Введение к работе
Актуальность темы.
В структуре перинатальной заболеваемости и смертности большой удельный вес имеет наследственные ферментопатии.Одна из них - недостаточность 21-гидроксилазы (21-0Н) возникает в результате снижения активности фермента, участвующего в процессе синтеза кортизола корой надпочечников, и является в 95Z причиной врожденной гиперплазии коры надпочечников (ВГКН), или адрено-генитального синдроаа.
Недостаточность 2I-0H - вироко распространенная аутосои-но-рецессивная ферментопатня.так как высокая частота гетерозиготного носительства мутантних генов 2І-0Н 1/30-1/100 сопровождается и высокой частотой рождения больных детей 1/5000-1/15000 (New H.,Leuine L.S.,1984). Риск рождения больного ребенка в семье, где оба родителя - носители мутантного гена, составляет 25Z.
Кора надпочечников,являясь составной частьв системы,которая обеспечивает защитно-приспособительные реакции на стресс и регулирует гестационные процессы,у женщин играет важную роль в становлений и функции репродуктивной системы. Дисфункция коры надпочечников у них сопровождается нарушением половой диффе-ренцировки, дисфункцией яичников, невынашиванием беременности, бесплодием (Либерман Л.Л.,1966;Соффер Л.С.соавт.1956;1уковский Н.А.,1971;Гаспаров А.С.,1985;ЛяжкоЕ.С.,1985;Раисова А.Г.,1990)
Главной особенностью этой ферментопатии является выраженный клинический полиморфизм и сходство симптоматики с большим количеством заболеваний из-за чего своевременная диагностика крайне затруднена. Заболевание проявляется как тяжелыми,
классическими формами, так и мягким, и даме бессимптомным течением. Тяжелые формы заболевания, сольтеряпцая и вирильная. развиваются уже во внутриутробном периоде. Они сопровождаются расстройствами минерального обмена.и у девочек нарувениями половой дифференцировкн . Главная особенность мягких форм заболевания - это расстройства функции репродуктивной системы у яенщин,время появления которых строго не фиксировано.
Несмотря на больмую истории изучения в нажей стране ВГКН. обусловленной недостаточностью 21-ОН, и раннюю манифестацию этого заболевания у девочек (неправильное строение наружных половых органов), диагностика его у новорожденных крайне низка и несвоевременна.В результате нажих предварительных исследований установлено.что пренатальная смертность при сольтеряюией форме ВГКН очень высока и составляет 75%. Поздняя диагностика вирильной формы среди девочек нладвего возраста 4-5 лет составляет 40.0Z. Я девочек пубертатного и юножеского возраста - 16.6% (Дзенис И.Г. с соавт.1990). Использование старых методов определения метаболитов стероидных гормонов в моче оказывается малоэффективным для диагностики мягких форм заболевания (New M.,Levine L.S.,1984),поэтому клиническая картина этих форм недостаточно изучена.Отсутствуют данные о влиянии гетерозиготного носительства нутаций на функцию репродуктивной системы женминн.
Профилактика ВГКН в навей стране, по существу,отсутствует. Медико-генетическое консультирование ограничивается линь констатацией факта наличия высокого генетического риска повторного рождения больного ребенка у супругов, в семье которых уже имеется больной с ВГКН.
Благодаря изучении биосинтеза гормонов надпочечников было установлено,что основная роль фермента 21-гидроксилазы состоит в окислении предшественника нортипола 17 оксипрогестсрона (17 01!) (йдаев II.й. .1901 ;Finkclstein Н.с соавт. 1979 и др.) Снижение активности фермента сопровождалось повышением концентрации гормона в крови,благодаря чему 17-0П стали рассматривать как патогенетический маркер недостаточности 21-ОН (Ней H.,Levine L.S.,1984).Однако использовать его для диагностики БГКН стало возможно только с внедрением в практику унифицированных радиоиммунологических методов.Практическое применение этого маркера натолкнулось на трудности при диагностике недостаточности 21-ОН у женщин (Hauseth R.S.c соавт.1980).
Установление факта сцепления гена 21-ОН с генами большого комплекса гистосовместимости HLfl (Duppont'S.c соавт.1977),позволило продукты генов HLfl - антигены HLft рассматривать как им-нуногенетические маркеры гена 21-ОН и его мутантних аллелей. Эти маркеры обладают рядом специфических свойств .которые следует учитывать при их применении. Основным условием для их клинике генеалогического использования является наличие больного і! семье.фенотип III.А которого является ключом,так как обе хромосомы содержат мутаипше гены. Успех популяционного поиска мутантних аллелей гена 21-01! при использовании зтих маркеров зависит от этнической однородности популяции.так как каждая популяция имеет свой специфический набор антигенов Hl.ft (Зарец кая Ю.М..1Ш:Минаев М..1Э83).
Применение молекулярно-генетических методов обнаружило различие в длине фрагментов ДНК у болышх и здоровых индивидов.что позволило рассматривать эти фрагменты.как генетичес
кие маркеры.Исследования обнаружили специфику распространения мутаций гена 21-ОН среди больных с ВГКН,принадлежащих к разным этническим группам (White Р.С.с соавт..1Э92;Раг1епеп J..1989).
Внедрение инвазивннх методов способствовало осуществлению лренатальной диагностики (Pang S.c соавт.1980;Sippell Н.,1981).
ЦЕЛЫ) настоящей работы являлась разработка современной системы диагностики недостаточности 21-ОН с использованием фе-нотипических маркеров.поиск и выявление частоты и структуры мутантных аллелей гена 21-ОН.определение путей профилактики.
ЗАДАЧАМИ исследования являлись:
-
Изучение особенностей функции репродуктивной системы женщин-гетерозиготннх носительниц мутантных аллелей 21- гид-роксилазы.
-
Изучение функционального состояния коры надпочечников у женщин с различным уровнем недостаточности 21-гидроксилазы в различные периоды ее физиологической активности.
.3. Поиск мутантных аллелей гена 21-гидроксилазы в семьях с классическими формами ВГКН путем исследования фенотипов HLA.
-
Изучение структуры мутантных аллелей гена 21-гидрокси-лазы в семьях с ВГКН.
-
Изучение возможностей лренатальной диагностики недостаточности 21-гидроксилазы с помощью гормональных,иммуноге-нетических и генетических маркеров в семьях с ВГКН.
НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ Исследование уровней 17—ОП в крови - Патогенетического маркера недостаточности 21-ОН показало, что измерение базальних концентраций дает возможность диагностировать все клини-
чески выраженные формы ВГКН.
Диагностика субклинических форы заболевания возможна только с помощью пробы с ЙКТГ для чего разработан оригинальный метод пробы.Установлена частота латентной формы ВГКН среди гетерозиготных носителей (8%) и частота гетерозиготного носи-тельства и ВГКН с поздним началом среди девочек с ранним адре-нархе (64% и 5% соответственно).
Остановлено, что гетерозиготное носительство мутантного гена 2І-0Н влияет на репродуктивную функцию женщины, вызывая функциональные расстройства при различных ситуациях, связанных с активизацией надпочечников.
Установлена возможность диагностики недостаточности 21-ОН у плода в I триместре беременности с помощью патогенетического маркера - 17-ОП.Эффективность гормональнрго метода диагностики составила 97,8%. Результаты пренатальной диагностики заболевания в I и II триместрах совпали в 100%.
На основании исследования концентраций 17-ОП в крови женщин,в семьях которых рождались дети с ВГКН, беременных здоровым или больным плодом, предложено использовать этот маркер для скрининга беременных с целью проспективного выявления недостаточности 21-ОН у плода.
Изучение характеристики мутаций обнаружило новую, ранее неизвестную мутацию, вызывающую летальные формы ВГКН и сцепленную с гаплотипом HLfl В14. Эта мутация встречается с высокой частотой (45.?%) среди славянского населения СНГ. Второй по частоте мутацией (37.2%). вызывающей также летальные формы заболевания, является европейская мутация HLfl A3 В47.
На основании изучения мутаций, характера их сцепления с'
- б -
антигенами разработаны показания для пренатальной диагностики недостаточности 21-ОН методами исследования ДНК в беспробандных семьях.
На основании комплексного изучения недостаточности 2і—ОН с помощью маркеров разработан алгоритм диагностики этой патологии, включающий пренатальний и селективный скрининг. Применение его в акушерско-гинекологической практике позволит обнару-яить лиц с различной степенью недостаточности 21-ОН среди женщин с расстройствами репролуктивной системы, новорожденных и плодов.
Разработано в полном об'єме медико-генетическое консультирование недостаточности 21-ОН, включающее диагностику носи-тельства мутантних аллелей гена 21-ОН и пренатальную диагностику,что является основой целенаправленной профилактики этой патологии.
-
Наличие в генотипе индивида мутантних аллелей гена 21-ОН всегда сопровождается дисфункцией кщш н.иппчичникпн, которая и женцин фснотиничкски проявляется в !;идс нарушений репродуктивной функции. Поэтому женщин-гетерозиготных носителей мутантних аллелей гена 21-ОН следует относить к группе высокого риска по возникновению осложнений в системе репродукции, особенно в период ее становления и при беременности. Осложнения течения беременности и повышение концентрации 17-ОП в крови у гетерозиготных носителей является.прогностическим признаком наличия ВГКН у плода.
-
В семьях- славянского происхождения с классическими
формами ВГКН наряду с общеизвестными мутациями, обнаруженными в Европе, широко распространена ранее неизвестная мутация, сцепленная с геном HLfl В14. Использование метода количественной амплификации позволяет обнаружить эти мутации как в гомо-, так и в гетерозиготном состоянии, а также производить пренатальную диагностику в беспробандных семьях.
3. Возможность определения 17-ОП в ні в 1-ом триместре, концентрации которого отражавт активность фермента 2і-ОН, позволяет диагностировать ВГКН у плода в ранние сроки беременности. Надежность диагностики при использовании 17-ОП прямо пропорциональна тяжести заболевания.
Результаты исследования внедрены в работу отделений и лабораторий Научного центра акумерства.гинекологии и перинатоло-гии РАМН;основные положения изложены в методических рекомендациях "Пренатальная диагностика врожденной и наследственной патологии плода" ИЗ РФ.
Основные положения работы доложены на 6-ом Европейском Конгрессе по акуиерству и гинекологии, Москва, иаль 1991; на 24-ом Съезде Европейского общества по генетике человека,Дания,Зльсинор. май 1992; на 25-ом Съезде Европейского общества по генетике человека, Испания, Барселона, май 1993; на Научной конференции по эндокринологии, посвященной памяти академика А.Н.Пдаева, Москва, декабрь 1993; на конференциях "Геном чело-века-93" и "Геном человека-94", Черноголовка,март 1993,1994;на на Первом (третьем) Российском Съезде медицинских генетиков.
Москва,декабрь 1994;на межклинической конференции НЦЙГиП РАНН. Диссертация обсуждена на заседании апробационной комиссии при Ученом Совете НЦЙГиП РАМН 19 декабря 1994 г.
СТРУКТУРА И ОБЪЕЫ ДИССЕРТАЦИИ Диссертация изложена на 201 страницах машинописного текста,состоит из введения,обзора литературы,4-х глав собственных исследований,обсуждения,выводов,практических рекомендаций, списка используемых источников, приложения, содержит 12 рисунков и 27 таблиц.Указатель литературы включает 31 отечественных и 110 иностранных источников.
