Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Молекулярные и генетические факторы регуляции гомеостаза в плаценте (обзор литературы) 11
1.1 Генетические полиморфизмы факторов, влияющих на процессы коагуляции и их
роль в формировании невынашивания беременности и плацентарной недостаточности 11
1.1.1. Резистентность к активированному протеину С и полиморфизм V фактора 12
1.1.3 Гипергомоцистепиемия и полиморфизм MTHFR 14
1.1.4 VII фактор свертывания крови 16
1.1.5 Полиморфизм гена gpllla 18
1.1.6 Ингибитор активатора плазминогена 1 -PAI-1 20
1.2 Молекулярные механизмы регуляции гомеостаза в плаценте и их нарушения при патологии беременности 21
1.2.1 Белки клеточного матрикса 22
1.2.2 Цитокины ихемокины 23
1.2.3 Факторы-регуляторы ангиогенеза 34
1.2.5 Система фермента гемоксигеназы 44
1.2.6 Система активаторов плазминогена 45
ГЛАВА 2. Материалы и методы 47
2.1 Объекты исследования 47
2.2 Молекулярно-биологические методы 50
2.2.1 Выделение ДНК из цельной крови 50
2.2.2 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 52
2.2.4 Выделение общей РНК из ткани плацент и постановка обратной транскрипции. 56
2.2.5 ПЦР в реальном времени и интерпретация результатов 58
ГЛАВА 3. Клиническая характеристика обследованных женщин 63
ГЛАВА 4 Результаты проведенных исследований и их обсуждение... 71
4.1 Результаты исследования генетических полиморфизмов 71
4.2 Результаты исследования изменений экспрессии генов 95
4.2.1 Данные по экспрессии генов факторов регуляции ангиогенеза 96
4.2.2 Данные по экспрессии генов факторов активаторов/ингибитора плазминогена и TF. 102
4.2.3 Данные по экспрессии генов иммунного ответа и фермента антиоксидантной защиты - гемоксигеназы 106
4.2.4 Данные по экспрессии генов инсулиноподобныхростовых факторов и лептина. 113
Выводы 116
Список литературы 118
Приложение 147
- Резистентность к активированному протеину С и полиморфизм V фактора
- Система активаторов плазминогена
- Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
- Результаты исследования генетических полиморфизмов
Введение к работе
Актуальность исследования 3
Цель исследования 6
Задачи исследования 6
Научная новизна 7
Практическая значимость 7
Основные положения, выносимые на защиту: 8
Апробация работы, внедрение результатов работы в практику 9
Структура и объем диссертации 10
Резистентность к активированному протеину С и полиморфизм V фактора
Распространенность данного полиморфизма в белой популяции составляет 4-5%, при почти полном отсутствии в популяциях азиатов и африканцев [120]. В российской популяции распространенность G1691A полиморфизма составляет 3,2% [3].
Риск развития тромбозов у носителей этой мутации выше в 7 раз у гетерозиготных носителей и в 80-100 раз при гомозиготной форме [142]; [212]. Влияние этой мутации на формирование венозных тромбозов является общепризнанным [249].
Также существуют данные о взаимосвязи между носительством данного полиморфизма и формированием НБ. По данным мета-анализа относительный риск формирования привычного невынашивания беременности при носитель-стве полиморфизма V фактора может составлять от 2.0 до 3,5 [206]. Таким образом, влияние данного полиморфизма на формирование НБ не подвергается сомнению.
Точечная замена в некодирующей области приводит к повышению экспрессии протромбина и тем самым повышает активность свертывающей системы [199]. Частота в полиморфизма в белой популяции составляет 1-3% [211]. Взаимосвязь этого полиморфизма с венозными тромбозами является установ ленной. Относительный риск развития венозных тромбозов у гетерозиготных носителейсоставляет 2.8-3.8 [199].
Также обнаружена взаимосвязь между носительством данного полиморфизма и формированием НБ. По данным мета-анализа относительный риск развития данной патологии составляет 2-2,5, что свидетельствует о вкладе данного полиморфизма в патогенез НБ [206].
Гипергомоцистениемия и полиморфизм MTHFR Гомоцистеин является промежуточным продуктом цикла метионин -цистатионин. Формирование цистатионина происходит при участии фермента цистатионин - синтазы, которая использует в качестве кофактора витамин В6. Формирование метионина происходит при использовании в качестве кофактора витамина Bi2 и фермента метионин-синтазы, который использует в качестве донора углерода 5-метилтетрагидрофолат. 5-метилтетрагидрофолат синтезируется при участии фермента метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR) (рис.3).
Снижение активности этих ферментов, а следовательно, накопление гомоцистеина, может происходить в результате дефицита фолатов, витамина В]2, витамина В6, а также в связи с увеличением возраста, менопаузой, а также с другими системными заболеваниями (почечная недостаточность, заболевания печени) [90]; [244].
В последнее время появляется все больше данных, указывающих на независимое участие гипергомоцистеинемии в акушерской [187]; [180], сердечнососудистой патологии [44] и венозном тромбоэмболизме [73]. Предполагаемый патофизиологический эффект гипергомоцистеинемии включает повреждение эндотелия и его дисфункцию, активациию тканевого фактора и последующую активацию каскада тромбообразования [244]. При нормальном уровне гомоци-стеина продуцируемый эндотелием оксид азота связывается с гомоцистеином в присутствии кислорода с образованием мощного вазодилататора и антиагреган-та - S-нитрозогомоцистеина, имеющего период полужизни около 15 минут. При гипергомоцистеинемии часть неинактивированного гомоцистеина вызывает оксидативное повреждение эндотелия, приводящее к снижению продукции оксида азота (N0) [63]. Снижение экспрессии эндотелиальной N0 синтазы или прямая деградация N0 связаны с повышенным перекисным окислением липи-дов, что способствует развитию эндотелиальной дисфункции.
В 1995 году Frosst и соавт. описали частый полиморфизм, заключающийся в замене цитозина на тимин в 677-м положении гена, кодирующего MTHFR, фермент, участвующий в метаболизме гомоцистеина. В результате этого происходит замена Glu на Ala в первичной структуре белка, что в свою очередь приводит к образованию термолабильного и менее активного варианта фермента [85]. Данный полиморфизм обнаруживается у 5-15% белого населения и приблизительно с той же частотой среди населения Японии [72]. В популяции Санкт-Петербурга, согласно данным Ельчанинова А.П. и соавт.(2000), гомозиготы по данному полиморфизму встречаются с частотой 3,6%, а в Северо-Западном регионе РФ частота встречаемости гомозиготного носительства Т ал-леля (ТТ генотип) и гетерозиготного (СТ генотип) составляет 8,4% и 33,6% соответственно [3]. Носительство гомозиготного генотипа 677ТТ коррелирует с повышением гомоцистеина в плазме крови. Однако обнаружено, что уровень гомоцистеина находится в строгой зависимости от концентрации фолатов и их введение может изменять уровень гомоцистеинемии даже у гомозиготных носителей [132], что дает возможности для профилактики состояний, связанных с избытком гомоцистеина.
По данным мета-анализа повышение относительного риска развития венозных тромбозов при наличии гомозиготного генотипа 677ТТ является небольшим, но статистически высоко достоверным (OR=1.2-1.5) [203]
К настоящему времени в литературе представлены многочисленные экспериментальные данные, свидетельствующие в пользу взаимосвязи носи-тельства полиморфизма С677Т с предрасположенностью к развитию НБ [237], [158], [180]. Однако авторы ряда работ этой связи не обнаруживают [123], [195], [163].
Фактор VII - неактивный витамин К-зависимый профермент, синтезируемый в печени и секретируемый в виде одноцепочечного гликопротеина молекулярной массой 50 кДа. При связывании с тканевым фактором он превращается в двухцепочечную активную форму посредством селективного протеолиза факторами Ха или комплексом VIIa/тканевой фактор, и затем активирует факторы X и XI (рис.4). Активация VII фактора свертывания крови, происходящая в результате его контакта с тканевым фактором, имеет место при повреждении эндотелия [235]. Вследствие ключевого расположения в коагуляционном каскаде, VII фактор может играть важную роль в патогенезе тромбозов.
Система активаторов плазминогена
Гемоксигеназа (НО) - фермент, осуществляющий распад гема до моно-ксида углерода (СО), биливердина и свободного железа. Известно 3 изоформы фермента: НО-1, НО-2 и НО-3. НО-1 также известна, как белок теплового шока 32 (hsp32) и индуцируется различными стрессовыми воздействиями, включая гипоксию. НО-2 постоянно экспрессируется в тканях. Про активность НО-3 и о том, как эти 3 изоформы фермента взаимосвязаны и влияют на общую активность НО в клетке, пока известно очень мало [151]. Существуют противоречивые данные об уровне экспрессии этих белков в ответ на стрессовое воздействие и гипоксию. Так, было показано на культуре клеток различных тканей повышение экспрессии НО-1 как на уровне белка, так и мРНК в условиях гипоксии [89]; [109]; [192]. Напротив, в исследовании Nakayama М и соавт.(2000) было показано снижение экспрессии НО-1 под воздействием гипоксии [183]. Известно, что СО обладает свойствами вазодилататора, нейротрансмиттера, а также ингибитора агрегации тромбоцитов. Биливердин в дальнейшем метабо- лизируется в билирубин; оба этих вещества обладают свойствами антиоксидан-тов и обладают цитопротективным эффектом [166]. В связи с этим большой интерес представляют данные об уровне экспрессии НО в плацентах в норме и при различных патологиях беременности. Известно, что НО-1 и НО-2 синтезируются в плацентах на протяжении всего срока гестации. СО играет важную роль в регуляции объема перфузии, роста трофобласта, трансформации спиральных артерий [161]. В исследовании Appleton и соавт. на культуре клеток ворсин хориона было показано снижение экспрессии НО-1 в условиях гипоксии [24]. На культуре эндотелиальных клеток, выделенных из плацент с нарушенной гемодинамикой (преэклампсия, задержка роста плода) наблюдали снижение экспрессии НО-2 [34]; [241]. В экспериментах на мышах было показано снижение экспрессии НО-1 и НО-2 в фетоплацентарных тканях мышей с выкидышами по сравнению с нормой. Авторы также высказали предположение о возможном использовании фермента, как мишени для терапевтического воз действия [251]. Интересно также привести данные Kreiser D и соавт.(2002), которые в экспериментах на крысах показали взаимосвязь снижения активности НО-1 и развитием задержки развития плода, причем при восстановлении функции фермента размеры плода достигали физиологической нормы. Этими же авторами было показано модулирующее влияние НО на IGFBP-1 и VEGF, что, возможно, является одним из патогенетических путей задержки роста плода [145].
Активаторы плазминогена представляют собой сериновые протеазы, способствующие превращению плазминогена в активное вещество плазмин. Плаз-мин является медиатором протеолитических процессов, таких как фибринолиз, метастазирование, овуляция, имплантация. У человека известно 2 вида активаторов плазминогена (РА)- тканевой (tPA) и урокиназный (иРА), а также специфические ингибиторы активаторов плазминогена (PAI) - PAI-I и PAI-II. PAI-I ингибирует tPA и иРА, в то время как PAI-I преимущественно иРА [86]. Множеством авторов подчеркивается важная роль факторов активаторов плазминогена в процессах децидуализации и созревания плаценты, а также регуляции процессов фибринолиза. На культуре клеток эндометрия было показано, что в процессе децидуализации происходит значительное повышение экспрессии иРА, но не меняется экспрессия tPA. В дальнейшем, в экспериментах in vivo наблюдали повышенную экспрессию иРА в тканях эндометрия в период децидуализации [240]. Также было обнаружено, что PAI-I и PAI-II секретируются в фето-плацентарных тканях на протяжении всего срока гестации и уровень их экспрессии увеличивается со сроком беременности, а уровень иРА соответственно уменьшается [126]. Solberg и соавт. (2003) наблюдали существование положительной корреляции протеаз активаторов плазминогена и матриксных ме-таллопротеиназ, которые являются важными регуляторами ангиогенеза [224]. Таким образом, активаторы плазминогена и их ингибиторы помимо влияния на систему фибринолиза, играют огромную роль в процессах ремоделирования тканей и действуют как протеазы наряду с матриксными металлопротеиназами и влияют как на процессы децидуализации, так и на инвазию и васкуляризацию трофобласта.
Таким образом, основываясь на данных как российских, так и зарубежных авторов, можно заключить, что регуляция процесса плацентации является сложным механизмом, в котором задействовано большое число молекулярных единиц. Эти данные являются пока лишь штрихами в многообразной картине всех процессов, происходящих в тканях маточно-плацентарного комплекса. Необходимы дальнейшие исследования, которые помогут выявить более полный спектр регуляторных взаимодействий, что, в свою очередь, позволит найти новые подходы к вопросам этиологии и патогенеза плацентарной недостаточности.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
В соответствии с поставленными задачами, для исследования взаимосвязи генетических полиморфизмов V фактора, MTHFR, GPIIIa, VII фактора, PAI-1 и НБ, нами было обследовано ПО женщин с клиническими признаками угрозы прерывания беременности (1 группа) и 360 доноров русской этнической принадлежности (2-я группа, контрольная) для выявления популяционных частот исследуемых полиморфизмов.
Полученные значения частот генотипов в контрольной группе сравнивались со значениями, рассчитанными на основании закона Харди-Вайнберга. В табл.10 представлены частоты изучаемых аллелей в группе доноров в сопоставлении с расчетными значениями.
Как следует из представленных в данных, частоты аллелей в группе 2 (доноров) не отличались от расчетных, согласно закону Харди Вайнберга (р=0.98), что свидетельствовало о возможности использования частот генотипов, полученных в группе доноров, как значений популяционных частот. У женщин 1 группы с угрозой прерывания беременности были определены частоты аллелей исследуемых полиморфизмов V фактора, MTHFR, GPIIIa, VII фактора, PAI-1, их значения сравнивались с аналогичными значениями частот во 2-й группе (популяционной частотой). Значения частот аллелей V фактора, MTHFR, GPIIIa, VII фактора, PAI-1 в группе женщин с угрозой прерывания беременности (группа 1) и группе доноров (2 группа) представлены в табл.11. Как следует из табл.11, в группе женщин с угрозой прерывания беременности не было найдено отличий по частоте аллелей исследуемых генов по сравнению с популяционными значениями. Таким образом, нам не удалось показать влияния изучаемых генетических полиморфизмов в механизме выкидыша среди пациенток 1 группы с угрозой прерывания беременности. Более детальный анализ анамнестических данных и ретроспективная оценка исходов настоящей беременности позволили нам среди 110 пациенток 1 группы выделить несколько подгрупп. Во-первых, среди пациенток 1 группы с угрозой прерывания беременности был высокий процент пациенток с различными воспалительными гинекологическими заболеваниями, наличие которых могло быть самостоятельным фактором, способствующим формированию сим-птомокомплекса невынашивания беременности и на фоне действия этого фактора, вклад генетических факторов оказывался менее значимым. Таким образом, 110 женщин исследуемой группы были разделены на 2 подгруппы: женщины с наличием воспалительных гинекологических заболеваний, как наиболее распространенного в данной группе фактора риска невынашивания беременности - 72 пациенток; женщины без сопутствующей воспалительной гинекологической патологии-38 пациентки; Во-вторых, среди пациенток 1-й группы встречались пациентки, у которых, несмотря на угрожающий выкидыш, удалось сохранить беременность. Таким образом, были выделены подгруппы, в одной из которых была потеря либо настоящей, либо предыдущих беременностей, т.е. были самопроизвольные выкидыши или неразвивающаяся беременность, а в другой не было ни одного неблагоприятного исхода как настоящей, так и предыдущей беременностей: женщины без неблагоприятных исходов беременности, которым удалось сохранить данную беременность и родить здорового ребенка, и которые не имели выкидышей/замершей беременности в анамнезе -32 пациентки; женщины с наличием неблагоприятных исходов в анамнезе. В эту группу вошли женщины, у которых либо настоящая беременность, либо предыдущие завершились самопроизвольными выкидышами либо имелась неразвивающаяся беременность- 78 пациенток.
В вышеуказанных подгруппах женщин был проведен анализ частот изучаемых полиморфизмов С677Т MTHFR, Р1А1/А2 GPIIIa, 4G/5G PAI-1. Вследствие малочисленности пациенток с носительством полиморфизма V фактора, анализ частоты данного полиморфизма в подгруппах не проводился.
Результаты исследования генетических полиморфизмов
Исходя из представленных данных, можно отметить, что при неблагоприятном сочетании 2-3-х генотипов, относительный риск формирования невынашивания беременности повышается в 3 раза, тогда как при 1 неблагоприятном генетическом факторе относительный риск составлял всего лишь 1,3-2,2.
Частота полиморфизмов исследованных генов во всей группе женщин с угрозой прерывания беременности не отличалась от популяционной частоты полиморфизмов, что несомненно указывало на то, что данные полиморфизмы не являются обязательными причинными факторами спорадических потерь беременности. Учитывая этот факт, мы провели более детальное исследование частоты генетических полиморфизмов в зависимости от особенностей гинекологического анамнеза (наличие воспалительных гинекологических заболеваний) и паритета обследованных женщин (наличие выкидышей в предыдущей или настоящей беременности).
При разделении обследованных женщин на подгруппы в зависимости от наличия воспалительных заболеваний репродуктивной сферы, как одного из ведущих факторов риска невынашивания беременности, мы обнаружили ассоциацию FIB с двумя полиморфизмами: С677Т MTHFR и R353Q VII фактора свертывания крови. Влияние данных полиморфизмов, а также полиморфизма Р1А1/Р1А2 GPIIIa было выявлено в группе женщин с неблагоприятными исходами беременности в анамнезе (выкидыши или неразвивающаяся беременность в данную беременность или в течение предыдущих беременностей) по сравнению с группой женщин, у которых не наблюдалось ни одного случая прерывания беременности.
Полиморфизм С677Т MTHFR и гипергомоцистеинемия по многочисленным данным литературы являются самостоятельным фактором риска тром-бофилии. Повреждающее действие гомоцистеина на эндотелий и последующая эндотелиальная дисфункция являются ведущим патогенетическим механизмом, который приводит к формированию венозных и артериальных тромбозов, сердечно-сосудистой и акушерской патологии [244].
В данном исследовании мы подтвердили негативное влияние гомозиготного носительства аллеля 677Т на формирование угрозы прерывания беременности, а также его неблагоприятное прогностическое значение при начавшемся выкидыше. Это подтверждает данные о том, что гомозиготный генотип связан с максимальным повышением уровня гомоцистеина в плазме крови [132]. Наши результаты совпадают с данными других исследователей о влиянии данного полиморфизма на формирование привычного невынашивания [180].
Полиморфизм R353Q VII фактора свертывания крови приводит к снижению концентрации этого белка в плазме крови и тем самым ослаблению активности каскада тромбообразования по внешнему пути свертывания. Это приводит к состоянию частичной гипокоагуляции, которая может иметь протектив-ное влияние в ряде патологий. В литературе имеются данные о протективном влиянии носительства полиморфизма R353Q при ишемической болезни сердца и ее осложнениях. В то же время нам не удалось найти литературных данных о влиянии этого фактора на течение акушерской патологии.
В проведенном исследовании нам удалось выявить протективное влияние гетерозиготного носительства данного полиморфизма на пролонгирование беременности у женщин с угрозой прерывания беременности. Хорошо известно, что тромботические изменения являются одними из основных составляющих в патогенезе невынашивания беременности, в связи с чем, терапия антикоагулянтами является предпочтительной при данной патологии. У женщин, с носитель-ством полиморфизма R353Q VII фактора снижается риск тромботических изменений, в связи с чем, полиморфизм R353Q VII фактора можно рассматривать, как протективный фактор при появлении угрозы прерывания беременности, и последующего формирования симптомокомплекса НБ. Среди обследованных женщин было всего 2 гомозиготных носителя данного полиморфизма, поэтому не представляется возможным сделать аналогичные выводы относительно гомозиготных носителей. В работах, посвященных ассоциации данного полиморфизма и сердечно сосудистой патологии, показано протективное влияние гетерозиготного носительства полиморфизма R353Q VII фактора, и о еще большее протективное влияние гомозиготного генотипа. Среди наших 2-х пациенток с гомозиготным аллелем 353Q мы наблюдали прерывание данной беременности. Одна пациентка страдала кровоточивостью десен, повышенной сосудистой проницаемостью, а также в ее акушерском анамнезе было 5 неудачных беременностей, окончившихся самопроизвольными выкидышами. Другая пациентка также имела в анамнезе 4 самопроизвольных прерывания беременности.
Исходя из этих наблюдений, можно предположить, что чрезмерная гипо-коагуляция, вызванная гомозиготным носительством аллеля 353Q может являться неблагоприятным фактором для протекания беременности. Однако эти данные не поддаются статистическому анализу, в связи с чем, исследование влияния полиморфизма R353Q VII фактора в патогенезе невынашивания беременности остается невыясненной и требует дальнейшего изучения.
Полиморфизм другого фактора PLA1/P1A2 GP Ша является весьма интересным в изучении патологии невынашивания в связи с многообразием эффектов данного белка. GP Ша, также известный как рЗ-интегрин, является компонентом рецептора фибриногена - гликопротеина ПЬ/Ша - на поверхности тромбоцитов. Носительство аллеля Р1А2, особенно в гомозиготной форме, приводит к изменению конформации белка и тем самым повышает сродство этого рецептора к фибриногену. Это в свою очередь проводит к повышенному тромбообра-зованию. С другой стороны, GP Ша является составным компонентом интегри-на ocvP3, который экспрессируется на гладкомышечных клетках, клетках эндотелия, а также на поверхности клеток люминальной пластинки эндометрия и играет важную роль в процессах адгезии и миграции клеток. Эти процессы являются ключевыми при инвазии трофобласта и формировании плаценты. Рядом авторов описана ассоциация генотипа Р1А1/Р1А1 с формированием гиперпластических процессов: гиперплазия интимы при атеросклерозе [176], а также гестозе и задержке развития плода [9].
Среди обследованных нами пациенток мы обнаружили повышение частоты носителей Р1А1/Р1А1 генотипа среди женщин с неблагоприятными исходами беременности в анамнезе, что может свидетельствовать о негативном влиянии данного генотипа на протекание беременности. Мы предполагаем, что при полиморфизме ctvp3 может иметь место нарушение процесса инвазии трофобла-ста. Среди наших пациенток оказалось всего 2 гомозиготных носителя Р1А2 аллеля, поэтому нам не удалось провести статистической обработки полученных результатов. Однако, мы обнаружили, что все эти пациентки находились в группе с неблагоприятными исходами беременности, из чего можно предположить, что гомозиготное носительство данного аллеля является неблагоприятным прогностическим фактором для физиологического течения беременности в связи с повышенной склонностью у таких пациенток к тромбообразованию.
PAI-1 блокирует тканевой плазминоген, который является основным эн-дотелиальным активатором фибринолиза [233]. Аллель, содержащий 4G полиморфизм в промоторной области гена связан с повышенным уровнем PAI-1 по сравнению с 5G аллелем, особенно при высоких уровнях триглицеридов в крови [191]. Повышение уровня PAI-1, в свою очередь, приводит к снижению активности антифибринолитической системы и тем самым к гиперкоагуляции. Наличие аллеля 4G, а особенно его гомозиготное носительство связывают с развитием сердечно-сосудистой патологии - ИБС, инфаркта миокарда. Также существует ряд литературных данных о роли этого полиморфизма в формировании невынашивания беременности на ранних сроках [76]. В проведенном исследовании нам не удалось показать влияние данного полиморфизма на формирование симптомокомплекса невынашивания беременности.
