Содержание к диссертации
Введение
1. Токсикологические особенности воздействия растворимых и нерастворимых соединений хрома на гидробионтов (обзор литературы) 11
1.1. Действие взвешенных тонкодисперсных частиц на гидробионтов 11
1.2. Непосредственное влияние взвешенных твердых веществ 13
1.3. Взвеси и воспроизводство 16
1.4. Влияние на различных гидробионтов 18
1.5. Общее влияние взвесий на пресноводных рыб и других гидробионтов 19
1.6. Критерии качества воды по содержанию взвесей 23
1.7. Распределение соединений хрома в водной среде 26
1.8. Токсическое действие растворимых и тонкодисперсных фракций хрома 29
1.9. Мутагенная и канцерогенная активность соединений хрома 32
1.10. Действие хрома на гидробионтов 40
2. Материал и методика исследований 51
2.1. Нерастворимые соединения хрома, используемые в экспериментах на гидробионтах 51
2.2. Дафнии 53
2.3. Хирономиды 56
2.4. Оценка генотоксичности 59
2.5. Данио 60
2.6. Дрейссена 61
2.7. Метод исследования нерастворимых хроматов с помошью электронного микроскопа и рентгеновского спектрального микроанализа 62
2.8. Методы гистологической обработки материала 63
3. Результаты исследований 66
3.1. Микроскопический и микрорентгеновский спектральный анализ тонкодисперсных нерастворимых хроматов 66
3.2. Действие нерастворимых хроматов на дафний (Daphnia magna) 69
3.3. Влияние тонкодисперсных фракций нерастворимых хроматов на выживаемость и гаметогенез дрейссены (Dreissena polymorpha) 78
3.4. Влияние тонко дисперсных частиц нерастворимых хроматов на жаберный аппарат дрейссен 88
3.5. Действие тонко дисперсных частиц нерастворимых хроматов на личинок хирономид 91
3.6. Оценка генотоксичности тонкодисперсных хроматов на генном уровне у гидробионтов 95
3.7. Структурная характеристика политенных хромосом и хромосомные аберрации под влиянием тонкодисперсных фракций нерастворимых хроматов 97
3.8. Влияние тонкодисперсных нерастворимых хроматов на выживаемость Brachydanio rerio 101
3.9. Оогенез Brachydanio rerio в условиях присутствия в воде взвеси нерастворимых хроматов 103
4. Обсуждение результатов 109
4.1. Влияние тонкодисперсной взвеси хроматов на биологические показатели у дафний в хроническом опыте 109
4.2. Действие тонкодисперсных взвешенных хроматов на биологические показатели дрейссены 113
4.3. Изменения в гистологическом строении жаберного аппарата дрейссен при наличии взвеси нерастворимых хроматов 116
4.4. Влияние нерастворимых хроматов на гидробионтов через грунт водоема 117
4.5. Генотоксические свойства нерастворимых соединений хрома 118
4.6. Обсуждение результатов экспериментов по воздействию тонкодисперсной взвеси хроматов на рыб 122
4.7. Оогенез у рыб в условиях загрязнения воды взвесью тонкодисперсных хроматов 124
Заключение 125
- Непосредственное влияние взвешенных твердых веществ
- Дафнии
- Действие нерастворимых хроматов на дафний (Daphnia magna)
- Действие тонкодисперсных взвешенных хроматов на биологические показатели дрейссены
Введение к работе
Наибольшую потенциальную опасность для окружающей среды представляют такие загрязнители, как нефть и тяжелые металлы. Тяжелые металлы, попадая в водоемы с промышленными сточными водами, вызывают необратимые изменения природных экосистем (Грушко, 1972; Патин, 1974; Renhwoldt, 1973; Агаджанян, 2001). Достаточно сказать, что для тяжелых металлов в принципе не существует механизмов самоочищения. Они лишь перемещаются из одного природного резервуара в другой, взаимодействуя с различными сообществами водных организмов (Мур и Рамамурти, 1987).
Особенностью органических соединений является трансформация веществ и непостоянство состава (Патин, 1997, 2001). В отличие от этого тяжелые металлы, и особенно хром, соединения которого применяется для термостабилизации буровых растворов, как ингибиторы коррозии, как желтый пигмент красок для покрытия автомобилей, для создания типографских красок, а также для окраски пластмасс и резины, достаточно стабильны. Никаноров A.M. и Жулидов А.В. (1991) отмечали, что тяжелые металлы не подвергаются трансформации, как это свойственно органическим соединениям, и, попав в биогеохимический цикл, они крайне редко покидают его. В результате этих свойств металлов и вследствие бесконтрольного загрязнения водной среды происходят массовые отравления людей и гибель организмов.
Показано, что нерастворимые соединения хрома, например, хромат свинца, хромат цинка и хромат стронция обладают генотоксичностью (Тарусов, 1987). Сорбированные на взвешенных частицах химические примеси усиливают отрицательное действие взвеси за счет токсического воздействия соединений тяжелых металлов и особенно хрома. Они могут вызывать аномалии в тканях гидробионтов (Патин, 1997).
Биологические и экологические последствия таких аномалий не могут не привлекать пристального внимания, так как в отличие от других загрязняющих веществ, металлы в естественных условиях не разрушаются, а меняют форму нахождения и физико-химические состояния. Они могут распространяться в водной среде в виде мельчайших взвешенных частиц (Патин, 2001, Балаба и Светличная, 2003).
Специалистам по охране окружающей среды при организации
Ф мониторинга и оценке вредного воздействия на организм придется иметь
дело с группой тяжелых металлов, среди которых по токсичности особенно выделяется хром.
Загрязнение толщи воды взвешенными частицами, несущими
соединения хрома, стоит в одном ряду с такими острыми экологическими
Ф проблемами как: эвтрофирование водоемов, влияние кислотных дождей,
загрязнение химическими веществами и радионуклидами. Среди группы тяжелых металлов важная роль придается соединениям хрома, которые широко используются в промышленном производстве. Дж.В. Мур и С. Рамамурти (1987) относили хром к наиболее опасным загрязняющим веществам водной среды. Загрязнение окружающей среды соединениями хрома может быть потенциально опасно для человека и других биологических видов. Количество соединений хрома в окружающей среде постоянно возрастает и достигает уровня, опасного для жизнедеятельности организмов.
Хром стал в последние десять лет одним из основных факторов,
* определяющих антропогенный фон загрязнения биосферы (Патин, 2001).
К настоящему времени накопились данные, свидетельствующие о том, что соединения хрома оказывают не только общетоксическое (Беляева, 1962; Грушко, 1964; Шабанова, 1966), но мутагенное (Бигалиев, 1973, 1977; Пашин, 1981) и канцерогенное действие на человека и животных (Движков, Федорова, 1967; Тарусов, 1987; Гигиенические нормативы ГН 1.1.725 - 98, 1999).
-7-Поступающие в водоем отходы в виде растворимых и нерастворимых
соединений хрома создают новые гидрохимические условия для
жизнедеятельности водных животных, вследствие чего снижается видовое
разнообразие и численность планктонных и бентосных животных
(Брагинский, 1972,1979; Федий и др., 1975).
Вопрос о биологических последствиях загрязнения водной среды соединениями хрома и допустимых пределах изменения химического состава водной среды под влиянием этих загрязнителей становится главным в прикладной гидробиологии, в той ее части, которая касается методов оценки экологического состояния водных экосистем при загрязнении и теоретических вопросов водной токсикологии.
Очень часто экологическая оценка токсичности тяжелых металлов основывается на изучении выживаемости биологических объектов, которая сама по себе является менее чувствительным показателем, чем оогенез, эмбриогенез, которые программируют дальнейшее существование гидробионтов на более поздних этапах онтогенеза. Именно в этом направлении проводились исследования в данной работе.
Биологические показатели на индивидуальном уровне должны
включать морфологические, этологические, биохимические,
физиологические и генетические характеристики, специфичные для данного вида (Израэль, 1989).
Цель работы: выявить особенности токсического воздействия тонкодисперсной взвеси нерастворимых соединений хрома на гидробионтов пресноводных водоемов, обитающих в различных биотопах.
Для выполнения поставленной цели необходимо было решить ряд задач:
1. Провести микроскопический и рентгеновский зондовый спектральный анализ взвешенных частиц нерастворимых соединений хрома для выяснения распределения хрома в тонкодисперсной взвеси.
2. Провести сравнительный анализ воздействия взвешенных частиц
хромата цинка, храмата стронция и хромата свинца на планктонные организмы-фильтраторы (дафнии).
Изучить особенности влияния взвешенных частиц хромата цинка, хромата стронция и хромата свинца на гаметогенез и жаберный аппарат дрейссен, как представителей бентосных фильтраторов.
Исследовать воздействие нерастворимых соединений хрома на выживаемость и метаморфоз личинок хирономид, как представителей бентосной инфауны.
Оценить генотоксичность взвешенных соединений хрома на генном уровне (тест Эймса) и на хромосомном уровне, используя политенные хромосомы личинок хирономид.
Изучить особенности выживания рыб (Brachydanio rerio), как представителей нектона, при наличии в воде взвешенных тонкодисперсных соединений хрома и их влияния на гаметогенез.
Научная новизна и теоретическая значимость работы.
Впервые показано тонкодисперсное распределение нерастворимых соединений хрома в водной среде и электростатическое взаимодействие взвешенных частиц, активно влияющих на эпителиальные ткани гидробионтов.
Впервые проведен сравнительный анализ токсического и тератогенного действия нерастворимых соединений хрома на наиболее чувствительные биологические показатели у представителей пресноводного планктона.
Установлена высокая чувствительность тканей и показано нарушение оогенеза у Dreissena polymorpha и Brachydanio rerio при наличии в водной среде тонкодисперсной взвеси соединений хрома.
Впервые показано мутагенное действие взвешенных в воде соединений хрома для гидробионтов. Генотоксичность выявлена на генном уровне (тест Эймса) и на политенных хромосомах личинок хирономид.
-9-Впервые показано, что тонкодисперсные соединения хрома наиболее
опасны для организмов-фильтраторов, у которых они нарушают
биологические показатели и вызывают гиперплазию соединительной ткани
жабр.
Практическое значение работы.
Проведенная работа может быть использована при нормировании
взвешенных веществ в воде водоемов и дает основание для отдельного
^ нормирования токсичных и нетоксичных взвешенных веществ. До этого
существовал единый норматив для всех взвешенных веществ. В данном
случае предлагается пересмотреть нормативы в открытых водоемах для
нерастворимых соединений хрома, широко применяемых в
промышленности, так как показана их высокая токсичность и
Ф генотоксичность. Выявлено, что нерастворимые соединения хрома наиболее
опасны для гидробионтов-фильтраторов, поэтому необходимо запретить сброс тонкодисперсных нерастворимых соединений хрома в водоемы даже в минимальных количествах, предусмотренных Правилами охраны поверхностных вод, которые разрешают превышать имеющийся фон на 0,25 мг/л.
Выявленные наиболее чувствительные показатели к взвешенным
нерастворимым соединениям хрома (гаметогенез дрейссены и
гистологическое строение жабр, оогенез у Brachydanio rerio, изменения в
политенных хромосомах личинок хирономид) могут найти применение в
биотестировании, биомониторинге, при установлении ориентировочно
* безопасного уровня воздействия (ОБУВ) и предельно допустимой
концентрации (ПДК) для токсичных тонкодисперсных взвешенных частиц. Предлагается ужесточить контроль над содержанием нерастворимых хроматов в водоемах и сократить их применение в промышленности.
Полученные данные могут быть использованы в учебном процессе при чтении курсов лекции: охрана окружающей среды, водная токсикология, экология и гидробиология.
-10-Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на IX
Международной научно-практической конференции (Москва, 2003 г.,
МГТА), на Международной конференции «Водные экосистемы и
организмы - 5» (Москва, 2004 г., МГУ), на научных коллоквиумах кафедры
биоэкологии и ихтиологии МГУ ТУ (2003 - 2004 г.)
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 5 научных работ.
Непосредственное влияние взвешенных твердых веществ
Гибель и выживание рыб. Уоллен (Walien, 1951) содержал несколько видов рыб в воде с добавлением монтмориллонитового ила и ежедневно на короткое время значительно увеличивал мутность воды путем взмучивания осадка. Большинство особей всех видов, включая карася (Carassius auratus) и карпа (Cyprinus carpio), выносили максимальную мутность, равную 100 000 мг/л в течение недели или дольше, а некоторые особи этих двух видов выживали в условиях периодического увеличения мутности до 225 000 мг/л в течение одной — трех недель. Герберт обнаружил, что радужная форель (Salmo gairdneri) выживает в течение суток при концентрации осадка от промывки гравия, равной 80 000 мг/л; чтобы вызвать гибель рыб за это время, концентрацию осадка следует увеличить примерно до 160 000 мг/л. Гибель тропической рыбки-арлекина (Rasbora hetercmorpha) в течение суток наступает при концентрации бентонита 40 000 мг/л, но она выживает в течение недели при 6 000 мг/л (Абстер и Ллойд, 1984). Обычно в поверхностных водах концентрация взвесей, равная нескольким сотням тысяч миллиграммов на литр, наблюдается очень короткое время, но довольно высокие концентрации могут присутствовать в воде относительно долго, это относится к исследуемым нами пелитовым фракциям нерастворимых хроматов. В реках во время паводка концентрация ила в течение 15-20 дней составляла от 2000 до 6000 мг/л (Campbell, 1954; Simaika, 1940; Kemp, 1949); в двух ручьях, постоянно загрязняемых отходами разработки залежей фарфоровых глин, среднее содержание взвесей достигало 6000 и 1000 мг/л (Herbert et al„ 1961). В лабораторных условиях суспензия гипса 4250 мг/л вызывает 50% смертность радужной форели примерно за 3,5 недели (Herbert and Wakeford, 1962). Гибель радужной форели в садках, установленных в Паудер-Ривер (штат Орегон), где концентрации взвеси колебались от 1000 до 2500 мг/л, а другие условия, видимо, были удовлетворительными, наступала через 20 дней (Campbell, 1954). 40 - 50%-ная смертность форели наблюдалась в лабораторных экспериментах при 810 мг/л каолина и 270 мг/л диатомовой земли в одних опытах после 10-дневной экспозиции, а в других только после 85-дневной (Herbert and Merkens, 1961). Волокна ели в концентрации 200 мг/л вызывают 50%-ную смертность радужной форели после 16-недельной экспозиции и 70%-ную смертность после 30-недельной (Herbert and Richards, 1963).
Все радужные форели, содержавшиеся четыре недели в суспензии гипса, при концентрации 553 мг/л выжили (Herbert and Wakeford, 1962). Отмечено 100%-ное выживание рыб того же вида, содержавшихся в течение 9 - 10 месяцев во взвеси частиц (200 мг/л), полученных после обогащения угля (Herbert and Richards, 1963). Таким образом, тщательно проведенные эксперименты и достоверные наблюдения за состоянием рек доказывают, что концентрации взвесей от 200 до нескольких тысяч миллиграммов на литр вызывают гибель рыб, экспонировавшихся несколько недель или месяцев, но другие столь же достоверные данные свидетельствуют о том, что при концентрациях взвеси от 200 до 1000 мг/л за примерно такое же время экспозиции смертность была небольшой или вообще отсутствовала. Эти несовпадения, возможно, частично объясняются характером взвешенного материала: в одновременных экспериментах, проводившихся по идентичной методике, выжили все радужные форели, содержавшиеся в течение 40 недель при концентрации взвесей, полученных после обогащения угля, равной 200 мг/л, в то время как около 80% рыб погибли в результате экспонирования при ц таких же концентрациях волокон ели (Herbert and Richards, 1963). Эллис (Ellis, 1944) считает, что чем крупнее частицы и больше их жесткость и угловатость, тем большую опасность они представляют для жаберных структур. Другим фактором является то, что устойчивость разных видов рыб неодинакова. Смит с сотрудниками (Smith et al., 1965) обнаружил, что гибель сеголетков судака (Stiostedion vitreum) происходит за 72 ч при концентрации разных древесных отходов 100 мг/л, хотя концентрация 20 000 мг/л не убивает гольяна (Pimephales promelas) и за 96 ч. Вероятность гибели рыб при длительном присутствии взвесей в концентрации 200 мг/л или более зависит от природы взвеси и видового состава ихтиофауны. Тем не менее, существующие данные дают основание считать, что в водах, содержащих в течение длительного времени взвеси, количество которых превышает 200 мг/л, смертность рыб значительно выше, чем в чистых водах. Однако в большинстве описанных случаев при концентрации взвеси 100 мг/л и менее скорость гибели рыб была невелика или не выше, чем у контрольных рыб в чистой воде. У радужных форелей, содержавшихся в течение длительного времени в воде с 90 мг/л каолина и диатомовой земли, гибель была несколько выше, чем в контроле, но, в общем, тоже была низкой: в пяти из шести опытов, длившихся два-шесть месяцев, погибли не более 20% рыб (Herbert and Merkens, 1961). За восемь месяцев выдерживания радужных форелей в воде, содержащей 100 и 50 мг/л волокон ели, смертности не наблюдалось (Herbert and Richards, 1963), а при содержании того же вида с 30 мг/л каолина или диатомовой земли не наблюдалось существенного увеличения смертности по сравнению с контролем. Рост. 62-дневное содержание в воде с концентрациями красной глины, достигающими 28 мг/л (Swenson and Matson, 1976), не влияло на рост и выживание личинок сига (Coregonus artedii). Лабораторные эксперименты, в которых форели давали одинаковое количество корма, почти достаточное для удовлетворения аппетита, показали, что концентрации древесной массы ji или твердых отходов от обогащения каменного угля, равные 50 мг/л, вызывают замедление темпа роста рыб; при увеличении концентрации взвесей рыбы росли медленней (Herbert and Richards, 1963). Тем не менее, при обильном кормлении рыбы росли хорошо даже в условиях, когда концентрация твердых отходов от обогащения каменного угля составляла д 220 мг/л. За 8 месяцев масса сеголетков более чем утроилась.
Если при оседании взвеси частицы налипают на икру, это приводит к увеличению ее смертности. Шаповалов (Shapovalov, 1937) показал, что при заилении гравия выживаемость икринок радужной форели уменьшается (Salmo gairdnerii), а в более поздних экспериментах то же самое обнаружилось и у икры кижуча (Oncorhynchus kisutch) (Shapovalova and Berrian, 1940). Хоббс (Hobbs, 1937) полагает, что смертность икры форели в ручьях Новой Зеландии выше в тех притоках, где преобладают частицы диаметром менее 1 мм. По данным Уорда (Ward, 1938), изучавшего Рог- Ривер (штат Орегон), где широко проводились разработки россыпей, в некоторых реках эрозионные наносы покрывали гнезда и нерестилища таким мощным слоем, что донная фауна гибла, а икра в гнездах задыхалась. Кемпбелл (Campbell, 1954) помещал икру в гравий в реке Паудер-Ривер (штат Орегон), где в результате горных разработок концентрация взвесей в воде достигала 1000 - 2500 мг/л. Вся икра погибла спустя шесть дней, в то время как на контрольном участке с чистой водой смертность спустя 20 дней составляла всего 6%. Случаи гибели икры рыб при осаждении взвесей приводятся также в работах Хега (Heg, 1952), Герцога (Hertzog, 1953), Генгмарка и Брода (Gangmark and Broad, 1955 и 1956), Нива (Neave, 1947). Показано, что икра семги (Salmo salar) и кумжи (Salmo trutta), которую помещали в гравий на дне рек, может успешно развиваться только в том случае, если поток воды проходит через слой гравия. С увеличением скорости тока воды через слой гравия, в который отложена икра чавычи (Oncorhynchus tshawytscha), увеличивается ее выживаемость (Gangmark and Bakkala, 1960). Тонкодисперсные взвеси могут отрицательно влиять на икру, отложенную на поверхность грунта нерестилищ. Стюарт (Stuart, 1953) заметил, что взвешенный в воде ил прилипает к поверхности икринок, и они гибнут, возможно, из-за нарушения обмена кислородом и двуокиси углерода у дышащей икры. Взвеси могут представлять опасность и для тех видов рыб, которые не откладывают икру на речное дно и не зарывают ее. Почти полностью погибла икра желтого окуня (Perca flavescens), которую он откладывает в виде желеобразных лент, прикрепленных к водным растениям, на участке, где сброс в воду отходов при строительстве дороги снизил прозрачность воды в среднем до 0,46 м по диску Секки, а выше по течению, где средние показатели прозрачности составляли 0,84 м, выклев личинок прошел вполне успешно (Muncy, 1962). В озере Балатон погибла икра судака (Stizostedion lucioperca), также отложенная на водные растения, после того как в результате штормов содержание взвесей в воде возросло (Wynarovich, 1959).
Дафнии
Для оценки токсического действия растворимых и нерастворимых соединений хрома в опытах использовалась Daphnia magna. Ранее уже было отмечено, что 25 мг/л нетоксичных тонкодисперсных взвесей не оказывает влияния на выживаемость дафний и других гидробионтов. В то же время нерастворимые соединения хрома в острых опытах, при концентрации 500 мг/л выступают как LC50 за 8 - 24 часа для ряда гидробионтов (Патин, 1988, 2001; Исакова, Колосова, 1989; Ларин, 1994). Взятый нами спектр концентраций взвешенных хроматов подходит для хронических опытов. Опыты сопровождались контрольными вариантами без введения взвеси. Условия содержания и культивирования дафний в лабораторных условиях. Устойчивые условия культивирования обеспечивали в шкафу-термолюминостате. Он представляет собой застекленную коробку с раздвижными передними стеклами и рядом полок для сосудов. В шкафу монтируются лампы дневного света, обеспечивающие освещенность около 400 - 600 лк в течение 10 - 12 ч в сутки. Для культивирования дафний использовали отстоянную воду из водопровода. Водопроводной водой пользовались после удаления из нее остаточного хлора путем длительного продувания воздуха с помощью микрокомпрессора (около 14 дней). Основные гидрохимические показатели воды, используемой для культивирования дафний: рН 7 - 8,2; содержание кислорода 6 - 8 мг Ог/л; окисляемость по Кубелю 4,2 - 5,8 О2 мг/л; общая жесткость 3 - 6,5 мг экв/л (200 ± 50 мг СаСОз). В качестве корма служили зеленые протококковые водоросли, пекарские дрожжи. Для кормления дафний водоросли отделяли от питательной среды 3-х суточным отстаиванием в холодильнике. Осадок разбавляли в два раза дистиллированной водой. Суспензия хранилась в холодильнике не более 14 дней. Кормление дафний проводилось 1 раз в день из расчета 1 мл суспензии (плотность 600 - 1000 млн. кл/мл) на 1 л воды. 1 - 2 раза в неделю дафний подкармливали пекарскими дрожжами из расчета 3 мл 1%-ой суспензии на 1 л культивируемой среды. Дафний, отловленных в природном водоеме, рассаживали в щ лаборатории в стеклянные кристаллизаторы емкостью 2 - 5 л при плотности посадки не более 25 особей на 1 л воды. Сосуды с дафниями размещали на полке люминостата. Культуральная среда обновлялась наполовину 1 раз в 7 дней.
Накопившийся осадок удаляли сифоном. Через 5 дней рачки адаптировались к новым условиям и начали партеногенетически # размножаться. Для токсикологических исследований использовали дафний, начиная с третьего поколения, полученного в лаборатории. Опыты проводили на синхронизированной культуре, на дафниях одного возраста, что снижает вариабельность исследований. Для получения синхронизированной . культуры 5 половозрелых самок рассаживали по одной в химические стаканы (200 мл воды). После появления первого помета у наиболее плодовитой самки молодь отбиралась и помещалась в 2-х литровый кристаллизатор для дальнейшего культивирования. Молодь второго поколения в возрасте 2 суток использовали в опыте. Постановка хронических опытов. Выше было отмечено, что для хронических опытов с дафниями нами были выбраны пять концентраций нерастворимых соединений хрома. Нерастворимые хроматы (примерно 2 - 3 г) после диспергирования в фарфоровой ступке пестиком помещались в литровый цилиндр. Он встряхивался с водой и оставлялся для осаждения крупных фракций на 2 часа. Обычно после этого получались суспензии, содержащие взвешенные вещества с концентрацией 300 - 400 мг/л. Далее вода с взвесью, над осевшими фракциями, сливалась и разводилась с таким расчетом, чтобы концентрация была 1 мг/л. Путем разбавления этого раствора готовились рабочие растворы для постановки опытов. Однако, чтобы избежать уменьшения концентрации хроматов взвесь в опытных стаканах с дафниями заменялась на новую три раза в неделю. При этом маточный раствор и рабочие растворы готовились заново. Длительность хронических опытов на дафниях составляла 21 сутки. Дафний содержали в химических стаканах объемом 200 мл. В опытные стаканы и контрольные помещали по одинаковому числу (10 экз.) 8-суточных дафний. В хроническом опыте основными показателями токсического действия тонкодисперсной взвеси являлись выживаемость дафний, плодовитость и качество потомства. Для качественной и количественной оценки приемами биотестирования влияния тонкодисперсных фракций нерастворимых хроматов нами были взяты из схемы анализа состояния дафний (Лесников, Мосиенко, 1992) следующие признаки: деформация карапакса, работа грудных ножек (забивание их слизью), питание, эмбриогенез дафний. При наблюдении за размножением рачков учитывали время появления первого помета, количество народившейся молоди в каждом помете. Подсчитывали количество рачков с отклонениями в эмбриогенезе. Общее количество народившейся молоди от одной самки отражало величину фактической плодовитости дафний. Продолжительность опытов с каждой генерацией определялась временем появления четырех пометов у контрольных дафний, что составляет обычно 21 сутки, а общая продолжительность опытов 40 - 45 суток. При проведении опытов на поколениях придерживались следующей схемы: молодь из первого помета, появившуюся от исходных особей, отсаживают в таком же количестве в соответствующие взвешенные вещества нерастворимых хроматов и ведут такие же наблюдения до получения двух поколений. По окончании опытов для каждого поколения подсчитывали средние значения выживаемости, плодовитости в пересчете на одну самку за все пометы. Результаты опытов сравнивали с контролем, достоверность отклонений определяли методами вариационной статистики. Достоверность полученных результатов можно считать надежной, так как были соблюдены следующие условия: 1) в контроле гибель дафний в конце опыта не превышала 10 %; 2) у контрольных рачков за срок 21 сутки получены 4 помета; 3) количество молоди на одну самку в исходном поколении в контроле было не менее 7 шт.; 4) время наступления половозрелости у дафний в контроле — не позднее 9 суток; 5) для проверки чувствительности культуры дафний ЛК5о бихромат калия за 24 ч для дафний из контрольных растворов находилась в диапазоне 0,9 - 2,0 мг/л. 2.3. Хироном иды Условия проведения опытов. Личинки хирономид были выбраны нами по многим причинам.
Будучи водными организмами, с покровами, легко проницаемыми для многих веществ, личинки хирономид весьма удобны для работы по влиянию на них различных веществ. Наличие в слюнных железах хирономид политенных хромосом значительно более высокой степени политении, чем у дрозофил, делает их незаменимым объектом для изучения многих вопросов структуры и функционирования хромосом. Политенные хромосомы гораздо крупнее митотических или мейотических. Политенные хромосомы — интерфазные хромосомы, которые позволяют наблюдать за дифференциальной активностью генов по пуфингу (Макгрегор, Варли, 1986). Пуфинг - процесс, служащий примером дифференциальной активности генов во время линьки и метаморфоза. Многие авторы указывали на возможность использования личинок хирономид для оценки генотоксичности химических веществ (Beerman,1961; Рапопорт, Дроздовская, 1971; Кикнадзе, 1972, 1975; Пашин, Козаченко, 1983; Lehman, 1984; Айла, Кайгер, 1987; Симаков и др., 1990; Симаков, 1998; Кунин, 2001). Определение генотоксичности соединений хрома и других тяжелых металлов в тонкодисперсных фракциях нерастворимых хроматов и их действия на дифференциальную активность генов проводили на предкуколке хирономид. Для получения предкуколок необходимо культивировать личинок хирономид. В качестве тест-объектов использовали лабораторную культуру личинок хирономид Chironomus plumosus и Chironomus thummi. Тонкодисперсные взвеси хроматов готовили в концентрациях: 0,25; 0,1; 0,05; 0,02 и 0,01 мг/л по методам, описанным выше. Концентрации дисперсных хроматов взяты с таким расчетом, что после разведения их с илом, в котором осуществляется культивация личинок хирономид, в соотношении 1:1, они будут соответствовать спектру концентраций для других тест-объектов. Учитывали также выживаемость личинок и процент вылетевших комаров. Условия лабораторного содержания.
Действие нерастворимых хроматов на дафний (Daphnia magna)
Дафнии, помещенные в воду, содержащую взвесь тонкодисперсных частиц хромата свинца, при концентрации 1,0 г/л, гибнут в течение суток. Указанная концентрация оказывает на дафний острое летальное действие. Нас мало интересовали острые токсикологические опыты и нахождение летальных медиальных концентраций, так как взвешенные частицы нерастворимых хроматов проявляют не только токсическое, но и механическое действие, засоряя фильтрующий аппарат дафний. Поэтому для оценки вредного действия взвешенной фракции нерастворимых 0 хроматов большое значение имеют хронические опыты, в процессе которых проявляется коммулирующий эффект действия взвеси нерастворимых хроматов. Помимо этого предстояло исследовать совместное действие хрома и тяжелых металлов, находящихся в нерастворимых соединениях, и сделать сравнительный анализ токсичности при различных комбинациях тяжелых _ металлов с хромом. По этой причине за верхнюю концентрацию взят уже утвержденный норматив для нетоксической взвеси в «Правилах охраны поверхностных вод» (1991) 0,25 мг/л. Далее спектр концентраций шел в сторону занижения. В концентрации взвеси PbCrQj 0,25 мг/л выживает только 23 % дафний, а при 0,1 мг/л концентрация может считаться близкой к медианно летальной (выживание 49 %). Концентрация 0,05 мг/л оказалась также действующей (выжило 66%), а концентрацию 0,02 мг/л, где выжило 89 % дафний, можно считать максимально допустимой. Из табл. 3.1 видно, что взвесь хромата стронция и хромата цинка менее токсична для дафний, чем хромат свинца. Совместное действие свинца и хрома во взвеси оказывает более токсическое действие по сравнению с другими сочетаниями металлов. Нарушения в работе грудных ножек в концентрации хромата свинца 0,25 мг/л были отмечены на протяжении всего времени экспозиции у 100 % дафний вплоть до их гибели. Наблюдалась обструкция в работе грудных ножек, замедление и полное прекращение их движений (рис. 3.5). В концентрации 0,1 мг/л нарушения в работе фильтровального аппарата обнаружены на вторые сутки у 18 % дафний, а к концу опыта проявились у 71 % особей. В концентрации 0,05 мг/л нарушения в работе грудных ножек составили на 7 сутки 33 % и на 14 сутки 36 %. В концентрации 0,02 мг/л нарушения в работе фильтровального аппарата обнаружены на вторые сутки у 9 % рачков, что можно считать допустимой и не влияющей на работу фильтровального аппарата. Хромат стронция и хромат цинка однотипно влияли на работу грудных ножек.
При концентрации 0,25 мг/л нарушение работы фильтровального аппарата соответственно наблюдалось у 60 % и 63 % дафний. При понижении концентрации взвешенных веществ до 0,1 мг/л частота биения ножек замедлялась при действии хромата стронция на 33 %, а хромат цинка снижал работу фильтровального аппарата у 40 % особей. В концентрациях взвеси хроматов стронция и цинка 0,05 мг/л и ниже падение частоты работы грудных ножек у дафний происходит в доверительных пределах, и верхнюю концентрацию можно считать максимально допустимой. Данные об изменении работы грудных ножек дафний, ноходящихся в различных концентрациях взвеси соединений хрома, приведены на рис. 3.5. Взвеси хроматов с более низкой концентрацией также не отражались на функции питания дафний. Токсическое действие тонкодисперсных фракций нерастворимых хроматов на эмбриогенез дафний оценивалось по состоянию яиц и зародышей в выводковой камере. Отмечена гибель яиц в марсупии и абортивный выброс яиц. Иногда яйца представляли сплошную пенистую массу или были деформированы. Наблюдалась так же асинхронность развития: наряду с крупными яйцами в марсупии могло быть много мелких яиц. Или же асинхронность проявлялась в том, что наряду с сформированными эмбрионами, имевшими один черный глазок, в выводковой камере могли быть неразвивающиеся яйца. Во взвеси хромата свинца при концентрациях выше 0,02 мг/л отмечена гибель эмбрионов на разных стадиях развития: одни эмбрионы имели два не слившихся глаза (стадия неоформленного эмбриона), другие были сформированными и имели один глаз. Токсическое действие взвешенных частиц хромата свинца на эмбриогенез дафний проявилось как в концентрации 0,1 мг/л, так и при, казалось бы, такой незначительной концентрации как 0,05 мг/л, когда эмбриогенез нарушался у 27% дафний (рис. 3.6). Данные о нарушении эмбриогенеза во взвеси нерастворимых хроматов представлены на рис. 3.6. При действии взвеси хромата цинка наибольшее эмбриотоксическое действие проявилось в концентрации 0,25 мг/л (наблюдалась гибель 52% эмбрионов). В других концентрациях эмбриотоксическое действие проявилось в зависимости от концентрации тонкодисперсных фракций хромата цинка в воде. При концентрации 0,1 мг/л нарушение эмбриогенеза отмечено у 30 % особей, а при более низких концентрациях разницы между контролем и опытом не найдено. По этой причине для хромата стронция и хромата цинка концентрацию взвеси в воде 0,05 мг/л можно считать максимально допустимой. Количество молоди, приходящееся на 1 исходную самку в концентрациях тонкодисперсной взвеси у исходных дафний и в первом поколении, представлено в табл. 3.2. Первое поколение дафний в присутствии хроматов созрело за 9 дней, что совпадает с данными, полученными ранее (Патин, 1998). В контроле первое поколение созрело за 7 дней. В присутствии тонкодисперсных нерастворимых хроматов количество выметов уменьшилось до 3. ф Количество молоди, приходящееся на 1 самку исходного поколения, в концентрациях взвеси 0,1 и 0,05 мг/л примерно в 3 - 7 раз ниже нормы, в первом поколении при концентрации 0,1 мг/л - примерно в 2,5 раза ниже, а допустимая концентрация с 0,02 повышается до 0,05 мг/л. Этот процесс говорит о некоторой адаптации дафний к тонкодисперсным взвешенным ф хроматам. Таким образом, подводя итоги токсического влияния тонкодисперсных фракций нерастворимых хроматов на исходных дафний, их поколение, удалось установить следующее: l.Bce исследованные тонкодисперсные хроматы обладают примерно одинаковой токсичностью по отношению к такому биологическому показателю как размножение; 2.
В концентрации взвеси хромата свинца 0,25 мг/л эмбриогенез был нарушен, и в потомстве выжило только 40 % дафний по отношению к контролю. Во взвеси хромата стронция и хромата цинка в указанной концентрации эмбриогенез был нарушен меньше, плодовитость дафний была выше, соответственно 52 и 48 %; 3. В концентрации 0,1 мг/л плодовитость у исходного поколения также нарушается, и на одну самку приходится молоди примерно в 3 - 7 раз меньше, чем в контроле; 4. Токсичной для плодовитости исходных дафний оказалась и концентрация 0,05 мг/л, хотя плодовитость дафний возрастает примерно в два раза по сравнению с предыдущей концентрацией; 5. Только при концентрации взвеси хроматов 0,02 мг/л токсический эффект не проявляется у исходных дафний и эту концентрацию можно считать максимально допустимой. 6. Первое поколение оказалось более устойчивым по сравнению с исходными дафниями к действию тонкодисперсных хроматов. Токсическое действие взвеси проявилось только при концентрациях 0,25 и 0,1 мг/л. В то время как уже при концентрации 0,05 мг/л показатели дафний по плодовитости становятся сопоставимыми с контролем. Концентрацию взвеси 0,05 мг/л для первого поколения дафний следует считать допустимой. 3.3. Влияние тонкодисперсных фракций нерастворимых хроматов на выживаемость и гаметогенез дрейссены (Dreissena polymorpha) Дрейссена (Dreissena polymorpha) - двустворчатый моллюск понтокаспийского происхождения. Относится к небольшому семейству Dreissenidae, представленному несколькими видами двух родов. Это очень пластичный вид, образующий большое количество вариететов. В настоящее время заселяет всю Европу, кроме северных районов, где температуры для него слишком низки. Населяет средние и нижние части рек Причерноморья, Прикаспия и Приаралья. Один из немногих двустворчатых моллюсков, населяющих воды с различной соленостью. Оптимальная соленость для этого вида 0 - 2/оо- Ареал ограничен соленостью 3-10 %о (А. Ф. Карпевич, 1947). Будучи эвригалинной формой, вид этот проник во все речные системы бассейнов южных и северных морей. Дрейссена характеризуется очень высокими репродуктивными возможностями.
Действие тонкодисперсных взвешенных хроматов на биологические показатели дрейссены
Данные хронических опытов по токсическому и физическому действию хромсодержащих тонкодисперсных нерастворимых хроматов нельзя оценить однозначно. Выживание дрейссены прямо пропорционально зависит от концентрации нерастворимых хроматов в воде. В литературе мало данных по действию взвеси с различными формами тяжелых металлов на дрейссену и других двустворчатых моллюсков. Сопоставление данных (Бухарицин и др., 1973; Симаков и др., 2000) по действию соединений хрома на выживание дрейссены с литературными по действию тяжелых металлов на моллюсков, показывает, что токсическое влияние нерастворимых соединений хрома сравнимо с действием такого тяжелого металла, как медь. По мнению Капкова В.И. (1971), комплексные соединения меди являются очень сильными моллюскоцидами. В растворе комплексных соединений меди в концентрации 1,0 мг/л за 20 суток погибло 50 % двустворчатых моллюсков (перловица). В нашем опыте почти за то же время экспозиции в концентрации взвеси 0,25 мг/л погибло 67,6 % от действия хромата свинца, 51,4 % во взвеси хромата стронция и 58,9 % при действии хромата цинка. В растворе СиСІг в концентрации 0,1 мг/л гибели двустворчатых моллюсков не отмечено, а в нашем случае гибель еще была высока и составляла от 39 до 51 % в зависимости от соединения. Можно считать, что соединения хроматов в тонкодисперсных частицах нерастворимых хроматов относятся к более сильным моллюскоцидам, чем хлорная медь. Данные по токсическому действию взвешенных хромсодержащих частиц на оогенез дрейссены показали, что токсическое влияние не проявилось в концентрации 0,05 мг/л. Развитие ооцитов в ацинусах гонады ничем не отличалось от контроля. Ацинусы в гонаде начали исчезать при концентрации взвеси 0,25 мг/л, величине, которая допустима как превышение над фоном, природным содержанием взвешенных частиц в воде водоема. Следовательно, этот норматив не может быть принят для хромнесущих тонкодисперсных фракций нерастворимых хроматов. Кроме того, при действии взвешенных нерастворимых хроматов в концентрации 0,25 мг/л в единичных ооцитах были отмечены цитологические нарушения. Иногда проявлялся стимулирующий эффект. Подобное явление, когда при медиальных концентрациях соединения оказывают стимулирующие влияние на количество ооцитов в ацинусах дрейссен, отмечено также Куниным (2001). При концентрации взвеси тонкодисперсных хроматов 0,1 мг/л в 45 % ооцитов дрейссен обнаружены цитологические аберрации, выражающиеся в ячеистости структуры цитоплазмы, распаде ядрышка в ядре, деформации ооцита.
Эта концентрация, безусловно, должна рассматриваться как влияющая на оогенез. При более низких концентрациях от 0,05 до 0,01 мг/л гистологическая картина оогенеза не отличается от контроля. В сравнительном плане оогенез оказался даже менее чувствительным показателем, чем выживаемость дрейссен, которая при действии хромата свинца нарушалась уже при концентрации 0,05 мг/л. Ооциты в своем развитии задержались на стадии протоплазматического роста, что, несомненно, приведет к нарушению процессов размножения у дрейссены. В концентрации 0,25 мг/л нерастворимые соединения хрома влияют на дрейссен. Большинство ооцитов в ацинусах не переходят в фазу трофобластического роста, что отрицательно сказывается на процессах размножения этих моллюсков. При этой концентрации уже возможно и накопление в мантийной полости моллюсков взвешенных частиц, и засорение фильтровального аппарата. Следовательно, здесь уже проявляется двойное воздействие тонкодисперсных фракций нерастворимых хроматов: токсическое и механическое. Токсический эффект действия взвеси нерастворимых хроматов при концентрациях 0,25 и 0,1 мг/л мы относим к действию хромсодержащих соединений, и можем сравнивать его с токсическое действием соединений Сг+6 и Сг+3. Ранее было показано, что при концентрации 0,01 мг/л в бихромате количество созревших ооцитов было в 5 раз меньше нормы, а азотнокислый хром оказал в этой концентрации стимулирующее действие на оогенез дрейссены (созревших ооцитов было в три раза больше нормы). Поскольку переход шестивалентного хрома в трехвалентный сопровождается под влиянием множества неучтенных факторов, то можно наблюдать как подавление, так и стимуляцию размножения оогоний в ацинусах. По нашему мнению за отрицательный эффект можно принимать любое отклонение от контроля: как стимуляцию размножения оогоний, так и ингибирование под влиянием взвеси нерастворимых хроматов. Помимо всего, действие взвеси тонкодисперсных частиц нерастворимых хроматов сопровождается влиянием других тяжелых металлов, входящих в состав хроматов. При этом совместное действие двух металлов может привести к усилению токсического эффекта. Следовательно, вполне допустимо проявление токсического эффекта выше аддитивного. 4.3. Изменения в гистологическом строении жаберного аппарата дрейссен при наличии взвеси нерастворимых хроматов При хроническом контакте взвеси нерастворимых хроматов в жаберным эпителием дрейссен происходит изменение строения жабр. При этом тканевая перестройка отмечается не только в эпителиальной, но и соединительной ткани. Наибольшей трансформации подвергаются опорные клетки жаберных лепестков. Под влиянием хроматов происходит гипертрофия опорных клеток, которые по своему строению напоминают магленизированные клетки злокачественных опухолей. Ядерно-плазменные отношения резко меняются в сторону ядра. Иногда возникает многоядерность. В настоящее время большинство работ по трансформации нормальных клеток в неопластические сделано на млекопитающих (Васильев и др., 1981; Напалков, 1989; Новиков, 1996). Механизм этого процесса на беспозвоночных почти не изучался, хотя не исключаются, что в опорных клетках жаберных лепестков идет размножение клеток амитозом, что очень часто наблюдается при апаптозе. Механизм образования гипертрофированных клеток опорной ткани пока неизвестен, но непосредственным идуктором, приводящим к трансформации клеток по морфологии похожих на неопластические, следует считать соединения хроматов. Опыты с хроматом свинца и хроматом цинка показывают идентичную картину на гистологических препаратах. Это еще раз может говорить о том, что действующим началом в перерождении тканей жабр дрейссен выступает хром, хотя он находится в нерастворимых соединениях. 4.4. Влияние нерастворимых хроматов на гидробионтов через грунт водоема В отличие от организмов - фильтраторов, на которых отрицательное действие оказывают взвешенные частицы хроматов, личинки хирономид контактируют с нерастворимыми соединениями хроматов через грунт водоема. В этом случае токсическое воздействие производят осевшие частицы нерастворимых соединений хрома, которые могут попадать в пищеварительную систему личинок хирономид и контактировать непосредственно с наружными покровами.
Выживание личинок хирономид Ch.plumosus и Ch.thummi при наличии в грунте нерастворимых хроматов показывает, что только концентрация взвеси 0,02 мг/л не влияет на выживаемость личинок хирономид. В более высоких концентрациях нерастворимые хроматы выступает как токсикант и оказывает воздействие на выживаемость личинок хирономид, сопоставимое с действием растворимых хроматов и бихроматов. Как и взвесь тонкодесперсных частиц в воде, осевшие в грунт нерастворимые хроматы проявляют общее для них токсическое действие в зависимости от химического строения. Наибольшую токсичность проявляет хромат свинца. Выживаемость личинок хирономид не нарушается только при концентрации 0,02 мг/л. В то же время хромат стронция и хромат цинка оказались менее токсичными, и максимально допустимая концентрация для них оказалась не 0,02 мг/л, а 0,05 мг/л. Следовательно, хромат свинца примерно в 2,5 раза более токсичный, чем хромат стронция и хромат цинка. Сравнительный анализ действия нерастворимых хроматов на личинок хирономид двух видов показывает, что они примерно одинаково реагируют на исследуемые соединения, присутствующие в грунте. И в том, и другом случае хромат свинца проявляет более токсические свойства по сравнению с хроматом стронция и хроматом цинка. Проведенные эксперименты позволяют сравнить токсическое действие нерастворимых хроматов во взвеси и при осаждении их в грунт, и показывают, что не смотря на различные тест-объекты и различные среды обитания (биотопы) подопытных организмов, действие исследуемых соединений на выживаемость гидробионтов сходно.
