Введение к работе
Актуальность проблемы.
Достижения трансплантационной иммунологии последних десятилетий превратили пересадки аллогенных органов из экспериментального в лечебный метод, позволяющий добиваться спасения жизни и восстановления трудоспособности многих тысяч больных ежегодно. Так, по данным на 7.12.1994 /G.Opelz, 1994/ было выполнено трансплантаций: почек - 134573; сердца - 15507; печени -6382.
В нашей стране научные разработки и организационные мероприятия, связанные с проблемами трансплантологии, также занимали значительное место - течение последних десятилетий. Становление и развитие этого раздела медицины связано прежде всего с именами Б.В.Петровского, В.И.Шумакова, Р.В.Петрова, Ю.М.Зарецкой, К.М.Абдулкадырова, В.Н.Шабалина, Л.Д.Серовой, В.И.Говалло и других.
Однако, в настоящее время возникли новые проблемы, решение которых необходимо для дальнейшего развития этого направления медицины.
Важнейшей из них является определение эффективности различных методов воздействия на трансплантационный иммунитет при аллогенных пересадках органов и тканей в клинике.
Как . известно, из трех основных методов преодоления иммунологического барьера ' при аллогенной трансплантации: иммунологического подбора, иммунодепрессии и создания иммунологической толерантности, - в настоящее время широкое практическое применение нашли лишь первые два.
Появление в последние годы высокоэффективных препаратов иммуносупрессивного действия, таких как сандиммун /циклоспорин А/, ОКТ-3 /аіггитела к Т-клеточным рецепторам/ привело в глазах некоторых клиницистов к снижению значения иммунологического подбора для успешного функционирования аллогенного трансплантата /Middlton Р., 1991; Zmijewski С, 1991/, вплоть до предложения отменить законодательно закрепленную в' настоящее время за рубежом систему, предусматривающую очередность трансплантации поступающих донорских органов в соответствии со степенью совместимости по антигенам HLA донора и реципиента /Matas А., 1991/.
Это побудило организации Евротранспланта, занимающиеся иммунологическим типированием, начать широкое международное исследование, посвященное роли подбора по различным иммунологическим параметрам для успешного функционирования аллогенного трансплантата, на современном этапе.
Указанную проблему пытаются разрешить участники научного исследования Collaborative Transplant Stady /CTS/, в котором сотрудничают 102 иммунологические лаборатории из различных стран мира.
Длительное эффективное существование трансплантированного органа возможно только при осуществлении постоянного контроля за его функцией, дающего возможность прогнозирования и предупреждения отторжения трансплантата, а в случае пересадки костного мозга и болезни "трансплантат против хозяина". Разработка новых эффективных методов мониторинга функционирования трансплантата стала еще одной важной научной задачей трансплантационной иммунологии.
В настоящее время коренному пересмотру подвергается сама методика иммунологического типирования, поскольку классическое серологическое типирование не удовлетворяет исследователей, особенно при идентификации антигенов HLA 2 класса /Scherer et al, 1993; SchreuderG., 1993/.
Основными направлениями иммуногенетического типирования доноров и реципиентов является разработка и клиническое применение новых методов гистотипирования, позволяющих с большей точностью идентифицировать трансплантационные антигены. Таким условиям «отвечают ДНК-типирование и использование моноклональных антител, направленных против HLA-детерминант. Указанным вопросам были посвяшены последние научные совещания как Американской /ASHI, Финикс, 1993/, так и Европейской /EFI, Страссбург, 1994/ ассоциаций иммуногенетиков.
Актуальным аспектом иммунологического подбора, особенно при аллогенной трансплантации костного мозга, является наличие достаточного количества типированных доноров, без чего выявление фенотипически идентичного неродственного донора становится практически невозможным. Показателем важности этой проблемы является внесение в Сенат США законопроекта "Об улучшении трансплантаций", где представлены законодательные основы создания регистра доноров костного мозга /Kennedy et al, 1991/.
Научные и организационные вопросы по этой проблеме разрабатываются и в нашей стране, поскольку успешный подбор донора для аллогенной трансплантации невозможен без наличия или регистра типированных доноров при трансплантации костного мозга, или "листа ожидания" реципиентов при трансплантации почки.
Работы по созданию таких регистров и объединению их в международном масштабе интенсивно проводятся в настоящее время во всем мире.
В нашей стране в течение последних десятилетий трансплантология активно развивалась: увеличивалось число трансплантационных центров, внедрялись трансплантации костного мозга, легких, печени.
Несмотря на это, число аллогенньк трансплантаций и их эффективность еще значительно уступают зарубелшым результатам, что диктует необходимость интенсификации научных исследований в данном направлении.
Научные задачи лаборатории иммуногематологии Российского НИИ гематологии и трансфузиологин обусловлены тем, что, с одной стороны, она является центром, где проводится скрининг типирующих реагентов, поступающих из зональных центров России, и формирование отечественной типирующей панели, а с другой стороны, она участвует в проведении иммунологического подбора и иммуномониторинга при трансплантациях костного мозга, проводимых в гематологической клинике института, а ранее и трансплантациях почки в Санкт-Петербургском центре трансплантации, почки. Это позволяет проводить анализ всех этапов проведения аллогенных трансплантаций и дает возможность своевременно вносить коррективы.
Цель работы;
на основании комплексного исследования влияния
иммунологического подбора на результаты аллогенных трансплантаций костного мозга и почки и сравнительного изучения различных видов иммунологического типирования и мониторинга провести углубленный анализ состояния иммунологического обеспечения аллогенных трансплантаций и разработать комплекс мероприятий, повышающих эффективность этого лечебного метода.
Для выполнения указанной цели были поставлены следующие основные задачи:
1. Провести сравнительное изучение иммунологического
обеспечения трансплантаций аллогенной почки в Санкт-Петербурском
центре и в аналогичных центрах Евротранспланта.
2. Определить значимость различных параметров
иммунологического . подбора для приживления аллогенного
трансплантата и опасности возникновения болезни "трансплантат против
хозяина" при применении современных иммунодепрессантов.
3. Изучить возможность использования системы медиаторов
иммунитета - цитокинов для прогнозирования отторжения аллогенного
трансплантата и возникновения болезни "трансплантат против хозяина".
4. Изучить закономерности восстановления иммунологической
реактивности реципиента после трансплантации аллогенного костного
мозга и возможность использования их для прогнозирования
посттрансплантационных осложнений.
-
Провести сравнительное изучение серологического и молекулярного типирования и использования моноклональных антител для идентификации антигенов гистосовместимости 1 и 2 класса.
-
Обосновать и разработать методы улучшения качества типирующих реагентов, вспомогательных реактивов и учета результатов реакции тканевого типирования.
.7. Разработать и предложить научно обоснованную систему иммунологического подбора и мониторинга при аллогенных трансплантациях.
Научная новизна.
Проведено сравнительное изучение иммунологического обеспечения аллогенных трансплантаций костного мозга и почки и определена / относительная значимость различных факторов иммунологического / подбора для успешного функционирования аллогенного трансплантата.
Установлено, что наиболее значимым фактором для успешного приживления аллогенного трансплантата почки является совместимость по антигенам системы HLA, и в первую очередь локусов В и DR. Показано, что несовпадение по антигенам этих локусов, а также наличие преформированных антител к антигенам главного комплекса гистосовместимости и неидентичность донора и реципиента по антигенам АВО снижают выживаемость трансплантата. Высокий уровень стимуляции в обратном варианте реакции смешанной культуры лимфоцитов сопровождается повышением частоты возникновения болезни "трансплантат против хозяина" при трансплантации костного мозга.
Установлено, что повышение уровня ФНО-а и ИЛ-ір в посттрансплантационном периоде отмечается на ранних стадиях отторжения трансплантата и может служить надежным прогностическим . признаком этого осложнения. Повышение уровня ФНО - а сопровождает также возникновение болезни "трансплантат протиц хозяина".
Показано, что иммунологическая реконституция основных лимфоидных субпопуляшй: CD3, CD4, CD8, CD22, CD38, CD25, DR+, CD16 наступает между 30 и 60 днями после аллогенной трансплантации костного мозга от идентичного сиблинга, а отсутствие ее в эти сроки свидетельствует о развитии осложнений.
Выявлены значительные преимущества молекулярного метода типирования по сравнению с серологическим для идентификации антигенов главного комплекса гистосовместимости 2 класса.
Применение моноклональных антител для идентификации антигенов HLA 1 и 2 класса показало целесообразность их использования для выявления редких специфичностей.
Практическая значимость роботы.
На основании выполненных исследований предложена эффективная система иммунологического подбора и мониторинга аллогенных трансплантаций. При этом разработаны:
усовершенствованные наборы для серологического типирования, отвечающие международным стандартам;
метод лиофилиэаиии сывороток, допускающий хранение реагентов редких специфичностей в течение нескольких лет без утраты их активности;
метод высушивания комплемента, позволяющий сохранять его при температуре +4 С и транспортировать в нерегулируемых температурных условиях;
модификация иммунофлюоресцентного метода тканевого типирования с помощью разработанной люминесцентной насадки для светового микроскопа, позволяющая улучшить учет результатов микролимфоцитотоксической реакции.
- адаптированный к условиям лаборатории метод ДНК-типирования
для идентификации антигенов 2 класса;
- метод мониторинга иммунореконституции после аллогенной
трансплантации костного мозга, включающий определение основных
лимфоидных популяций с помощью моноклональных антител,
направленных к антигенам дифференшровки;
способ прогнозирования острого криза отторжения аллогенной почки с помощью определения уровня цитокинов ФНОа и ИУМр в сыворотке крови реципиента;
алгоритм поиска гистотипируюших стандартов к антигенам HLA 2 класса.
1. Длительность успешного функционирования аллогенного трансплантата коррелирует со степенью иммунологического подбора пар донор-реципиент. Основными факторами, обуславливающими отторжение аллогенного трансплантата почки, является несовместимость по антигенам HLA-B и DR, предсушествуюшие антитела к антигенам главного комплекса шстссовместимости и. несовпадение по антигенам системы АВО. Различия по антигенам В и DR отрицательно сказываются на выживаемости почечного трансплантата на всех сроках его существования, при этом значимость, различий возрастает к 3 годам наблюдения.
-
Повышение уровня цитокинов: фактора некроза опухоли а и интерлейкина-lft и нарушение восстановления ' лимфоидных субпопуляций в посттрансплантационном периоде позволяют прогнозировать начинающийся криз отторжения и реакцию трансплантат против хозяина.
-
Для повышения качества иммунологического типирования. при проведении аллогенных трансплантаций необходимо использовать молекулярное типирование при идентификации генов HLA 2 класса, а при идентификации HLA антигенов 1 класса - серологический метод с использованием .монокл опальных антител к редким специфичностям. Серологическое типирование должно базироваться на использовании высококачественного набора типируюших стандартов, лиофильно высушенного стандартизованного комплемента и возможности иммунофлюорешентного варианта учета ' результатов лимфоцитотоксической реакции с помощью люминесцентной насадки к световому микроскопу.
/ 4. Система иммунологического . обеспечения аллогенных
/ трансплантаций должна включать иммунологический подбор,
' основанный на молекулярном и серологическом типировании антигенов
главного комплекса гистосовместимости, выявлении предсушествующих
антилейкоцитарных антител, учете результатов реакции смешанной
культуры лимфоцитов, совместимости по антигенам системы АБО, и
иммуномониторинг, включаюший определение уровня медиаторов,
- инициирующих иммунный ответ, и показателей иммунореконституции.
Наличие представительного донорского регистра и/или "листа ожидания" является необходимым 'для эффективного применения аллогенных трансплантаций как лечебного метода у значительного числа больных.
Апробация работы.
Основные положения диссертации доложены и обсуждены на заседаниях: Международного симпозиума "Molecular factors of hematopoiesis and stem cell" /Москва, 1990/; 3 Всесоюзного съезда гематологов и трансфузиологов /Киров, 1991/; 1 съезда иммунологов России /Новосибирск, 1992/; Международного симпозиума "10th CTS Anniversary and 100000 CTS Transplants" /Гейдельберг, 1992/; 2 -й Международной конференции "Спид, рак и ретровирусы человека" /Санкт-Петербург, 1993/; 9-й Европейской конференции иммуногенетиков /Брайтон, 1995/; 18 конгрессе Скандинавского общества трансплантологов/Рига, 1995/.
По теме исследования опубликована 33 работы в научных журналах и сборниках научных трудов, получено авторское свидетельство на изобретение и патент.
Разработанные при выполнении исследования методы иммуномониторинга / определение уровня цитокинов в сыворотке крови реципиентов и реконституции лимфоидных субпопуляций после трансплантации костного мозга/ используются в работе отделения трансплантации костного мозга Российского НИИ гематологии и трансфузиологии.
Метод ДНК типирования внедрен в практику работы Российского НИИ гематологии и трансфузиологии.
Метод лиофильного высушивания сывороток используется в Республиканском центре иммунологического типирования тканей для сохранения редких типируюших реагентов.
Производство сухого комплемента на основе разработанного метода лиофилизаши налажено на базе опытной лаборатории института. Препарат в настоящее время используется всеми зональными лабораториями иммунологического типирования тканей, а также большинством типируюших центров России.
Иммунофлюоресцентный метод серологического типирования с помощью ' разработанной люминесцентной насадки к микроскопу "Бнолам-П1" внедрен. в работу лаборатории типирования Республиканского центра иммунологического типирования тканей, Белорусской Республиканской станции переливания крови, Московского НИИ ветеринарии, лаборатории иммунологии Нижегородской СПК и других.
Структура и объеы работы.
Диссертация состоит из введения, описания материала и методов,
трех разделов собственных исследований, заключения, выводов и
указателя литературы. ,'
Основной текст изложен на 187 страницах машинописи, работа иллюстрирована 42 таб/лщами и 46 рисунками. Указатель литературы содержит 307 работ.
