки клеток (Фукс Б.Б. и др., 1984; Hanna N, 1985; Hcrbcrman R.B., Ortaldo J.R., 1981; Kiessling R. ct al., 1984), рассматривающегося с эволюционных позиций как наиболее древний фактор иммунобиологического надзора (Cooper E.L. ct al., 1992; Du Pasquicr L., 1993; Herberman R.B., Holdcn H.T., 1979), определяет постоянное внимание исследователей к этому клеточному феномену (Du Pasquicr L., 1993; Grossman Z, Hcrbcrman R.B., 1986; Hcrbcrman R.B., Ortaldo J.R., 1981; Herberman R.B. ct al, 1980; Herccnd Т., Schmidt R.E, 1988; Karrc 1С. et al., 1991; Lanier L.L. ct al., 1992; Marx XL., 1980; Trinchieri G., 1989; Whiteside T.L., Hcrbcrman R.B., 1989).
С уровнем активности естественных киллеров (ЕК) обоснованно связывают резистентность к вирусным инфекциям и опухолевому росту (Herberman R.B., 1978; Herberman R.B., Ortaldo J.R., 1981; Marx J.L., 1980; Whiteside T.L., Hcrbcrman R.B., 1989), эффективность процессов отторжения и регенерации тканей (Опо М. et al., 1984; Rolstad В. et al., 1985; Waterfall P.M. et al., 1985), элиминации функционально устаревших клеточных форм (Пухова Я.И. и др., 1984).
Продуцирующие широкий спектр иммуноактивных цитокинов (Allavcna P. ct al., 1985; Djcu J.Y. et al., 1982; Kasahara T. et al., 1983; Lewis C.E. ct al., 1991; Naumc B. ct al., 1992, 1993a; Pcrussia B. ct al., 1992; Serrate S.A. et al., 1987), связанные многочисленными взаимодействиями с клетками лимфоидной и нелимфоидной природы (Гордиснко С.М. и др., 1987; Bloom Е.Т., Babbitt J.T., 1985; Bloom Е.Т. ct al., 1986; Chehimi J. et al, 1992, 1993; Holmbcrg L.A. et al., 1984; Minato N. ct al., 1985; Mortari F. ct a!., 1986; Radomska D.M. et al., 1989; Seaman W.E. et al, 1982; Toossi Z. ct al, 1989), способные к прямому цитотоксическому действию на Т- и В-лимфоциты, отдельные субпопуляции клеток костного мозга, а также прилипающие пе-ритонеальные клетки и трансформированные фибробласты (Grossman Z, Herberman R.B., 1986; Hcrbcrman R.B, 1982; Katz P. et al, 1989; Roblcs СР., Pollack S.B, 1986) ЕК формируют важное звено регуляции гемо-, лнмфопоэза и иммуногенеза (Dickinson А.-М. ct al, 1988; Hansson М. et al, 1988; Herberman R.B, 1982; Holmbcrg L.A. ct al, 1984; Suzuki R. ct al, 1985).
He удивительно, поэтому, что развитие иммунодефицита по ЕК, обусловленное блокированием созревания эффекторов ЕЦТ (Чскнсв СБ., 1993а; Combe В. et al, 1985; Gascon P. et al, 1986; Herman J. ct al, 1984, 1985a, 1985b; Ueno Y. et al, 1985a), дефектами ферментных систем, обеспечивающих программирование и реализацию отдельных стадий литнчсского цикла (Bonavida В. ct al, 1986; McGarry R.C. ct al, 1984; Roder J.C. ct al, 1983; Stcinhauer E.H. et al, 1982), либо изменением регуляторных влияний нейроэндокринных факторов (Сухих Г.Т., 1985; Dclafucnte J.C, 1985; Doria G, 1988; Dunn A.J, 1988; Irwin M, 1994), сопровождается нарушением функциональных взаимосвязей в иммунной системе организма,
активацией механизмов аутоагрессии или возникновением общей иммунологической недостаточности (Чекнсв СБ., 1993а, 1994; Combe В. et al., 1984; Evans D.L. et al., 1992; Galli M. ct al., 1989; Kott E. et al., 1990; Provinciali M. ct al., 1991; Rabinowich H. et al, 1985; Vitale M. ct al., 1992; Yu F. ct al., 1991; Zwciman В., Lisak R.P., 1986). Патогенез синдрома хронической усталости напрямую связывают с неэффективностью реализации цитотоксического потенциала ЕК против инфицированных вирусом клсток-мишеней (KM) (Aoki R. ct al, 1987; Caligiuri M. ct al, 1987; Whiteside T.L., Herbcrman R.B., 1989).
Несмотря на многолетние, активно ведущиеся исследования по проблеме ЕЦТ (Чекнсв СБ., 1993а; Herbcrman R.B., 1982; Herbcrman R.B., Ortaldo J.R., 1981; Hcrccnd Т., Schmidt R.E., 1988; Karrc К. ct al., 1991; Li H. ct al., 1994; Ortaldo J., 1993; Whiteside T.L., Herbcrman R.B., 1989), современная клиническая практика не располагает средствами иммунотерапии избирательного пролонгированного воздействия на популяцию ЕК. Отсутствуют, следовательно, экспериментальные и клинические подходы, использование которых позволяло бы восстанавливать не только цитотоксичность отдельных эффекторных клеток, но и утрачиваемые в условиях иммунодефицита контактные и дистантные взаимосвязи системы ЕЦТ, обеспечивающие в физиологическом режиме выполнение сю функций иммунобиологического надзора (Dianzani Е, 1992; Golub S.H. ct al., 1982; Hirsch R.L., Johnson К.Р., 1985; Ho M. ct al., 1981; Talmadgc J.E. ct al., 1985; Tank B. ct al., 1985). Это обстоятельство объясняется, по-видимому, выраженной способностью системы ЕЦТ к внутренней компенсации, определяющей возможность относительно автономного функционирования и реализации специализированной активности вне непосредственной связи с процессами индуцированного иммуногенеза. Поскольку с этих позиций цитотоксичсскис и регуляторные взаимодействия, опосредуемые ЕК, не рассматривались в предшествующих исследованиях, сведения о механизмах аутокринной регуляции системы ЕЦТ и особенностях се функционирования в физиологических условиях практически отсутствуют.
Неизученность механизмов установления и поддержания регуляторного баланса в комплексе естественных цитотоксических реакций не позволяет ответить на два принципиальных вопроса: каким образом в организме обеспечивается уровень ЕЦТ, необходимый для эффективного осуществления иммунобиологического надзора, и каким образом определяется физиологическая достаточность уровня активности ЕК, исключающая проявление цитотоксичности против неизмененных собственных клеток организма (Пухова Я.И. и др., 1989; Abruzzo L.V. et al., 1986; Dickinson A.-M. et al., 1988; Gatcly M.K. et al., 1988; Hansson M. et al., 1988; Herbcrman R.B., 1982; Katz P. ct al., 1989; Mason P.D. et al., 1988; Ono M. ct al., 1984; Radomska D.M. ct al., 1989). Вскрытие указанных механизмов способствовало бы разработке средств и способов целенаправленной коррекции функционального состояния ЕК в эксперименте и клинике.
Наличие в каскаде иммуноактивных цитокинов, вырабатываемых ЕК под влиянием внешних индукторов или факторов гомеостатической
регуляции, интерферона (ИФН)-а, ИФН-у и интсрлейкина (ИЛ)-2 (Allavena P. ct al., 1985; Djeu J.Y. ct al., 1982; Kasahara T. ct al., 1983; Lewis C.E. ct al., 199,1; Pistoia V, Fcrrarini M., 1988; Serrate S.A. ct al., 1987; Young H., Ortaldo J., 1987), являющихся наиболее значимыми медиаторами, контролирующими дифференцировку самих эффекторов ЕЦТ и реализацию их цитотоксичсского потенциала (Чекнёв СБ., 1993а; Abbud-Filho М. ct al., 1986; Li Н. ct al., 1989; Ortaldo J.R. et al., 1984; Saksela E. ct al., 1979; Targan S.. Dorcy E, 1980; Warren H.S. et al., 1993), подтверждает существование механизмов аутокринной регуляции ЕК. С другой стороны, оно предполагает возможность вовлечения системы ЕЦТ в процессы эндогенной биологической ретрансляции (ЭБР), очевидно, лежащие в основе нецитотоксических взаимодействий ЕК с клетками лимфоидной и нслимфоидной природы. Особенности функциональной организации системы ЕЦТ, обеспечивающие выполнение ею роли эндогенного биологического ретранслятора, воспринимающего и формирующего идентичные молекулярные сигналы, и механизмы контроля ЭБР через систему ЕЦТ остаются неизвестными. Их установление позволило бы существенно дополнить современные представления об общих принципах иммунорегуляции в организме, значимых в опенке патогенеза и прогнозировании течения патологических процессов, ассоциированных с развитием недостаточности ЕК и нарушением иммунного гомсостаза.
Целью исследования явилось изучение механизмов поддержания регуляторного баланса в системе ЕЦТ и установление факторов внесистемного рационального ограничения цитотоксичсскои активности ЕК.
Достижение указанной цели исследования предполагало иостанов-ку и решение следующих конкретных задач.
1. Оценки вариабельности цитотоксичсскои активности ЕК и чувствитель-
ности эффекторов ЕЦТ к действию факторов костномозгового и химического происхождения, иммуноакхивных пептидов, у-глобулина и взаимодействующих с ним компонентов сыворотки крови, иптерлейкинов.
2. Изучения функциональных взаимосвязей системы ЕЦТ и ИФН:.пара-
метров, определяющих ответ ЕК на действие ИФН; корреляции цито-токсичности и продукции ИФН при взаимодействии ЕК:КМ; влияния ИФН vi его ингибиторов на чувствительность КМ к ЕК-опосрсдованному цитолизу.
3. Установления возможностей регуляции цитотоксичсскои активности ЕК
на стадии распознавания и связывания КМ эффектором ЕЦТ в лнтическом
цикле. - " !
4. Оценки изменений и динамики цитотоксичности ЕК и показателей ИФН-
статуса организма в ходе иммунотерапии при заболсв'аііиях|'іі;атогенсти-чески или вторично ассоциированных с функциональной недостаточностью системы ЕЦТ.
5. Изучения влияния на цитотоксическую активность ЕК и блаеттрансфор-
, .мацию лимфоцитов (БТЛ) человека in vitro связанных с у-глобулином
сыворотки крови факторов, участвующих в транспорте и обмене катионов
металлов. ' '
5 ";/i'" '
6. Оценки влияния фракций металлосвязывающих (МС) пептидогликанов
цианобактсрий (ПГЦБ) на уровень функционирования системы ЕЦТ: действия на ЕК-активность и БТЛ человека in vitro; действия на ЕК-активность, блаеттрансформацию спленоцитов и показатели ИФН-статуса лабораторных животных в хронических опытах in vivo.
7. Осуществления сравнительного статистического популяционного анализа
динамики цитотоксической активности ЕК в условиях глобальной экспансии цианобактсрий.
Научная новизна выполненного комплекса исследований определяется реализованным в работе принципиально новым подходом, обосновывающим возможность функционирования системы ЕЦТ человека и высших животных в относительно автономном режиме и се вовлечения в процессы ЭБР, осуществляющиеся в условиях нсцитотоксичсских взаимодействий ЕК с клетками лимфоидной и нелимфоидной природы и значимые в поддержании иммунного гомеостаза.
Установлено, что опосредуемые эффекторами ЕЦТ реакции иммунобиологического надзора обеспечиваются на основе высокой вариабельности цитотоксической активности ЕК, выявляющейся на клеточном, половом, возрастном и популяционном уровне; широкого диапазона чувствительности клеток к действию иммуноактивных пептидов костномозгового и тими-ческого происхождения, ИФН, интерлейкинов, С-рсактивного белка и компонентов сыворотки крови; способности эффекторов ЕЦТ к осуществляемой в условиях существенного вклада прилипающих клеток (ПК) выработке ИФН и независимой от нес реализации цитотоксического потенциала.
Изучение функциональных взаимосвязей системы ЕЦТ и ИФН позволило обнаружить сопровождающую выработку ИФН продукцию клетками крови не известного ранее ингибитора регулирующего действия ИФН на активность ЕК (ИРДИ); этот ингибитор полностью блокирует эффекты ИФН-а и ИФН-у в отношении аутологичных (ауто-) ЕК. Доказана возможность независимого от продукции ИФН осуществления цитотоксической функции ЕК - в условиях воздействия in vitro синтетического гскса-ncnTiiflaCys-(Pro)3-Glu-Lcu, проявляющего в культуре лимфоцитов периферической крови (ЛПК) человека свойства индуктора ИФН-у, а в реакции ЕЦТ отменяющего выработку ИФН и повышающего цитотоксичность ЕК. Впервые установлена зависимость влияния ИФН и его ингибиторов на устойчивость КМ в реакции ЕЦТ от чувствительности КМ к антивирусному действию ИФН и обнаружено, в частности, что ингибитор ИФН воспроизводит эффект ИФН в отношении резистентных к последнему мышиных КМ, протектируя их от ЕК-опосрсдованного цитолиза.
В работе впервые показано, что действие таких стимуляторов ЕК, как ИФН-у (препарат гаммаферон), С-реактивный белок и гексапептид Cys-(Pro)3-Glu-Leu реализуется уже на стадии распознавания и связывания КМ эффектором ЕЦТ в литическом цикле. Оно проявляется диссоциацией конъюгатов, сформированных в процессе нсспецифической адгезии, по-видимому, цитотоксически не активными ЛПК, и последующим повышением
эффективности цитолиза, сопровождаемым ростом корреляции интенсивности конъюгатообразования и цитотоксической деструкции КМ.
Клинико-иммунологические исследования устанавливают, что при заболеваниях, сопровождающихся развитием функциональной недостаточности ЕК, наблюдаются изменения чувствительности эффекторов ЕЦТ к действию факторов физиологической регуляции in vitro, вклада ПК в суммарную цитотоксичность и продукцию ИФН в ходе ЕК-опосрсдованного цитолиза, взаимосвязей системы ЕЦТ и ИФН. Рассматриваемый в качестве симпто-мокомплекса, патогенетически связанного с иммунодефицитом по ЕК, рассеянный склероз (PC) обоснованно представляется болезнью, ассоциированной с нарушением процессов ЭБР. В соответствии с впервые полученными данными, PC характеризуется стадио-специфическими изменениями цито-токсичности ЕК, отражающими тип течения процесса и степень инвалидиза-ции больных; выраженным в динамике заболевания снижением продукции индуцированных ИФН-ии ИФН-у; недостаточностью ИРДИ. В условиях сохранения лимфоцитами больных нормального уровня реагирования на действие иммунокорригирующих препаратов положительный клинический эффект средств иммунотерапии при PC, заболеваниях печени, вызванных вирусом гепатита В, и рецидивирующем герпесе гениталий сопровождается восстановлением in vitro цитотоксического потенциала ЕК.
В работе получены приоритетные данные, свидетельствующие о возможности внесистемного негативного контроля цитотоксичности ЕК эндогенными и экзогенными факторами, участвующими в транспорте и обмене катионов металлов. Последнее находит свое подтверждение при сопоставлении действия на ЕК-актнвность ЛПК человека in vitro соответствующей по составу псптидо(протео)гликанам ассоциированной с у-гло-булином сыворотки крови фракции, освобождаемой в условиях воздействия хелатирующего агента; гепарина; обладающих мсталлосвязывающими свойствами фракций ПГЦБ, выделяемых из культуральной жидкости Anabaena variabilis и проб водопроводной воды, полученных из различных источников.
Значимость подобных соединений в обеспечении достаточного для эффективного выполнения функций иммунобиологического надзора и вовлечения в процессы ЭБР уровня активности системы ЕЦТ устанавливается впервые осуществленными хроническими опытами на лабораторных животных in vivo, предполагающими наблюдение за состоянием иммунорсактивности белых беспородных мышей, поддерживаемых на питье с заданным содержанием МС-компонснтов, входящих во фракцию ПГЦБ водопроводной воды. Она также подтверждается детальным анализом результатов статистического исследования, проведенного для отдельных регионов мира и включающего оценку динамики популяцнопного уровня ЕЦТ человека в условиях глобальной экспансии цианобактсрий.
Теоретическая значимость исследования. В работе выдвинуты и доказаны следующие фундаментальные положения.
1. Рсгуляторный баланс в комплексе естественных цитотоксических реакций обеспечивается эффективными внутренними клеточными и гумораль-
ными механизмами системы ЕЦТ, совокупность которых определяет возможность ее функционирования в относительно автономном режиме и вовлечения в процессы ЭБР, по-видимому, лежащие в основе нсцитоток-сических взаимодействий ЕК с клетками лимфоидной и нслимфоидной природы.
2. Значимые в осуществлении аутокринной и иаракринной регуляции актив-
ности ЕК эффекты ИФН ограничиваются семейством его ингибиторов. Сочстанпый дефицит ИФН и ИРДИ является ведущим звеном развития недостаточности ЕК, патогенетически связанной с формированием им-мунорегуляторного дисбаланса при PC, представляющимся патологией ЭБР, опосредуемой через систему ЕЦТ. В определенных экспериментальных условиях цитотоксическая функция ЕК может реализоваться и даже усиливаться in vitro на фоне исключения выработки ИФН ЛПК.
3. Негативный контроль комплекса естественных цитотоксических реакций
в организме человека и высших животных обеспечивается эндогенными механизмами и факторами экосистемы, устанавливающими и поддерживающими определенный вектор транспорта и обмена катионов металлов в микроокружении клетки и, возможно, управляющими, тем самым, окислительно-восстановительными процессами, протекающими через стадию короткоживущих радикалов кислорода, потребляемых в реакциях ЕК-опосрсдованного цитолиза.
Практическая значимость работы. Обоснована необходимость учета индивидуальной (половой и возрастной) вариабельности цитотоксической активности ЕК при оценке уровня ЕЦТ лимфоцитов и назначении средств иммунотерапии, предполагающем воздействие на функциональные параметры системы ЕЦТ. Подтверждена целесообразность сохранения в натуральных медицинских препаратах ИФН-а всего комплекса цитокинов, вырабатывающихся одновременно с ИФН в условиях адекватной индукции последнего. Установлено, что сохранение ЕК больных способности к ответу на действие иммунокорригирующих препаратов может использоваться в качестве ориентирующего критерия в прогнозе эффективности иммунотерапии. Патогенетически обоснована разработка способов применения препаратов ИФН в комбинации с ИРДИ в иммунотерапии PC. На основе полученных в работе результатов исследований разработан алгоритм использования оценки цитотоксической активности ЕК и уровня Р-бслка в сыворотке крови для диагностики атипичных форм PC и их дифференцирования с онкологическим процессом. На основании теоретических разработок и практических результатов, связанных с выполнением исследований по теме диссертации, а также осуществленных в предшествующие годы, предложены: способ дифференциальной диагностики стволового и полушарного ишемического инсульта при нарушении мозгового кровообращения (Авт. свидст. СССР № 1455317 от 1 октября 1988 г.), способ дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных опухолей головного мозга (Авт. свидет. СССР № 1482102 от 22 января 1989 г.), способ определения индивидуальной чувствительности к иммуномодулирующим препаратам у больных злокачест-
венными лимфопролиферативными заболеваниями (Авт. свидет. СССР № 1628702 от 15 октября 1990 г.).
Внедрение в практику. Результаты исследований, полученные в ходе выполнения темы докторской диссертации, используются в лаборатории препаратов интерферона НИИ ЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН при разработке новых лекарственных форм натурального ИФН-а. Они внедрены в клиническую практику кафедр неврологии и нейрохирургии №1 и №2 лечебного факультета РГМУ (диагностика и прогнозирование эффективности иммунотерапии при рассеянном склерозе и других заболеваниях нервной системы). Результаты работы используются специалистами кафедры кожных болезней ММА им.И.М.Сеченова для оценки иммунного и ИФН-статуса, а также в контроле эффективности терапевтических мероприятий у больных рецидивирующим герпесом гениталий. Теоретические разработки и экспериментальные данные, содержащиеся в работе, включены в курс лекций для студентов и спец. курс по иммунологии кафедры иммунологии РГМУ.
Апробация материалов диссертации. Основные результаты исследований представлены и обсуждены на VI Международном иммунологическом конгрессе (Торонто, 1986), Весе, симпозиуме "Иммуно-дефициты и аллергия" (Москва, 1986), Всес. конференциях "Методология, организация и итоги массовых иммунологических обследований" (Ангарск, 1987) и "Возрастные изменения в иммунном балансе" (Ташкент, 1987), X региональном симпозиуме соц. стран по интерферону (Юрмала, 1988), IX и XI Европейских иммунологических конгрессах (Рим, 1988 и Хельсинки, 1991), VIII Весе, съезде невропатологов, психиатров и наркологов (Москва, 1988), I Конгрессе иммунологов Эстонии (Тарту, 1989), Ежегодных Совещаниях Международного Общества исследования интерферона (и цитокинов) (Флоренция, 1989, Ницца, 1991 и Токио, 1993), Выезди, объедии. Пленуме пробл. комиссий АМН СССР "Иммуномодуляторы в профилактике и лечении инфекционных заболеваний" (Юрмала, 1989), Симпозиуме Ассоциации исследователей интерферона СССР "Интерфсрон-90" (Ленинград, 1990), Весе, симпозиуме "Новые методы прогноза патологического процесса" (Курск, 1991), Симпозиуме "Нсйроиммунология на пороге XXI века" (Санкт-Петербург, 1993), Международной конференции "СПИД: от фундаментальной науки к превентивной диагностике и терапии" (Флоренция, 1994), 2-м Симпозиуме Общества естественного иммунитета "NK-клетка и ее взаимодействие с иммунными и неиммунными клетками" (Таормина, 1994) и ряде других отечественных и международных конференций и симпозиумов. В 1991 г. результаты исследований по теме диссертации докладывались и обсуждались на персональных авторских семинарах в Институте вирусологии (Рим), Институте иммунобиологии Общества Макса Планка (Фрайбург) и Институте токсикологии Общества Фраун-хофера (Ганновер); они включены составной частью в итоговый отчет о стажировке по стипендии ВОЗ. Разработки по диагностике и коррекции интерфс-роновых дефицитов отмечены премией Ленинского комсомола 1989 г. Апробация диссертационной работы состоялась на межлабораторной научной конференции НИИ ЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН, протокол от 8 апреля 1997 г.
Публикации. Основные результаты исследований по теме диссертации отражены в 58 научных публикациях (из них 13 - в зарубежных изданиях), включены в 7 авторских обзоров, использованы в монографиях "Иммунобиология гормонов тимуса" под ред. Ю.А.Гринсвича и В.Ф.Чебо-тарсва (Киев, Здоровья, 1989) и - А.Я.Кульбсрга "Экологический кризис: стратегия выживания" (М., Русская энциклопедия, 1994).
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 341 странице машинописи и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, 4 глав результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов. Иллюстрирована 37 таблицами и 55 рисунками. Указатель литературы содержит 664 источника, из них -115 отечественных.
![Возможности коррекции адаптационных реакций фитоплацентарного комплекса в III триместре беременности [Электронный ресурс]](/i/i/4318/201040.png "Возможности коррекции адаптационных реакций фитоплацентарного комплекса в III триместре беременности [Электронный ресурс] Хоменко Юлия Борисовна")
