Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Генотоксичные загрязнители окружающей среды и их действие на различные уровни структурной организации генетического аппарата (обзор литературы) 10
1.1. Бензольные соединения, как загрязнители водной среды, и их генотоксичность 10
1.2. Мутагенная активность соединений хрома 14
1.3. Алкилирующие мутагены, как загрязнители окружающей среды 27
1.4. Слияние геномов и геномные мутации 29
Глава 2. Материал и методика исследований 32
2.1 Оценка генотоксичности загрязнителей водной среды на генном уровне (тест эймса) 33
2.2. Определение хромосомных аберраций в эпителии хрусталика глаза годовиков радужной форели 38
2.3 Гематологические исследования эритроцитов рыб с целью установления полиплоидии после воздействия полиэтиленгликоля 39
2.4. Определение генотоксичности веществ по влиянию на дифференциальную активность генов 41
2.5. Основные вещества, используемые в экспериментах, и их характеристика 42
2.6. Условия лабораторного содержания тест-объектов и подбор концентраций генотоксичных веществ 45
Глава 3. Результаты исследований 49
3.1. Оценка генотоксичности эпихлоргидрина 49
3.1.1. Структурная характеристика активных и неактивных районов политенных хромосом при действии эпхлоргидрипа 52
3.2. действие 2-нафтола на различные структурные уровни генетического аппарата 58
3.2.l Структурная характеристика пояитенных хромосом при действии 2-нафтола 61
3.3. Оценка генотоксичности бихромата калия 64
3.3.1. Структурная характеристика пояитенных хромосом при воздействии растворов бихромата калия 67
3.4. Оценка генотоксичности полиэтиленгликоля на различных структурных уровнях наследственного аппарата 71
3.4.1. Структурная характеристика пояитенных хромосом при действии полиэтиленгликоля 74
3.4.2. Полиэтиленгликоль и возникновение полиплоидии у тетера-плотвички 75
Глава 4. Обсуждение результатов исследований 78
4.1. Генетические особенности объектов выбранных для исследований 78
4.1.1. Генотоксичекое действие 2-нафтола и бензольных соединений 79
4.1.2. Действие эпихлоргидрииа на генетический аппарат гидробионтов 81
4.1.3. Действие хрома 82
4.1.4. Геномные мутации и полиэтиленгликоль 87
4.2. Сравнительный анализ воздействия генотоксичных загрязнителей на гидробионтов 89
Заключение 94
Литература 99
- Мутагенная активность соединений хрома
- Гематологические исследования эритроцитов рыб с целью установления полиплоидии после воздействия полиэтиленгликоля
- действие 2-нафтола на различные структурные уровни генетического аппарата
- Оценка генотоксичности полиэтиленгликоля на различных структурных уровнях наследственного аппарата
Введение к работе
Одной из актуальных и вместе с тем наименее разработанных проблем является оценка возникновения генных, хромосомных и геномных мутаций при воздействии генотоксичных загрязняющих веществ, попадающих в рыбохозяйственные водоемы с промышленными сточными водами. Возникающие при этом мутации могут привести к увеличению наследуемых генетических патологий и резко снизить рыбопродуктивность водоемов. Возникает и вторая, связанная с воздействием мутагенных веществ проблема, нарушение генетического аппарата у гидробионтов и возникновение у них уродств и злокачественных опухолей.
Помимо этого вещества-загрязнители, обладающие мутагенными свойствами, также как и ионизирующая радиация, представляют реальную генетическую опасность для человека. В результате появляется возможность выделить новое направление в гидробиологии - генетическая водная токсикология. Основной задачей этого направления является не только классификация химических соединений по степени их потенциальной генетической опасности для водных организмов, но и вскрытие механизмов воздействия генотоксических веществ на структурные уровни наследственного аппарата.
Одна из проблем генетической водной токсикологии связана с необходимостью биотестирования генотоксичных соединений и их нормирования в воде рыбохозяйственных водоемов (установление ПДК и ОБУВ). Возникает ряд сложных задач, которые необходимо преодолеть, потому что загрязнители-мутагены, помимо токсичных свойств, обладают способностью видоизменять генотип водных организмов.
В настоящее время число веществ, обладающих генотоксичными свойствами, растет с каждым днем. Это число увеличивается каждый день примерно на тысячу соединений. Понятно, что большая часть вновь
синтезируемых соединений не попадает в водную среду, однако, число «новых» загрязнителей среды также оказывается достаточно велико и составляет величину порядка 3500 в год.
Невозможность экспериментального исследования генетической активности химических соединений в водоемах заставляет нас проводить исследования в лабораторных условиях на гидробионтах, относящихся к представительным организмам гидробиоценоза водоема, для которых стандартизированы методы культивирования и исследования наследственного аппарата на генном, хромосомном и геномном уровне. Однако до настоящего времени еще не разработаны принципы нормирования генотоксичных загрязнителей водной среды. Заложены только основы этого нормирования. В частности, считается, что для мутагенных соединений следует ужесточать класс опасности вещества, и для загрязнителей водной среды, обладающих генотоксичностью, не разрешается устанавливать временные нормативы (ОБУВ) для генотоксичных соединений.
На первом этапе развития генетической водной токсикологии основное внимание уделялось исследованиям краткосрочных и экономичных тест-систем in vitro, главным образом, бактериальных. В процессе развития водной токсикологии было показано, что мутационный процесс, индуцированный химическими соединениями, в значительно большей степени, чем в случае ионизирующего излучения, зависит от особенностей метаболизма в клетках-мишенях, путей проникновения в водный организм и распределения мутагенов и их метаболитов по органам и тканям гидробионтов. Это определяет относительно низкую прогностическую эффективность тест-систем in vitro и обуславливает необходимость комплексного подхода при оценке потенциальной генетической опасности химических соединений. Наряду с биотестированием, исследование генотоксичных соединений требует применение экспериментальных методов по исследованию влияния мутагенов на различные уровни организации генетического материала.
Возникает необходимость выявить закономерности проявления мутаций у гидробионтов на генетическом и хромосомном уровне при действии одно и того же вещества. Помимо этого, очень мало внимания уделяется вопросам, связанным с действием веществ вызывающих перестройку всего генома, например, при возникновении полиплоидии. Этот вопрос также будет рассматриваться в данной работе.
Цель работы. Цель работы - выявить особенности воздействия генотоксичных загрязняющих веществ на генном, хромосомном и геномном уровне у гидробионтов и показать наличие или отсутствие взаимосвязи мутаций на различных уровнях для дальнейшего использования полученных данных при биотестировании и эколого-рыбохозяйственном нормировании мутагенов в водной среде.
Для достижения цели работы решались следующие задачи:
Провести сравнительный анализ воздействия ряда генотоксичных загрязнителей на генном уровне с использованием бактериальных тест-систем (тест Эймса), направленный на выявление наиболее и наименее активных веществ вызывающих точковые мутации.
Исследовать вещества, вызывающие хромосомные аберрации митотических хромосом в различных зонах цитодифференцировки хрусталика рыб и влияющие на митотическую активность.
Выявить наиболее активные мутагены из исследуемого ряда загрязнителей, вызывающие перестройки политенных хромосом слюнных желез хирономид, а также влияющие на пуфинг.
Изучить геномные мутации, полученные путем слияния геномов половых клеток аквариумных рыб во время оплодотворения с использованием высокомолекулярных полиэтиленгликолей-3800 по появлению укрупненных эритроцитов и их ядер у развившихся особей.
5. Выявить сопряженности или независимости мутаций, происходящих на разных уровнях генетического аппарата гидробионтов после воздействия генотоксичных загрязнителей водной среды.
Научная новизна. Впервые исследовано действие ряда мутагенов на различные уровни наследственного аппарата у гидробионтов и показана независимость возникновения мутаций на различных уровнях организации генетического аппарата при действии различных мутагенов. Одни генотоксичные загрязнители могут вызывать мутации, как на генном, так и на хромосомном уровне, в то время как другие, например, полиэтиленгликоль, ведут только к геномным перестройкам, не затрагивая генного и хромосомного уровня.
Удалось установить различное воздействие загрязнителей, обладающих генотоксичным эффектом на митотические хромосомы эпителия хрусталика рыб и на политенных хромосомах слюнных желез личинок хирономид. Показано, что вещества вызывающие перестройки хромосом и генные мутации (эпихлоргидрин и бихромат калия) способны также влиять на дифференциальную активность генов и морфологию политенных хромосом.
Впервые показано, что полиэтиленгликоль обладает строго ограниченным генотоксичным действием, вызывает геномные мутации, способствует слиянию нескольких половых клеток рыб, но не индуцирует генных и хромосомных мутаций. Это же вещество не нарушает дифференциальной активности генов, определяемой по пуфингу в политенных хромосомах личинок хирономид.
Установлено, что мутагены, вызывающие геномные аберрации, могут привести к увеличению размеров ядер эритроцитов периферической крови рыб. Это говорит о гибридизации генома и возникновении полиплоидии у исследованных тест-объектов в процессе оплодотворения.
Практическая значимость. Результаты исследований генотоксичных загрязнителей с помощью теста Эймса и цитогенетическими методами легли в основу разработки определения генотоксичности загрязняющих веществ и внесены в «Методические указания по установлению эколого-рыбохозяйственных нормативов (ПДК и ОБУВ) загрязняющих веществ для воды водных объектов, имеющих рыбохозяйственное значение», М: ВНИРО, 1998. Полученные в результате проведения работы результаты учитывались при разработке 6 нормативов (ПДК) для генотоксичных загрязнителей рыбохозяйственных водоемов, которые утверждены научно-техническим советом Главрыбвода и согласованы с Министерством природных ресурсов.
Разработаны экспресс-методы установления генотоксичности загрязнителей рыбохозяйственных водоемов, вызывающие перестройки в политенных хромосомах. В основу данных методов положено влияние мутагенов на политенные хромосомы личинок хирономид, находящихся в периоде метаморфоза (4-я стадия роста, предкуколка).
Разработаны методики исследования хронического воздействия малых доз генотоксических веществ, вызывающих хромосомные перестройки в эпителии хрусталика рыб. Оценка хронического воздействия мутагенов проводится на митотических хромосомах (стадия анафазы-телофазы) эпителия -хрусталика, после экспонирования рыб в течение месяца в растворах веществ, обладающих генотоксичным действием.
Данные, полученные в настоящей работе, широко используются в учебном процессе. Цитогенетические препараты, полученные в результате проведения экспериментов, используются на практических занятиях студентов по «Генетике» «Селекции рыб». Полученные результаты исследований использованы при написании учебных пособий по «Генетике», «Водной токсикологии», «Биотестирование природных и сточных вод».
Апробация работы и публикации. Материалы диссертации представлялись на международной научно-практической конференции МГТА
«Новые технологии в пищей промышленности» (Москва, 2003), на научной конференции «Водные организмы и экосистемы» МГУ (Москва, 2004), на научном семинаре по рыбохозяйственной токсикологии Ихтиологической комиссии РАН (Ярославль, 2002), на научных семинарах кафедры биоэкологии и ихтиологии МГУ ТУ (Москва, 2002 - 2004).
По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ. Материалы диссертационной работы были использованы при составлении Методических указаний и Перечня ПДК и ОБУВ для вредных веществ в воде рыбохозяйственных водоемов.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 114 страницах и состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов, списка литературы (167 наименования).
Мутагенная активность соединений хрома
Поскольку в данной работе намечено исследовать воздействие на различные уровни генетического аппарата гидробионтов не только органических соединений, но и металлов, обладающих переменной валентностью, мы более подробно рассмотрим действие трехвалентного и бихромата калия на живые организмы, в том числе и на гидробионтов. Загрязнение окружающей среды соединениями хрома может быть потенциально опасно для человека и животных. К настоящему времени имеются данные, свидетельствующие о том, что соединения хрома оказывают не только общетоксическое, но и мутагенное и канцерогенное действие. Следует отметить, что до сих пор в литературе имеется небольшое количество данных по мутагенной активности хрома. Данные по объективной оценке мутагенной активности соединения хрома касаются вопросов по выяснению дозы соединений хрома, типов хромосомных перестроек, времени действия мутагена, способности к биоаккумуляции, мутагенной активности шести- и трехвалентных соединений хрома. Бигалиев А.Б. и Туребаев М.Н. (1977) показали, что наибольшая частота клеток с перестройками хромосом в костном мозге крыс наблюдалась при хроническом отравлении бихроматом калия (12,89 ± 0,36 %) в дозе 1 мг на 1 кг живого веса. При остром отравлении белых крыс бихроматом калия, в дозе 15 мг на 1 кг живого веса частота клеток с нарушениями хромосом также достоверно увеличивалась по сравнению с контролем и была равна 8,0 ± 0,37 % (в контроле, 3,7 ± 0,59 %). В этих опытах авторы установили, что основным типом перестройки хромосом у белых крыс при указанных дозах было изменение плоидности клеток. Так, если в контроле отклонения числа клеток с измененным набором хромосом (в основном в сторону гипоплоидии) составило 3-6 %, то при хроническом отравлении количество гипоплоидных клеток составило 29,46 ± 0,82 %, а при остром отравлении 25,08 + 0,08 %. При этом в анеуплоидных клетках также были обнаружены и хромосомные аберрации. Бигалиев и Туребаев, (1977) отмечали также, что в условиях этого опыта при действии бихромата калия на костный мозг крыс наблюдалось также достоверное увеличение слипшихся хромосом; при этом наибольшая величина слипания хромосом отмечена в случае хронического отравления (8,79 ± 0,51 %). Помимо слипания хромосом и изменения плоидности клеток Бигалиев А.Б. и Туребаев М.Н. (1977) обнаружили у крыс другие нарушения в хромосомах.
При хроническом и остром отравлении бихроматом калия наблюдались аберрации хроматидного типа в виде ацентрических фрагментов (7,94 ± 0,91 %) и колец (0,93 %), асимметричных транслокаций (0,72 %). В единичных случаях обнаружены дицентрики. Весьма специфичным типом нарушений в костном мозге крыс явилось значительное количество хромосом с разрывами в центромерном участке: при хроническом отравлении 1,34 %; при остром — 2,25 %. Полученные авторами данные показывают, что соединения хрома обладают высоким мутагенным потенциалом. Бигалиев А.Б., Елемесова М.Ш., Шпак Н. (1973) установили, что при хроническом отравлении белых крыс бихромат калия в дозе 1 мг на 1 кг веса в течение года, и при одномоментном отравлении в дозе, близкой к летальной — 30 мг на 1 кг веса - резко увеличивается количество клеток с различными типами перестроек хромосом. При хроническом отравлении резко возрастает количество гипоплоидных клеток - 25,4 + 3,04 % (2п = 41, 40, 39). Наблюдаются сильные вариации в степени спирализации хромосом. Характерным является появление на хромосомах сегментации 4 ± 1,5%. По мнению авторов, незначительное увеличение клеток с нарушениями хромосом при одномоментном отравлении, свидетельствует о том, что бихромат калия как мутаген действует не непосредственно на ДНК, а путем влияния на процессы образования ДНК — протеидного комплекса, С этим положением хорошо согласуются данные по спирализации и образованию сегментов на хромосомах, которые остаются на одном уровне как при хроническом, так и при одномоментном отравлении. Появление сегментированных хромосом, а также значительные колебания в степени спирализации хромосом позволяют сделать вывод, что бихромат калия действует на ДНП, т.е. ДНК — протеиновый комплекс. На это указывает и тот факт, что большинство нарушений хромосом происходит в центромерном участке, который обусловливает большой процент слипания хромосом. (Бигалиев и др., 1973, 1976). Образование сегментов на хромосомах хорошо согласуется с известным в литературе положением, что соединения хрома как сильные окислители ингибируют процессы синтеза ДНК и белка, а отсюда тормозят и образование ДНП.
Следовательно, бихромат калия выступает как ингибитор синтеза ДНК, что приводит к задержке на определенных участках хромосом образования ДНК — протеинового комплекса, который выступает в виде поперечных сегментов на хромосомах. Многие авторы (Рощин, 1974; Бигалиев, 1976; Пашин, 1981, Дурнев и др., 1998), показали, что наибольший мутагенный эффект бихромат калия проявляет при хроническом однократном отравлении. При этом токсичность бихромата калия не коррелирует с его мутагенным эффектом. Максимум хромосомных мутаций наблюдается при хроническом отравлении, когда эффект отравления менее выражен; наоборот, при остром отравлении, когда наиболее сильно проявляются признаки отравления, количество хромосомных мутаций значительно ниже. Бихромат калия выступает как химический мутаген задержанного действия (Бигалиев, Елемесова, 1976). В пользу этого говорит тот факт, что при действии бихромата калия на белых крыс, обнаружен, в основном, хроматидный тип перестроек хромосом. Следовательно, бихромат калия как мутаген индуцирует разрывы хромосом после их редупликации. Сходным
Гематологические исследования эритроцитов рыб с целью установления полиплоидии после воздействия полиэтиленгликоля
Метод позволяет учитывать морфологическое строение эритроцитов рыб и определять плоидность по размерам клетки и ядра. Для выполнения метода используются общепринятые гематологические методики и изучение окрашенных препаратов крови контрольных рыб и рыб, у которых оплодотворение проходило в растворах полиэтиленгликоля. Для приготовления мазков кровь берут из хвостовой вены. Мазки фиксируют в чистом этаноле, высушивают, окрашивают азур-эозином по Романовскому и просматривают под микроскопом. Анализу подлежат мазки, где клетки располагаются равномерно, образуя монослой без наложений и повреждений цитоплазмы. Учитываются только целые эритроциты. Для определения параметров эритроцитов анализируют 100 эритроцитов на особь на 1 предметное стекло. Гематологические исследования проводились на эритроцитах тетры-плотвички, с применением пакета программ «Видеотест-Морфо» с модификациями их использования для рыб (Serpunin, 1995). Обработка полученных параметров зрелых эритроцитов позволяет выявить возникновение автоплоидии во время оплодотворения у рассматриваемого вида рыб в присутствии различных концентраций полиэтиленгликоля. Полиплоидные клетки содержат большее количество ДНК, у них крупнее размер клеток и увеличены размеры ядра соответственно плоидности (Кирпичников, 1987).
Параметры эритроцитов наиболее стабильны по сравнению с клетками белой крови, что упрощает работу по выявлению слияния геномов после воздействия токсиканта по выбранной нами компьютерной программе. Для выявления полиплоидии мы исследовали изменение следующих гематологических показателей: большая ось эритроцитов (А), малая ось эритроцитов (В), отношение А/В, большая ось ядра эритроцита (а), малая ось ядра эритроцита(Ь). Для исследования гематологических параметров крови рыб используется значительно большее количество показателей (Серпунин. 2003), но для выявления полиплоидии, получившейся за счет слияния генов, количество исследуемых нами параметров вполне достаточно. Для каждой концентрации полиэтиленгликоля брали 5 мазков крови. Так как тетра-плотвички были малы по размеру, кровь для препаратов получали отрезанием хвостового стебля. Мазки крови окрашивались азурэозином по Романовскому-Гимза согласно общепринятой методике (Иванова, 1983). Исследования проводятся на полите иных хромосомах в слюнных железах предкуколки хирономид. В качестве тест-объекта рекомендуется лабораторная культура хирономид Chironomus thummi и Ch. plvmosus. В результате проведения работы выявляется действие веществ на структуру интерфазных хромосом и на дифференциальную активность проявления пуфинга в процессе метаморфоза личинки в куколку (Симаков, 1998). Определение генотоксичности химических соединений и их действия на дифференциальную активность генов проводят на пред куколке, развитие которой наблюдается с 36-го по 38-й день при температуре 20 - 25С. Стадия предкуколки характеризуется набуханием грудных сегментов, укорочением и заострением тела и уменьшением ложных ножек.
Метаморфоз проходит в 6-й, 7-й, 8-й и 9-й фазах развития (Кикнадзе, 1975). Изменение цвета тела с красного на темно-серый указывает на окончание метаморфоза. Для синхронизации развития и отбора хирономид в эксперименте заранее следят за степенью потемнения головы на первой фазе 4 возраста, перед тем как личинка перейдет в фазу предкуколки. Для этой цели подходят личинки, у которых цвет головы темно-коричневый, а грудные сегменты набухшие и все тело укороченное. Препараты политенных хромосом из слюнных желез получают по стандартной методике (Симаков, 1998). Учет и анализ результатов. Генотоксичность вещества оценивается по нарушению структуры политенных хромосом (возможны разрывы, распад концов и дезинтеграция) и по нарушению пуфинга во время метаморфоза. В контроле пуфинг меняется следующим образом. На первой хромосоме пуф Gih-к увеличивается в размерах на 7-й и 8-й фазах развития. На второй хромосоме 2A3 в постепенно сужается, а пуф 2АЗе увеличивается на каждой последующей фазе. На 8-Й фазе появляются 2 пуфа 2D2de и пуф 2G2. На третьей хромосоме на 6-й и 7-й фазах имеется пуф 3D4e, а после 7-й фазы появляется пуф 3D4, который отмечается до конца метаморфоза. На четвертой хромосоме видны тельца Бальбиани, которые резко увеличиваются на 8-й фазе. Помимо этого на 6-й фазе появляется быстро исчезающий пуф 4Dc. При действии некоторых токсикантов у личинок насекомых, имеющих политенные хромосомы, может возникнуть до 22 новых пуфов (Рапопорт и др., 1971, Симаков и др., 1990).
действие 2-нафтола на различные структурные уровни генетического аппарата
Исследование мутагенной активности 2-нафтола и определение структурного уровня воздействия этого загрязнителя на наследственный аппарат гидробионтов проводили на 3-х тест-объектах, Точковые мутации выявлялись с помощью теста Эймса с применением штаммов сальмонеллы ТА-98 и TA-100. Вероятность появления хромосомных аберраций проверялась на эпителии хрусталика Parasalmo mykiss. На тотальных микропрепаратах эпителия хрусталика исследовались хромосомные аберрации на стадии ано-телофазы. Помимо этого, исследуемые растворы 2-нафтола проверялись на потенциальную способность репрограммировать генетическую информации у личинок хирономид во время метаморфоза, когда по пуфингу в политенных хромосомах слюнных желез можно судить о нарушении дифференциальной активности генов (Девидсон, 1972; Симаков, 1998). Результаты исследований по определению генотоксичности 2-нафтола на уровне генных мутаций представлены на таблице 3.3. Согласно методическим указаниям по установлению ПДК мутагенность вещества в воде рыбохозяйственных водоемов определяется по соотношению количества колоний в опыте к количеству колоний в контроле. Если это соотношение меньше 2,5, то можно говорить об отсутствии мутагенности у исследуемого вещества, В нашем случае превышение показателей в 2.5 раза не отмечено, следовательно, все исследованные концентрации 2-нафтола не обладают мутагенной активностью на уровне генных мутаций. Однако при действии 2-нафтола в концентрации 0,2 мг/л отмечается ингибирование развития сальмонелл дикого типа, способных жить в отсутствии гистидина.
Это говорит о бактерицидных свойствах 2-нафтола при концентрации 0,2 мг/л. Следовательно, мы не можем тестом Эймса определить, возникают ли генные мутации при более высоких концентрациях. Проведенные исследования дают возможность утверждать, что 2- нафтол в исследованных концентрациях не обладает мутагенной активностью на генном уровне. Для выявления генотоксичности 2-нафтола на хромосомном уровне мы использовали сеголеток радужной форели, которые в течение месяца находились в растворах 2-нафтола. В этом случае проверялась мутагенная активность вещества на эпителии хрусталика рыб в хроническом опыте. Данные об исследовании хромосомных аберраций и об изменении клеточной пролиферации в эпителии хрусталика радужной форели в хроническом опыте после воздействия различных концентраций 2-нафтола представлены в таблице 3.4. Результаты исследований показывают, что при концентрации 2-нафтола наблюдается повышенное содержание аберративных митозов в эпителии хрусталика и падение митотического индекса, что говорит о мутагенном и цитотоксическом действии исследуемого вещества в хроническом эксперименте. Резкое отставание хромосом указывает на колхициноподобное действие.
Возможно, 2-нафтол нарушает нити веретена деления. При концентрации ОД мг/л генотоксичный эффект не проявляется, зато отмечается стимуляция митотической активности (МИ=4,45 в опыте, в то время как в контроле МИ=2,66).отклонений в указанных биологических показателях не происходит. Поэтому концентрацию 0,1 мг/л следует считать максимально допустимой по действию на генный аппарат рыб, но в цитологическом плане эта концентрация не может считаться допустимой, так как она вызывает увеличение клеточной пролиферации. При более низких концентрациях 2-нафтола, начиная с 0,01 мг/л и ниже, 2-нафтол не проявляет генотоксичности и не нарушает
Оценка генотоксичности полиэтиленгликоля на различных структурных уровнях наследственного аппарата
Определение мутагенной активности полиэтиленгликоля проводили на 4-х тест-объектах. Для выявления генных мутаций использовали тест Эймса с применением штаммов сальмонеллы ТА-98 и ТА-100. Возможное проявление мутаций на хромосомном уровне проводилось на эпителии хрусталика годовиков радужной форели, а на политенных хромосомах слюнных желез личинок хирономид следили за тем, как влияет полиэтиленгликоль на интерфазные хромосомы. Исследуемые растворы полиэтиленгликоля проверялись на потенциальную способность репрограммировать генетическую информацию во время метаморфоза у личинок хирономид (Девидсон, 1972; Симаков, 1998).
Геномные мутации исследовались на Hemigrammus caudovittaus (тетра-плотвичка), у которой проводили оплодотворении в присутствии полиэтиленгликоля 3800 и далее по размерам эритроцитов периферической крови и их ядер следили за возможностью появления полиплоидных особей. Появление полиплоидных особей может указывать на слияние геномов отдельных клеток в присутствии полиэтиленгликоля. Полиэтиленгликоль не обладает высокой токсичностью. При концентрации 30 мг/л в острых опытах рыбы выживали и их поведение не менялось. Однако для хронических опытов нами был взят спектр концентраций, в который включались концентрации, вызывающие геномные мутации у других гидробионтов, а именно: 15,0; 10.0; 5,0; 1,0 и 0,5 мг/л. Результаты исследований по определению мутагенной активности полиэтиленгликоля на генном уровне представлены на таблице 3.7. Согласно методическим указаниям (ВНИРО, 1998) мутагенность вещества в воде рыбохозяйственных водоемов определяется по соотношению количества колоний в опыте к количеству колоний в контроле. Если это соотношение меньше 2,5, то можно говорить об отсутствии мутагенности у исследуемого вещества. В нашем случае при действии полиэтиленгликоля 3800 соотношение числа колоний ревертнтов к контролю меньше чем 2,5, поэтому можно говорить об отсутствии генотоксичности для полиэтиленгликоля на генном уровне. Данные об исследовании хромосомных аберраций в эпителии хрусталика радужной форели после воздействия полиэтиленгликоля в течение 30 дней представлены в таблице 3.8. Результаты исследований показывают, что ни одна из исследованных концентраций полиэтиленгликоля не вызывает повышения клеточной пролиферационной активности в эпителии хрусталика годовиков радужной форели. В данном эксперименте не обнаружено также возникновение хромосомных аберраций под влиянием полиэтиленгликоля больше чем в контроле. Полученные колебания митотической активности и возникновения хромосомных аберраций в различных концентрациях полиэтиленгликоля статистически недостоверны. Цитологические исследования политенных хромосом личинок хирономид после 10 дневной экспозиции в растворах полиэтиленгликоля показали, что у выживших личинок при действии всех исследованных концентраций не наблюдается деструкции политенных хромосом и не нарушается пуффинг у двух исследованных видов хирономид.
Таким образом, полиэтиленгликоль 3800 не обладает генотоксичным свойством ни на генном, ни на хромосомном уровне. В следующем разделе будут рассмотрены вопросы, связанные с влиянием полиэтиленгликоля на политенные хромосомы личинок хирономид.Воздействие растворов полиэтиленгликоля на личинок Chironomus plumosus и Chironomus thummi (dorsalis) в концентрации 0,1 мг/л показало, что у обоих видов политенные хромосомы практически не отличаются от контроля. Как показали исследования, пуфинг при этом также не нарушается и соответствует цитологической карте хромосом. Можно считать, что поскольку не нарушена структура интерфазных (политенных) хромосом, тем самым не нарушена и работа генов, находящихся в экспрессивном состоянии.При действии концентраций полиэтиленгликоля 0.5 и 1,0 мг/л генотип у Chironomus plumosus близок к норме, не видно деструкции концов хромосом. Пуфы во всех хромосомах соответствуют контролю в период метаморфоза, отличий от контроля нет, В этой же концентрации полиэтиленгликоля у личинок Chironomus thummi в хромосомах не было обнаружено нарушения дисков и междисков, все хромосомы хорошо идентифицировались. Следовательно, полиэтиленгликоль в указанных концентрациях не проявилгенотоксического действия и структура хромосом у обоих видов Ch.plumosus и Ch.thummi сохранилась.
Наиболее высокие исследованные концентрации полиэтилнгликоля 5,0, 10 и 15 мг/л также не оказали воздействия на представителей указанных видов хирономид. При этом структура политенных хромосом из слюнных желез личинок хирономид не нарушалась, а пуфинг соответствовал карте политенных хромосом с 6 по 9 фазу развития 4-й стадии роста, когда проходят у личинок процессы метаморфоза (рис. З.1.).
Таким образом, исследованные концентрации полиэтиленгликоля не обладают мутагенным эффектом на уровне генов, и не вызывают аберраций в отдельно взятых митотических и политенных хромосом. Проведенный эксперимент показывает, что пуфинг в политенных хромосомах не нарушается, что может говорить об отсутствии влияния полиэтиленгликоля на дифференциальную активность генов. Однако, опираясь на ранее проведенные исследования, можно ожидать, что у полиэтиленгликоля может проявиться генотоксичность на уровне генома, когда под влиянием этого вещества происходит гибридизация наследственного материала отдельных клеток.
Исследование ядер эритроцитов периферической крови тетра-плотвички с помощью программных пакетов "ВидиоТест-Морфо" показало, что под влиянием различных концентраций полиэтиленгликоля происходит увеличение размеров клеток красной крови и их ядер. Это положение вполне соответствует полиплоидии у рыб, полученной экспериментальным путем. Известно, что у полиплоидных рыб крупнее эритроциты и их ядра, так как содержание ДНК в них увеличивается по мере увеличения плоидности (Кирпичников, 198 7).
