Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы
1.1 Принципы противоопухолевого иммунитета. Иммунологическая компетентность и рак 16
1.2. Характеристика эффекторов противоопухолевого иммунитета 18
1.2.1. Цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ), Т-киллеры 18
1.2.2. Натуральные киллеры (НК) 19
1.2.3. НКТ-клетки 25
1.2.4. Лимфокинактивированные клетки киллеры (ЛАК). ЛАК феномен 25
1.2.5. Дендритные клетки 30
1.3. Адоптивная иммунотерапия злокачественных новообразований 43
1.3.1. ИЛ-2/ЛАК-терапия 44
1.3.2. TIL-терапия 48
1.4. Противоопухолевые вакцины на основе антигенпрезентирующих клеток 49
2. Материалы и методы исследования
2.1. Материалы исследования 54
2.1.1. Экспериментальные животные 54
2.1.2. Клеточные линии 54
2.1.3. Модели опухолей и методика их перевивки 54
2.1.4. Питательные среды 55
2.1.5. Реактивы 55
2.2. Методы исследования 56
2.2.1. Методика выделения МНК периферической крови 56
2.2.2. Методика выделения МНК из интактной ткани и изпаратуморальной области печени 56
2.2.3. Методика выделения CD34+ клеток-предшественников из костного мозга и селезенки мышей и человека 57
2.2.4. Методика выделения МНК из экссудата 57
2.2.5. Световая микроскопия 58
2.2.6. Цитологическое исследование 58
2.2.7. Электронная микроскопия 58
2.2.8. Окрашивание клеток витальным красителем МТТ. 58
2.2.9. Цитотоксический тест 59
2.2.10. Иммуноферментный анализ (ИФА) 60
2.2.11. Проточная цитометрия (FACS-анализ) и характеристика антител 60
2.2.12. Статистические методы 62
3. Результаты собственных исследований
3.1. Способ генерации и особенности иммунофенотипа, морфологии и функциональной активности ЛАК клеток 63
3.1.1 .Способ генерации ЛАК клеток из различных источников 63
3.1.2. Цитотоксическая активность ЛАК 63
3.1.3. Изучение спонтанной продукции цитокинов ЛАК 70
3.1.4. Цитологическая характеристика ЛАК 71
3.1.5. Иммунофенотип ЛАК 73
3.2. НКТ-клетки 82
3.3. Способы генерации и характеристика дендритных клеток 86
3.3.1.Получение ДК из CD34+ предшественников костного мозга, МНПК и селезенки мышей и человека 86
3.3.2. Оценка продукции цитокинов ДК различной степени зрелости 89
3.3.3. Морфологические особенности ДК (цитологическая картина) 90
3.3.4. Изучение особенностей иммунофенотипа ДК человека и мышей 94
3.4. Изучение противоопухолевого эффекта совместного применения ДК и ЛАК в системе in vitro 103
3.5. Исследование противоопухолевой активности ЛАК и аутовакцин на основе ДК на перевиваемых опухолях 111
4. Обсуждение 115
5. Выводы 123
6. Практические рекомендации 124
7. Список литературы
- Цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ), Т-киллеры
- Адоптивная иммунотерапия злокачественных новообразований
- Методика выделения МНК из интактной ткани и изпаратуморальной области печени
- Цитотоксическая активность ЛАК
Цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ), Т-киллеры
Цитотоксические лимфоциты (ЦТЛ) играют ключевую роль в системе противоопухолевого надзора, их киллерная активность может быть существенно повышена при воздействии стимулирующих агентов.
ЦТЛ или СВ8+Тоф-лимфоциты в организме осуществляют функции антигенспецифической цитотоксичности. TCR этих лимфоцитов распознает свой антиген в комплексе с молекулами МНС I на мембране клеток собственного организма, которые в данном случае являются клетками-мишенями для киллерной атаки со стороны ЦТЛ. Специализированный механизм киллинга у ЦТЛ локализован в гранулах. Неиммунные зрелые ЦТЛ после выхода из тимуса имеют только программу для синтеза эффекторпых молекул, но не сами молекулы. После вовлечения их в иммунный ответ, распознавания ими своего антигена эта программа начинает действовать, а именно: происходит синтез цитотоксинов, которые накапливаются в гранулах в виде неактивных молекул-предшественников. Причем гранулы в клетке сориентированы локально в связи с TCR, что обеспечивает возможность строго направленного киллерного удара по клетке-мишени. Сами цитотоксины неспецифичны по отношению к антигену, т.е. они одинаковы для всех антигенов. При работе ЦТЛ не повреждаются ни сами ЦТЛ, ни здоровые клетки тканей организма. Механизм работы иммунного ЦТЛ состоит в том, что ЦТЛ связывает своим TCR антиген на поверхности клетки-мишени и в области связи быстро формируется межклеточный интерфейс- зона контакта [41,54]. Локально в этой области происходит выброс содержимого гранул ЦТЛ. Гранулы ЦТЛ содержат два типа белков -перфорины и гранзимы А, В и С. Гранзимы являются сериновыми протеазами, предназначенными для инициации программы апоптоза. Но если в клетке-мишени нет программы апоптоза или есть дефекты в этой программе, то ЦТЛ все равно разрушит эту клетку некрозом - осмотическим лизисом через поры, образованные перфорином. На организацию сигнала для апоптоза для клетки-мишени ЦТЛ требуется не более 5 минут, после чего он физически переходит к другой клетке-мишени, т.е. ЦТЛ является серийным киллером. Большинство ЦТЛ продуцируют ФНО-а и р\ ИНФ-у, который активирует НК и макрофаги, включая их в иммунный ответ. Кроме того ИНФ-у является кофактором индукции дифференцировки из CD4+ThO-субпопуляции Till, что означает, что ЦТЛ вносят свой вклад в развитие других эффекторнътх механизмов иммунного ответа [11]. По данным ряда авторов ЦТЛ обладают способностью вступать во взаимодействие с НКТ-лимфоцитами, активируя последние, а также с дендритными клетками [11].
НК составляют 10-20% мононуклеаров периферической крови и имеют морфологию больших гранулярных лимфоцитов. НК были определены по их способности лизировать клетки опухолевых линий, вирусинфицированные и некоторые нормальные клетки при нарушении их цитодифференцировки без предварительной сенсибилизации, по отсутствию рестрикции по МНС, по независимости от антител, а также кратковременной экспозиции с клетками-мишенями [11].
НК относятся к системе неспецифического иммунитета и в отличие от Т-киллеров не требуют каскада реакций антигенной презентации. Они наряду с нейтрофилами могут быть отнесены к «первой линии обороны» иммунологического надзора, так как способны при контакте с трансформированной клеткой без дополнительной активации вызывать ее лизис. В то время как для форміфования специфического иммунитета необходимы время и включение клеточного и цитокинового каскадов, НК могут действовать независимо от наличия антигена и МНС на мембране измененной клетки, что также является их характерным отличием от Т-киллеров. Сигналом для направленного киллинга может быть измененный или ассоциированный с чужеродным белком (вирусная трансформация клетки) МНС, либо отсутствие (снижение) экспрессии МНС на клетке собственного организма. Степень экспрессии МНС характеризуется эффектом обратной регуляции НК. То есть чем меньше на поверхности клетки молекул МНС, тем больше сигнал активации НК и вероятность лизиса этой клетки. Есть сведения, что положительным стимулом для НК является появление на клетке эмбриональных рецепторов. Оба эти момента чрезвычайно важны для функционирования противоопухолевого иммунитета, поскольку опухолевые клетки в процессе своей трансформации могут утрачивать МНС, терять тканевую специфичность и даже приобретать свойства эмбриональных клеток (низкодифференцированные эмбриокарциномы) и таким образом «ускользать» от специфического иммунитета. Именно эти наиболее злокачественные клетки могут явиться мишенью для НК, ибо отсутствие специфичности этих клеток должно активировать НК на их лизис.
Известно, что НК принимают активное участие практически во всех реакциях иммунной системы - в регуляции процессов пролиферации, дифференцировки и элиминации стареющих соматических клеток организма, в лизисе бактерий и внутриклеточных паразитов, в супрессии или активации В - лимфоцитов, в индукции супрессорной активности Т- лимфоцитов, в созревании предшественников ЦТЛ, генерации вирусспецифических ЦТЛ, модуляции регуляторных свойств моноцитов/макрофагов [1,9,15]. Помимо этого, НК регулируют биосинтез белков в клетках с нарушенной цитодифференцировкой и способствуют нормализации последней [74,75], созревание претимоцитов и тимоцитов, а также усиление пролиферации Т-лимфоцитов [1,74,75]. В связи с этим было признано важное значение НК в противоопухолевой защите, противоинфекционном иммунитете и в иммунорегуляции.
Морфологическая а иммунофенотипическая характеристика НК Морфология НК очень характерна - это большие гранулированные лимфоциты. По размеру они соответствуют большим лимфоцитам (12-15 мкм в диаметре при 7-9 мкм для малых лимфоцитов), имеют азурофильные гранулы в цитоплазме, количество и плотность которых варьирует. В гранулах этих клеток содержится перфорин - белок, обуславливающий образование пор в мембране клеток-мишеней, гранзимы - ферменты, вызывающие индукцию апоптоза при проникновении в клетки-мишени, хопдроитинсульфат А, защищающий НК от аутолиза [10].
Иммунофенотипически НК являются CD3", TCR (а,3,у,5)", CD16+ , CD56+ [15,19]. Однако на сегодняшний день не описан антиген, который бы присутствовал на всех НК, но наиболее характерными маркерами являются CD16+ и CD56+ [142]. Помимо вышеперечисленных антигенов на поверхности НК экспрессированы антигены, характерные для Т-лимфоцитов (CD2,CD3,CD7,CD8), моноцитов/макрофагов (CD11/CD18). НК также экспрессируют селектины, Р-интегрины, VLA-4,5,6 и антигенные детерминанты к гликопротеидам [90]. При активации CD2 на поверхности НК запускаются процессы фосфорилирования цитозольного белка с молекулярной массой 19 кД и тирозина, образования конъюгатов с клетками-мишенями, экзоцитоз цитолитических гранул [122,127,132,145]. Через CD7 осуществляются повышение внутриклеточной концентрации ионов кальция, перекрестной реагирование с CD25, CD71, CD54, HLA-DR, стимуляция секреции ИНФ у, повышается цитотоксическая активность НК, инициируется пролиферация НК и опосредуется адгезия к фибронектину [111]. CD11/CD18 опосредуют внеклеточную цитотоксичность и способствуют адгезии с клетками-мишенями [9,14,112,116,118]. VLA-4,5,6 способствуют адгезии к фибронектину и ламинину, опосредуют антителозависимую цитотоксичность и инициируют синтез ИЛ-2 [22]. Антиген CD57 при его активации опосредует адгезию с клеткой-мишенью и активируют литический потенциал НК [46].
Адоптивная иммунотерапия злокачественных новообразований
МНПК выделены из стабилизированной гепарином (25 ед/мл) периферической крови здоровых доноров на одноступенчатом градиенте фиколла, центрифугированием при 400 g в течение 30 минут. Лимфоидные клетки, образовавшие интерфазное кольцо, собирались пипеткой и трехкратно отмывались в среде 199. После каждой отмывки в 10-кратном объеме среды, клетки осаждались центрифугированием при 200 g.
В суспензии клеток, полученной после механического измельчения части органа в рабочей культуральной среде (РКС), гепатоциты были отделены от МНК путем центрифугирования при 50g в течение 5 минут. Гепатоциты 2 раза отмывали средой RPMI-1640 и ресуспендировали в этой же среде с добавлением 5% фетальной телячьей сыворотки (ФТС). Популяцию МНК выделяли с помощью центрифугирования в градиенте перкола. Клетки отбирали, отмывали в растворе Хенкса и ресуспендировали в 40% перколе с добавлением среды RPMI-1640. Затем суспензию клеток осторожно наслаивали на 70% перкол и центрифугировали 20 минут при 750 g. МНК отбирали из интерфазы. Клетки отмывали 2 раза фосфатно-солевым буфером (ФСБ) и ресуспендировали в среде RPMI-1640 с добавлением 10% ФТС, 2 тМ L-глутамина и 40 мкг/мл гентамицина.
Костный мозг человека был получен путем трепанобиопсии подвздошной кости. Клетки-предшественники выделяли при помощи центрифугирования в градиенте плотности фиколла-урограффииа. Клетки отмывали 3 раза средой RPMI-1640 при 1500 об/мин 5 мин. при 25 С.
Для получения МНК из селезенки удаленный во время операции орган подвергают измельчению и гомогенизации. Полученную взвесь клеток трижды отмьгоают культуральной средой на основе RPMI-1640 и наслаивают на фиколл-урограффин. Затем центрифугируют в режиме 1500 об/мин. в течение 30-40 минут. Образовавшееся интерфазное кольцо, содержащее МНК, собирают в пробирку и трижды отмьгоают в среде RPMI-1640. Отмытые МНК ресуспендируют в ПКС.
У мышей для получения клеток-предшественников удаляли бедренные кости и селезенку (после введения гексенала). Костномозговой канал кости промывали средой RPMI-1640, селезенку растирали в стерильных условиях. Полученную клеточную взвесь наслаивали на градиент плотности 1,088 и центрифугировали при 1500 об./мин. 30 мин. Образовавшиеся интерфазное кольцо МНК собирали, отмывали дважды центрифугированием и ресуспендировали в ПКС с 10% фетальной сыворотки в концентрации 1 млн/мл.
Для получения МНК из плевральной жидкости плевральную полость дренируют катетером, экссудат эвакуируют в стерильные емкости с гепарином (20 ЕД/мл) и разделяют на клеточную и плазменную части путем центрифугирования (1000 об/мин, 20 мин.). Из клеточной фракции выделяют МНК и опухолевые клетки. МНК получают из плеврального экссудата с использованием техники сепарации Ficoll-Hypague. МНК суспендируют в ПКС. 2.2.5. Световая микроскопия.
Клетки, культивируемые в пластиковых флаконах, после удаления среды фиксировали метанолом и окрашивали по Романовскому - Гимзе, просматривали и фотографировали.
Клетки, отмытые от питательной среды, фиксировались в 2% растворе глютаральдегида до 40 минут. Затем, центрифугировались при 400 g в течение 30-40 минут. Полученный осадок после фиксации в четырёхокиси осмия заключали в смолы (ЭПОН-812). Ультратонкие срезы готовили на ультрамикротоме ЛКБ-Ш (Швеция). Ультратонкие срезы после обработки уранил-ацетатом и цитратом свинца просматривали и фотографировали в электронном микроскопе ДЖЭОЛ-1200 СХII (Япония).
МТТ—метод определения жизнеспособности клеточных культур заключается в способности живых клеток превращать растворимый желтый бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-тертазолия (МТТ) в нерастворимые пурпурно-синие внутриклеточные кристаллы МТТ-формазана (МТТ-ф). Нежизнеспособные мертвые клетки такой способностью не обладают. Интенсивность превращения МТТ в МТТ-ф отражает общий уровень дегидрогеназной активности исследуемых клеток и модулируется активностью сопряженных ферментных систем, например, дыхательной цепи переноса электронов и т.д. Показано, что оптический сигнал (ОП), измеренный в диапазоне длин волн поглощения МТТ-ф (540-570 нм) после растворения последнего, прямо пропорционален количеству жизнеспособных клеток.
МТТ-тест. Раствор МТТ приготовлен в концентрации 5 мг/мл на основе солевого раствора Хенкса (хранение при 4 С в течении месяца в защищенном от света месте). МТТ добавляется в объеме 20 мкл и инкубируется 4 часа при 37 С. Образовавшиеся внутриклеточные кристаллы растворены в ДМСО (150-200 мкл/лунку). Оптический сигнал измерен при 540 нм.
В 96-луночные плоскодонные планшеты ("Flow Laboratories") помешали по 100 мкл суспензии МНК с концентрацией от 5-Ю5 до 2 -106 в1 мл и по 100 мкл суспензии клеток-мишеней с концентрацией от 2,5» 104 до 4 -105в1 мл РКС. Соотношения эффекторов и мишеней составляли 20:1; 10:1; 5:1; 2,5:1; 1:1. В контрольных исследованиях в лунки были помещены только эффекторы или только мишени (в 100 мкл РКС) и добавлено по 100 мкл культуральной среды. Варианты исследований тестированы в триплетах. Через 18-24 час. инкубации в атмосфере 5 % С02 и 100 % влажности при 37 С, во все лунки планшеты добавлено по 20 мкл рабочего раствора МТТ в концентрации 5 мг/мл. После 3-4-х часовой инкубации в С02-инкубаторе (условия те же) планшеты центрифугированы при 1500 об/мин (5 мин), удален супернатант и в каждую лунку добавлено по 150 мкл ДМСО. Через 30 мин инкубации при комнатной температуре, после полного растворения кристаллов формазана измерена оптическая плотность (ОП) содержимого лунок на мультилуночном спектрофотометре ("Multiskan МСС 340", Labsystems) при длине волны 540 нм. Цитотоксичность выражена цитотоксическим индексом (ЦИ) в процентах:
Методика выделения МНК из интактной ткани и изпаратуморальной области печени
Согласно данным таблицы 7, уровни спонтанной продукции всех изучаемых цитокинов увеличиваются прямо пропорционально времени культивирования ЛАК и достигают своих максимальных значений к 3 суткам, что свидетельствует о достижении изучаемой клеточной популяцией своего активированного состояния, сопровождаемого повышенной секрецией регуляторных веществ. К 4 суткам уровни спонтанной продукции цитокинов существенно снижаются по сравнению с 3 сутками, но все же остаются достаточно высокими по сравнению с исходным уровнем и первыми сутками культивирования.
Мониторинг экстракорпоральной генерации ЛАК показал, что при активации МНК ИЛ-2 на 3-й сутки происходила пролиферация лимфоцитов, появлялись лимфоидные элементы различной степени зрелости, регистрировались единичные митозы. На 3-5-е сутки возрастало число крупных активированных лимфоцитов типа пролимфоцитов, появлялись клетки типа иммунобластов, повышалось количество митозов. Подобные изменения были расценены как реакция бласттрансформации, подтверждающая активацию лимфоидных клеток. Результаты цитологических исследований показали, что популяция активированных МНК на световом уровне была представлена преимущественно лимфоидными элементами с наличием укрупненных клеток типа пролимфоцитов и иммунобластов.
Как представлено в таблице 8, свежевыделенные МНК мыши обладают достаточно высоким уровнем экспрессии дифференцировочных антигенов CD3 и CD4 (50,4±12,6 и 25,8±9,3% соответственно). Уровень экспрессии активационных антигенов низок и составляет 2,1 ±0,4% и 26,9±11,2% для CD25 и CD38 соответственно. Это свидетельствует о том, что данная популяция лимфоцитов может быть отнесена к не активированным клеткам. Рисунок З Гистограмма, отражающая уровни экспрессии поверхностных маркеров на свежевыделенных МНК мыши
Как следует из данных, представленных в таблице 9, в процессе культивирования существенно изменяется иммунофенотипическая характеристика клеток. Уровень экспрессии дифференцировочных антигенов CD3 и CD4 снижается к 3-м суткам культивирования с 85,6±19,5% и 64,8±13,6% до 58,3±19,3% и 32,6±9,5 соответственно, что свидетельствует о начале процесса обратной дифференцировки клеток. Экспрессия активационных антигенов CD25+ и CD38+ также находится в прямой зависимости от времени культивирования клеток и возрастает с 10,5±2,6% и 28,8±8,7% до 34,3±5,4 и 56,1±10,6% соответственно к 3-м суткам инкубации.
При изучении особенностей экспрессии поверхностных маркеров на МНК человека установлено, что фенотип свежевыделенных из селезенки, печени и крови МНК практически идентичен и характеризуется низким уровнем экспрессии активационных антигенов CD25, CD38 и HLA-DR и достаточно высокими уровнями поверхностных дифференцировочных антигенов (CD3, CD4 и CD8). Особенностью фенотипа МНК из параметастатического участка печени является довольно высокий, по сравнению со всеми остальными МНК, уровень экспрессии CD58 -71.5±21,6% (10,2±4,5% у МНК селезенки; 11,8±3,6% -МНК крови; 24±8,2% -интактный участок печени), что может быть связано с повышенными адгезионными способностями этой клеточной популяции.
Для изучения фенотипа ЛАК человека были использованы активированные клетки, полученные из крови и селезенки. достоверные различия между фенотипами ЛАК селезенки Данные таблицы 11 позволяют выявить общие закономерности в изменении иммунофенотипических характеристик клеток по мере их культивирования. В частности, как для ЛАК крови, так и для ЛАК селезенки к 3-м суткам инкубации характерно снижение уровня экспрессии дифференцировочных антигенов более чем в 2 раза (CD3 с 73,2±21,3% до 26,9±9,6% для ЛАК крови и с79,0±25,6% до 33,1±9,3% для ЛАК селезенки; CD4 с 44,1±10,5% до 11,3±4,5% для ЛАК крови и с 22,9±8,6% до 15,8±5,8% для ЛАК селезенки; CD8 с 69.9±13,2% до 31,4±9,7% для ЛАК селезенки).
Динамика уровней экспрессии поверхностных активационных маркеров и молекул адгезии характеризуется обратной зависимостью. К 3-м суткам культивирования происходит увеличение экспрессии активационных антигенов как на ЛАК крови, так и ЛАК селезенки с 24,3±6,2% до37,7±11,2% и с 26,8±5,6% до 75,0±22,1% для CD38 и HLA-DR с 35,6±12,5% до79,4±25,4% и с 40,1± 11,6% до 70,3±21,5% соответственно.
Уровень CD58 возрастает по мере культивирования и достигает своего максимального значения к 3 суткам 84,9±25,6% для ЛАК крови и 70,3±21,5% для ЛАК селезенки.
Цитотоксическая активность ЛАК
Используемые для экспериментов зрелые ДК мыши были получены по стандартной методике, описанной выше. В качестве индукторов созревания выступали мышиный ФНО-а и лизат опухолевых клеток СаО-1. ЛАК генерировали из МНК селезенки посредством ИЛ-2. Для экспериментов использовали 3-х дневную культуру ЛАК, обладающую наибольшей функциональной активностью в отношении опухолевых клеток.
Как было показано выше, свойством зрелых ДК является их активное взаимодействие с другими эффекторами иммунитета. Для оценки влияния ДК на ЛАК и свежевыделенные МНК проводили их совместную коинкубацию. Изменение функциональной активности ЛАК и МНК, произошедшее в результате межклеточных взаимодействий, оценивали по их способности к лизису клеток-мишеней. В качестве клеток мишеней использовали 2 опухолевые линии: НК- чувствительную линию К-562 и СаО-1.
Полученные результаты могут быть представлены в виде серии таблиц и рисунков. Как следует из данных, представленных в таблице 18, свежевыделенные МНК мыши проявляют спонтанную цитотоксическую активность как по отношению к НК - чувствительной опухолевой линии, так и по отношению и к клеткам аденокарциномы яичника. Наиболее подвержены цитотоксическому действию МНК клетки линии К-562. Максимальный процент лизиса опухолевых клеток наблюдается при соотношении клеток-мишеней/эффекторов 1:2 и 1:5 - 18,6±2,3% и 18,8±1,4% соответственно. Опухолевые клетки СаО-1 в большей степени, чем К-562 устойчивы к цитотоксическому действию МНК. Наиболее зффеїстивньїм соотношением оказалось 1:5, при котором наблюдается лизис 12,4±2,6% клеток.
ЛАК проявляют высокую противоопухолевую активность в отношении К-562 уже при соотношении 1:0,5 (цитотоксичность - 100%). По отношению к клеткам линии СаО-1 цитотоксический эффект ЛАК значительно ниже и составляет 16,6±5,3% при соотношении 1:2 и 31,7±8,4% при соотношении 1:5. При сравнении цитотоксического эффекта ЛАК и
Как представлено на рисунке 16, совместная коинкубация зрелых ДК со свежевыделенными МНК мыши значительно увеличивает цитотоксический потенциал последних по отношению к опухолевым клеткам НК - чувствительной линии. Исходный уровень цитотоксичности МНК составил 18,6±2,3%, а после инкубации с ДК 99±5,6% (при соотношении 1:1).
Как следует из диаграммы, представленной на рисунке 17, зрелые ДК мьшш увеличивают цитотоксическую активность МНК по отношению к опухолевым клеткам СаО-1 в 1,5 раза. Спонтанная цитотоксическая активность МНК составляет 10,2±1,5%, а после совместной инкубации со зрелыми ДК -15,9±4% (при соотношении 1:2).
Согласно данным рисунка 18, зрелые ДК мыши обладают способностью потенцировать цитотоксический эффект МНК по отношению к опухолевым НК - чувствительным клеткам К-562 в большей степени и по отношению к клеткам линии СаО-І в гораздо меньшей степени. Цитотоксичность по отношению к К-562 составляет 99±5,6%, а по отношению к СаО-1 - 15,9±4%.
В таблице 20 представлены результаты изучения влияния зрелых ДК мыши на цитотоксическую активность ЛАК.
Согласно данным, представленным в таблице 20, зрелые ДК оказывают стимулирующее влияние на противоопухолевую активность ЛАК. Происходит увеличение цитотоксичности ЛАК по отношению к клеткам СаО-1 по сравнению с исходным уровнем (исходный уровень - 31,7±8,4% , после инкубации с ДК - 55,3±7,2% при соотношении 1:5). Исходная киллерная активность ЛАК по отношению к К-562 составляет 95-100% при соотношениях 1:2 и 1:5; аналогичные результаты были получены и при исследовании уровня цитотоксичности ЛАК, стимулированных ДК.
На рисушсе 19 представлены диаграммы, отражающие изменения цитотоксического потенциала МНК и ЛАК в зависимости от условий культивирования, а именно: коинкубация со зрелыми ДК. (представлены результаты, полученные на 2-х клеточных опухолевых линиях)
Таким образом, анализируя полученные данные, необходимо отметить, что при совместной инкубации зрелых ДК мыши с МНК и ЛАК происходит значительное увеличение цитотоксического потенциала обеих клеточных популяций как по отношению к клеткам НК - чувствительной опухолевой линии К-562, так и по отношению к клеткам аденокарциномы яичника СаО-1.
Таким образом, из экспериментов in vitro следует, что совместная коинкубация зрелых ДК с ЛАК клетками приводит к усилению оказываемого ими противоопухолевого эффекта, что является подтверждением нашей гипотезы о перспективности сочетания специфических и неспецифических факторов противоопухолевой защиты для целей иммунотерапии и иммунопрофилактики онкологических заболеваний.
Исследование противоопухолевой активности аутовакцин на основе ДК и ЛАК на перевиваемых опухолях мышей
Изучение противоопухолевой активности ЛАК иДК на модели СаО-1 (аденокарцинома яичников) при внутрибрюшинной перевивке опухоли.
Противоопухолевую активность ЛАК и ДК, а также их комбинации изучали на мышах-самцах линии СВА 2 месяцев и весом 22-24 г., которым внутрибрюшинно перевивали аденокарциному яичников. Опухоль, используемая для перевивки, была получена на потомстве мышей-самок линии СВА, которым во время беременности вводили эстрогены. Опухоль по гистологическому строению, клиническому течению и даже антигенному строению близка к раку яичника человека (БЭБиМ.- 2000 г., N 129 , стр. 456-459). Для контроля количества перевиваемых клеток опухоли были использованы клетки, которые инкубировали в системе in vitro. После того, как клетки формировали монослой, их снимали раствором Версена, отмывали центрифугированием и ресуспендировали в среде 199. Клеточную суспензию вводили мышам внутрибрюшинно по 0.2 мл из расчета 1 млн. клеток на 1 мл раствора.
