Содержание к диссертации
Стр.
ВВЕДЕНИЕ 7
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1 .Современные представления о механизмах формирования перинатальных
гипоксических поражений ЦНС у новорожденных 13
1.2. Современные представления о взаимодействии иммунной и нервной
систем 17
1.3.Роль иммунных нарушений при перинатальных гипоксических поражениях
ЦНС 22
Роль нарушений апоптоза в формировании перинатальных гипоксических поражений ЦНС 29
Роль нейроспецифических белков в патогенезе перинатальных поражений
цнс ; 36
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
Организация работы и объем исследования 39
Характеристика клинических групп наблюдения 40
Методы исследования 4І
ГЛАВА 3. ХАРАКТЕРИСТИКА АПОПТОЗА ЛИМФОЦИТОВ С ЦИТОТОКСИЧЕСКОИ АКТИВНОСТЬЮ И ЕГО РЕГУЛЯЦИИ ПРИ ПЕРИНАТАЛЬНЫХ ГИПОКСИЧЕСКИ-ИШЕМИЧЕСКИХ ПОРАЖЕНИЯХ ЦНС.
Параметры апоптоза лимфоцитов с цитотоксической активностью лейкоцитарного инфильтрата децидуальной оболочки зрелой плаценты женщин, родивших детей с перинатальными гипоксически-ишемическими поражениями ЦНС 49
Параметры апоптоза лимфоцитов с цитотоксической активностью пуповинной крови у новорожденных с гипоксически-ишемическими ПП ЦНС 55
3.3. Параметры апоптоза лимфоцитов с цитотоксической активностью у детей с
перинатальными гипоксически-ишемическими поражениями ЦНЄ в возрасте 1
месяц 59
3.4. Динамика показателей апоптоза лимфоцитов с цитотоксической
активностью в неонатальном периоде у здоровых детей и детей с
перинатальными гипоксически-ишемическими поражениями ЦНС различной
степени тяжести 63
3.5. Регуляция иммунного апоптоза при перинатальных гипоксически-
ишемических поражениях ІДНС 67
ГЛАВА 4. ДИНАМИКА СЫВОРОТОЧНОГО СОДЕРЖАНИЯ GFАР У ДЕТЕЙ 1-ГО МЕСЯЦА ЖИЗНИ С ПЕРИНАТАЛЬНЫМИ ПОРАЖЕНИЯМИ ЦНС
ГИПОКСИЧЕСКИ-ИШЕМИЧЕСКОГО ГЕНЕЗА 74
ГЛАВА 5. ХАРАКТЕРИСТИКА ЭКСПРЕССИИ мРНК МТ-1 В ЛИМФОЦИТАХ ПУИОВИННОЙИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ5У ДЕТЕЙ 1 -ГО МЕСЯЦА ЖИЗНИ С ПП ЦНС ГИПОКСИЧЕСКИ-ИШЕМИЧЕСКОГО
ГЕНЕЗА : 76
ГЛАВА 6. КОРРЕЛЯЦИОННЫЕ ВЗАИМОСВЯЗИ МЕЖДУ УРОВНЕМ ИЛ-6,
GFAP, ЭКСПРЕССИЕЙ мРНК МТ-1 В ЛИМФОЦИТАХ И ПОКАЗАТЕЛЯМИ,
АПОПТОЗА ЛИМФОЦИТОВ, У ЗДОРОВЫХ. ДЕТЕЙ И ДЕТЕЙ С
ПЕРИНАТАЛЬНЫМИ ГИПОКСИЧЕСКИ - ИШЕМИЧЕСКИМИ
ПОРАЖЕНИЯМИ ЦНС
6.1. Корреляционные взаимосвязи между уровнем ИЛ-6 в пуповинной и периферической крови и показателями иммунного апоптоза лимфоцитов у
здоровых детей и детей с ПП ЦНС 79
6:2. Корреляционные взаимосвязи между уровнем экспрессии мРНК МТ-1 и показателями иммунного апоптоза лимфоцитов пуповинной и периферической
крови у здоровых детей и детей с ПП ЦНС 80
6.3. Корреляционные взаимосвязи между уровнем GFAP в сыворотке:
пуповинной и периферической крови и показателями иммунного апоптоза
лимфоцитов у здоровых детей и детей с ПП ЦНС 83
4
ГЛАВА 7. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 86
ВЫВОДЫ 107
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 108
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 109
і.
5 ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЬЕК СОКРАЩЕНИЙ:
АГ - антиген
АЗКЦ - антителозависимая клеточная цитотоксичность
AT - антитела
ГЭБ - гематоэнцефалический барьер
ЕК - естественные киллеры
ИЛ - интерлейкин
ИФА - иммуноферментный анализ
ИФНу - интерферон у
мАТ - моноклональные антитела
МНК - мононуклеарные клетки
мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота
МТ - металлотионеины
ПП ЦНС - перинатальные поражения центральной нервной системы
ТФР(3 — трансформирующий фактор роста р
Тх - Т-хелпер
ЦИ - церебральная ишемия
ЦНС - центральная нервная система
ЦТЛ - цитотоксический Т-лимфоцит
ФНОа - фактор некроза опухоли а
ФПН — фетоплацентарная недостаточность
Вс1-2 - В-клеточной лейкемии/лимфомы подобный протеин
CD - кластер дифференцировки
Fas - синтетаза жирных кислот
FasL - лиганд Fas
sFasL - растворимая форма FasL
FITC - флюоресцеин изотиоционат
GAPDH - глицеральдегидфосфатдегидрогеназа
GFAP — глиофибриллярный кислый протеин
PBS - фосфатный буфер
p53 - белок 53
PI - пропидиум иодид
РЕ - фикоэритрин
RT-PCR — полимеразная цепная реакция в режиме реального времени
Введение к работе
На современном этапе доказана тесная взаимосвязь иммунной и нервной систем, направленная на поддержание постоянства внутренней среды организма (23). Нарушение этого взаимодействия ведет к развитию ряда заболеваний (23). Особенно актуальной проблема изучения взаимосвязи между нервной и иммунной системами является для новорожденных в условиях постнатальной адаптации (15, 23, 91, 92, 133), поскольку перинатальные поражения ЦНС занимают одно из ведущих мест в структуре заболеваний новорожденных (2, 7, 54). Более того, они являются частой причиной детской инвалидности (54). При этом заболевания нервной системы, приводящие к инвалидизации и дезадаптации детей, в 70-80% случаев обусловлены воздействием перинатальных повреждающих факторов (2). Одним из таких факторов является хроническая внутриутробная гипоксия, развивающаяся вследствие целого ряда осложнений беременности (18, 49, 50). Известно, что гипоксия инициирует запуск каскада патологических процессов, развитие которых в течение определенного промежутка времени может приводить с одной стороны, к гибели нервных клеток путем апоптоза (54), а с другой вызывать различные иммунологические сдвиги (137).
У новорожденных с перинатальными поражениями ЦНС изменения иммунологических показателей связаны как с нарушением регуляции иммуногенеза, так и с непосредственным влиянием гипоксии на состояние иммунной системы (137). Проведенные ранее исследования иммунологических параметров периферической крови детей с ПП ЦНС, свидетельствуют об изменении показателей клеточного, гуморального и врожденного иммунитета, усилении процессов активации клеток иммунной системы, повышении ряда провоспалительных цитокинов (4, 9, 15, 16, 26, 32, 38, 45, 46, 47). Однако лишь единичные работы описывают особенности иммунологических показателей в зависимости от степени тяжести 1111 ЦНС (4, 26).
8 В последние годы значительное количество работ посвящено изучению
нейронального апоптоза в экспериментах на животных (72, 87, 147, 205),
однако, практически отсутствуют исследования, посвященные изучению
апоптоза лимфоцитов у новорожденных детей с перинатальными
гипоксическими поражениями ЦНС. Поэтому представляет интерес изучение
апоптоза пуповинных и периферических лимфоцитов, в частности,
обладающих цитотоксической активностью, у детей с ПП ЦНС различной
степени тяжести.
Становление иммунной системы детей в периоде новорожденности в значительной степени связано с особенностями течения беременности у их матерей (18, 25, 30, 35, 53). По данным некоторых авторов, длительное воздействие антенатальных повреждающих факторов на плод, приводит к нарушению иммунобиологических взаимодействий в системе мать-плацента-плод, изоиммунозации организма матери и антигенной стимуляции организма плода, связанной с повышенной проницаемостью плаценты при хронических патологических состояниях матери (54). Это ведет к нарушению становления нейроэндокринной регуляции и иммунного гомеостаза новорожденного (54). В частности, известно, что такое осложнение беременности как гестоз, не только часто приводит к формированию фетоплацентарной недостаточности, но и сопровождается выраженными нарушениями локального иммунного ответа на уровне плаценты (35, 44, 53).
В связи с этим, особую актуальность приобретает исследование апоптоза лимфоцитов и его эндогенной регуляции не только у детей с ПП ЦНС, но и у женщин на уровне плаценты.
Недостаточно изученными также остаются эндогенные факторы, направленные на ограничение и восстановление очагов поражения нервной ткани. Изучение этих особенностей позволит уточнить механизмы формирования ПП ЦНС различной степени тяжести у новорожденных и разработать новые методы ранней диагностики ПП ЦНС.
9 Цель работы: установить роль механизмов апоптоза лимфоцитов с
цитотоксической активностью и его эндогенной регуляции, в формировании
перинатальных гипоксически-ишемических поражений ЦНС у доношенных
новорожденных и разработать критерии ранней диагностики степени тяжести
ППЦНС.
Задачи:
Охарактеризовать основные параметры Fas-зависимого апоптоза лимфоцитов с цитотоксической активностью и его эндогенной регуляции на уровне децидуальной оболочки (ДО) плацент женщин, в пуповинной и периферической крови у доношенных новорожденных с перинатальными гипоксически-ишемическими поражениями ЦНС (1111 ЦНС).
Дать сравнительную характеристику содержания GFAP в сыворотке пуповинной и периферической крови к концу 1-го месяца жизни у здоровых новорожденных и детей с гипоксически-ишемическими 1111 ЦНС.
Оценить экспрессию мРНК МТ-1 в лимфоцитах пуповинной и периферической крови к концу первого месяца жизни у здоровых детей и новорожденных с гипоксически-ишемическими ПП ЦНС.
Установить наличие взаимосвязи у здоровых детей и детей с гипоксически-ишемическими ПП ЦНС между уровнем GFAP, ИЛ-6, экспрессией мРНК МТ-1 в лимфоцитах и параметрами апоптоза в пуповинной и периферической крови к исходу 1-го месяца жизни.
Разработать критерии ранней диагностики степени тяжести гипоксически-ишемических перинатальных поражений ЦНС.
Научная новизна исследования:
Определены впервые особенности апоптоза лимфоцитов с цитотоксической активностью и его эндогенной регуляции при перинатальных гипоксически-ишемических поражениях ЦНС начиная с антенатального периода.
10 Установлено, что нарушения регуляции апоптоза лимфоцитов с
цитотоксической активностью в децидуальной оболочке плаценты различны
при легкой и средней степени тяжести 1111 ЦНС, и характеризуются при легкой
степени — снижением уровня ФНОа, при среднетяжелых — повышением
содержания sFasL и Вс1-2 в экстрактах децидуальной ткани.
Показано, что у новорожденных с 1111 ЦНС легкой степени тяжести происходит параллельное усиление экспрессии Fas-АГ и FasL на поверхности пуповинных ЦТЛ и ЕК, а при средней степени тяжести они снижаются.
Впервые выявлено, что снижение содержания CD56+CD95L+ лимфоцитов в пуповинной крови является ранним диагностическим критерием легкой степени тяжести, а повышение — критерием гипоксически-ишемических 1111 ЦНС средней степени тяжести.
Установлено, что в основе блокирования запуска апоптоза лимфоцитов с цитотоксической активностью при гипоксически-ишемических ПП ЦНС средней степени тяжести лежит усиление экспрессии ими мРНК МТ-1 и значительное повышение уровня ИЛ-6 в пуповинной крови.
У здоровых детей и детей с перинатальными гипоксически-ишемическими поражениями ЦНС различной степени тяжести впервые выявлены корреляционные связи между показателями иммунного апоптоза и уровнем ИЛ-6, GFAP и экспрессией мРНК МТ-1 в лимфоцитах, причем их количество, характер и сила различны.
Установлено, что уровень GFAP повышается в пуповинной крови и нормализуется в периферической крови к концу 1 -го месяца жизни при легкой степени тяжести ПП ЦНС, тогда как при средней степени тяжести уровень GFAP в пуповинной крови не отличается от аналогичного показателя здоровых новорожденных, и возрастает к исходу первого месяца жизни в периферической крови.
Показано, что к концу первого месяца жизни у детей с гипоксически-ишемическими ПП ЦНС независимо от степени тяжести происходит
нормализация показателей апоптоза лимфоцитов с цитотоксической активностью.
Практическая значимость работы:
Получены новые данные об участии иммунных механизмов в формировании перинатальных гипоксически-ишемических поражений ЦНС у новорожденных.
На основании исследования иммунологических показателей разработан новый способ ранней диагностики степени тяжести перинатальных гипоксических поражений ЦНС у новорожденных детей (приоритетная справка № 2007134504 от 18.09.2007).
Параметры апоптоза лимфоцитов с цитотоксической активностью и регулирующие их факторы могут быть использованы для оценки степени тяжести гипоксически-ишемических поражений ЦНС у новорожденных.
Положения, выносимые на защиту:
Формирование перинатальных гипоксически-ишемических поражений ЦНС происходит на фоне нарушения апоптоза лимфоцитов- с цитотоксической активностью и механизмов его регуляции на уровне плаценты, при этом степень тяжести церебральной ишемии у новорожденных зависит от характера изменений процесса запрограммированной клеточной гибели лимфоцитов децидуальной оболочки плаценты.
У новорожденных ПП ЦНС легкой и средней степени тяжести также ассоциируются с различными нарушениями апоптоза лимфоцитов с цитотоксической активностью, которые зависят от уровня экспрессии мРНК МТ-1 в лимфоцитах и сывороточного содержания ИЛ-6 в пуповинной крови.
Иммунологические параметры могут использоваться для ранней диагностики перинатальных поражений гипоксически-ишемических ЦНС легкой и средней степени тяжести.
Реализация результатов работы:
Результаты диссертационной работы внедрены в практику акушерской клиники ФГУ «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и
12 детства имени В.Н. Городкова Федерального агентства по
высокотехнологичной медицинской помощи».
Апробация работы:
Диссертация прошла апробацию на заседании Ученого Совета ФГУ «Ивановский НИИ материнства и детства им. В.Н.Городкова Росмедтехнологий» 10 сентября 2007 года. Основные материалы и положения диссертации доложены и обсуждены на Республиканской конференции «Иммунология репродукции» (Иваново, 2005 г.), на областной конференции молодых ученых «Молодая наука — развитию Ивановской области» (Иваново, 2005 г.), на IX и X Всероссийском научном Форуме им. В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2005 г., 2006 г.), на научно-практической конференции студентов и молодых ученых ИвГМА «Неделя науки - 2006» в рамках областного фестиваля «Молодая наука -развитию Ивановской области» (Иваново, 2006 г.), на конференции «Иммунодиагностика и иммунотерапия» (Курск, 2006 г.), на 2-ой Республиканской конференции «Иммунология репродукции: теоретические и клинические аспекты» (Сочи, 2007 г.), на Международном симпозиуме «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и при патологии» (Санкт-Петербург, 2007 г.).
По материалам диссертации опубликовано 22 печатных работ.
Структура и объем диссертации:
Материалы диссертации изложены на 131 странице машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», 4 глав собственного исследования, главы «Обсуждение результатов», выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, включающего 211 источник отечественных и зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 15 рисунками и 18 таблицами.
