Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Фракталоподобные структуры, образованные гидробионтами, в норме и при воздействии антропогенных факторов (обзор литературы) 8
1.1 Современные теории морфогенеза и фракталоподобные структуры 8
1.2 Способы клеточной миграции в морфогенезе 26
1.3 Хемотаксис . 27
1.4 Гаптотаксис 28
1.5 Гальванотаксис 29
1.6 Контактное ориентирование 30
1.7 Контактное ингибирование движения при образовании фрактаюподобных структур 31
1.8 Термодинамическая модель клеточных взаимодействий 32
1.9 Изменения в строении клеточной поверхности 35
1.10 Регуляция пространственной организации за счет колебательных процессов 36
ГЛАВА 2. Материал и методы исследований 46
2.1 Исследование фракталоподобных структур на клеточном уровне 46
2.2 Исследование фракталов на органном уровне 49
2.3 Материал и методы исследования фракталов на уровне популяций 58
ГЛАВА 3. Результаты исследований 62
3.1 Результаты исследований влияния патогенных факторов на фракталоподобные структуры на клеточном уровне 62
3.2 Моделирование фракталоподобного роста волокон хрусталика и его аномалий при действии неблагоприятных факторов (органный уровень) 68
3.3 Формирование фракталоподобных структур на надклеточном уровне в норме и при действии антропогенных факторов 80
3.4 Процессы формирования фракталов на уровне популяций микроорганизмов изучались на примере структур, образованные свободноплавающими хламидомонадами в нормальных условиях и в условиях физико-химического воздействия на культуру. 80
3.5 Влияние техногенных полей, образованных дисплеем, на формирование фракталов 89
3.6 Формирование паттернов одноклеточными водорослями в солоноватоводных микроэкосистемах при наличии токсикантов 91
3.7 Рост патогенных микроорганизмов после экспозиции у экрана монитора компьютера и влияние на него автогенератора КВЧ 93
Использованная литература 101
- Хемотаксис
- Изменения в строении клеточной поверхности
- Исследование фракталов на органном уровне
- Формирование фракталоподобных структур на надклеточном уровне в норме и при действии антропогенных факторов
Введение к работе
В настоящее время проблема охраны рыбохозяйственных водоемов от загрязнений промышленными отходами и защита водных организмов от техногенных полей представляет одну из актуальных проблем в гидробиологии. Наиболее перспективным направлением в этом вопросе можно считать разработку методов биотестирования, которые позволяют оценить вредное воздействие ксенобиотиков и физических техногенных полей на гидробионтов, как в комплексе, так и при действии одного фактора. При создании методов биотестирования исследователи сталкиваются с одной из труднейших задач, связанной скорее не с практическим применением того или иного тест-объекта, а с теоретической концепцией основ биотестирования, которая слабо разработана. На самом деле так и происходит. Можно ли подобрать универсальный, наиболее чувствительный тест-объект для биотестирования последствий воздействия различных физико-химических факторов? При той тенденции, которая взята за основу в настоящее время, - это практически невозможно. Разве можно найти такой универсальный организм, который отвечал бы одинаково на действие самых различных по своей природе физико-химических факторов и был бы к ним наиболее чувствителен? Скорее всего, нет. Видимо, для тестирования надо брать не организм или его индивидуальную функцию, а общий показатель, не зависящий от систематического уровня и субстрата, но чутко улавливающий вредное воздействие токсикантов и техногенных физических полей. Такой тест-системой мы считаем - морфогенез фракталов, который присутствует на всех уровнях организации гидробионтов, и который подается математическому моделированию и обработке с помощью компьютерных программ.
За последние годы наблюдается интеграция научных знаний и формирование новых концепций, лежащих на стыке наук. Одной их таких
областей можно считать морфогенез на уровне клеток, органов, организмов и надорганизменных образований. Морфогенез живых организмов происходит при упорядочивании живого вещества за счет перераспределения энергии, колебательных процессов и реализации пространственной наследственной программы. Однако некоторые исследователи отдают предпочтение только одному из перечисленных механизмов развития. Часть из них считает, что резонансные колебательные процессы ответственны за форму развивающегося организма (Гудвин, 1972; Дьюкар, 1976, Иванов, 2000), другие придают большее значение в морфогенезе биосолитонам (Филиппов, 1990; Петухов, 1999).
Проблемы морфогенеза еще далеко не решены. К тому же, это один из сложнейших процессов, которые не во всех случаях могут быть смоделированы с помощью компьютерный программ. Вот почему мы предлагаем исследовать наиболее удобный для математического анализа морфогенез фракталов, теория которых уже достаточно разработана. В лабиринте живых форм мы всегда можем найти и выделить фракталы, так как это одна из составных частей формирования пространственной структуры организмов и надорганизменных образований.
Цель работы - Выявление особенностей морфогенеза и математического моделирования фракталов, образованных гидробионтами на различных уровнях организации, при воздействии антропогенных факторов для создания новых экспресс-методов биотестирования и прогнозирования вредных воздействий на водные организмы.
В соответствии с целью решались конкретные задачи:
1. Выявить воздействие комплекса загрязнителей в реке Селенга на морфогенез меланофоров (фракталоподобные структуры) в раннем онтогенезе байкальского омуля (клеточный уровень).
2. Вскрыть механизмы фракталоподобного роста волокон хрусталика при цито-дифференцировке в линзе глаза травяной лягушки и создать компьютерные модели формирования швов хрусталика (органный уровень).
3. Оценить воздействие вредных физико-химических факторов на хрусталик травяной лягушки, как на фракталоподобную систему.
4. По нарушению морфогенеза фракталов, образованных свободноплавающими хламидомонадами определить степень вредности электромагнитных полей и ряда химических соединений, загрязнителей рыбохозяйственных водоемов (надорганизменный уровень).
5. Выявить действие загрязнителей водной среды на формирование фракталов солоноватоводными водорослями - нефрохлорисом.
6. Оценить действие комплекса физических полей, идущих от монитора компьютера и ЧПУ-станков на формирование фракталоподобных паттернов хламидомонадами, бактериями и дрожжами.
Научная новизна работы. В ходе исследований впервые показано, что на различных уровнях организации (от клеточного - до надорганизменного) гидробионты и их живые структуры способны образовывать фракталы, морфогенез которых обладает высокой чувствительностью к вредным физико-химическим факторам, выступающим как загрязнители окружающей среды.
Впервые на примере хрусталика глаза травяной лягушки показано, что фракталоподобный рост может быть смоделирован с помощью компьютерных программ, и это позволяет вскрыть механизмы формирования фракталов в однообразных клеточных системах. Установлено, что симметричные нарушения прозрачности у заднего шва в хрусталиках -результат воздействия на фракталоподобный рост волокон вредных физико-химических факторов.
Выявлена высокая чувствительность клеток, обладающих фракталоподобным ростом (меланофоры рыб), к неблагоприятным факторам водной среды, в которой проходит ранний онтогенез рыб.
Впервые показана пространственная устойчивость фракталов образованных свободноплавающими хламидомонадами, находящихся в сосудах различной формы. Выявлено действие загрязнителей и техногенных полей, которые в малых дозах выступают как стрессоры и усложняют пространственную структуру фрактала, а в больших дозах приводят к разрушению фракталоподобной структуры паттерна.
Показано комплексное действие малых доз техногенных полей, идущих от экрана монитора, на рост и формирование фракталов свободноплавающими хламидомонадами и выращенными на МПА бактериями и дрожжами.
Практическое значение работы заключается в унификации методов биотестирования и прогнозирования вредного воздействия физических и химических загрязнителей водной среды. Биотестирование предлагается проводить по влиянию исследуемых факторов на фракталы, образованные гидробионтами на различных уровнях структурной организации. По результатам исследований предложен метод биотестирования природных и сточных вод по образованию фракталов свободноплавающими хламидомонадами.
Возникновение симметричных поражений в хрусталиках глаз позволит провести диагностику возникновения катаракт у рыб и амфибий и прогнозировать дальнейшее развитие помутнения хрусталика.
Использование свободноплавающих хламидомонад и, а также бактериальных и дрожжевых культур, дает возможность определить вредное воздействие комплекса полей, идущих от монитора компьютера и ЧПУ, и выявить зоны наиболее опасного нахождения оператора вблизи монитора.
Работа человека на транспорте, в промышленности и в научных лабораториях в настоящее время не обходится без повышенного облучения
электромагнитными волнами. Вредное воздействие электромагнитных излучений может быть оказано и в быту, так как оно идет от компьютеров, телевизоров, сотовых телефонов, СВЧ - печей и ряда других приборов. По изменению фракталов и скорости роста микроорганизмов нами испытано действие прибора для защиты от вредного излучения электромагнитных волн, представляющего собой автогенератор КВЧ (Сеит-Умеров, 1998).
Хемотаксис
Хемотаксисом называют движение клеток в направлении градиента концентрации какого-либо химического фактора, содержащегося в растворе (Armstrong, 1985; Гильберт. 1995). Клетки будут воспринимать химический сигнал и перемещаться в направлении повышающейся концентрации до тех пор, пока не достигнут источника секреции этого вещества (Vasiev et all., 1999; Dokoumetzidis et all., 2003). Однако легко составить представление о хемотаксисе и трудно подтвердить его существование. Во-первых, скопление клеток в данном месте может объясняться тем, что они просто попадают в «ловушку». Во-вторых, не исключено, что растворимый фактор только стимулирует подвижность клеток, а при наличии лишь одного пути миграции их перемещение будет имитировать хемотаксис (Zigmond, 1978; Trinkaus, 1972; Myerscough et all., 1998 Wagle et all., 2000). Мы уже приводили два примера хемотаксиса, имеющего место в развитии. Спермин морского ежа перемещаются по градиенту низкомолекулярных веществ, выделяемых студенистой оболочкой яйца, а секретируемые опухолью факторы, вызывающие ангиогенез, обусловливают миграцию эндотелиальных клеток капилляров к опухоли.
Можно ли процессы морфогенеза, протекающие в зародыше, объяснить хемотаксисом? По крайней мере, в одном случае миграция клеток обусловлена специфическими хемотаксическими факторами. Это миграция предшественников лимфоцитов из костного мозга в эмбриональный тимус (где они становятся Т-клетками иммунной системы), обусловленная растворимыми факторами, которые секретируются клетками тимуса. Дляподтверждения хемотаксиса (Champion et al., 1986) клетки костного мозга перепела помещали на границе между двумя камерами, составляющей в длину 1 мм. Если в обеих камерах среда была нормальной, то направленного движения не наблюдалось. Но если одна из камер содержала среду, в которой культивировались эпителиальные клетки эмбрионального тимуса, то происходила специфическая миграция клеток костного мозга в эту камеру. Веществом, обусловливающим хемотаксис, оказалось низкомолекулярное соединение (от 1000 до 4000 дальтон), стабильное при 95С и разрушающееся под действием протеаз. Это вещество не исследовали in vivo, но можно полагать, что миграция лимфоидных предшественников в развивающийся тимус направляется небольшим пептидом, который секретируют эпителиальные клетки эмбрионального тимуса. Гаптотаксис
Градиенты возникают не только в растворе. Молекулы, обусловливающие адгезию, также могут образовывать градиенты во внеклеточном матриксе. Любая клетка, постоянно образующая и разрушающая адгезионные контакты с такими молекулами, будет перемещаться из области их низкой концентрации к месту высокой концентрации. Это явление называют гаптотаксисом (Curtis, 1969). Экспериментально было показано (Harris, 1973), что клетки в культуре способны мигрировать по градиенту концентрации вещества, добавленного в пластик культуральной чашки, но условия должны быть достаточно жесткими. Если субстрат окажется недостаточно липким, то клетки будут отклоняться от правильного пути, если же субстрат будет слишком липкий, то клетки к нему просто прилипнут.
Имеются данные (Poole, Steinberg, 1982), свидетельствующие о том, что миграция клеток протока первичной почки выявляется в виде овальной массы вблизи головы зародыша, но по мере его развития этот образование распространяется вдоль вентролатеральной границы смитов до тех пор, покане достигнет клоаки (места выделения мочи). Рост протока осуществляется путем миграции исходной клеточной популяции. При этом клеточных делений не отмечено, индивидуальные клетки не удлиняются, а краситель, использованный для мечения клеток заднего конца зачатка пронефроса у раннего зародыша, обнаруживается вблизи клоаки на поздних стадиях. Таким образом, очевидно, что клетки зачатка пронефроса мигрируют по определенному пути из одного места на поверхности зародыша в другое.
Можно полагать, что фактор, определяющий эту миграцию, поляризован (т.е. локализован в виде градиента) на поверхности зародыша. Эту миграцию нельзя объяснить хемотаксисом, поскольку удаление области клоаки ее не прекращает, а пересадка клоаки в другие области зародыша не изменяет направление миграции зачатка пронефроса. Миграцию не определяет форма зародыша, не обусловливается она и электрическим градиентом. Если зачаток пронефроса одного зародыша пересадить другому, то проток донора всегда перемещается дорсально вдоль боковой мезодермы, чтобы соединиться с протоком хозяина, а затем мигрирует под сомитами каудально по направлению к клоаке. Трансплантированный проток никогда не смещается вентрально или к голове, какой бы ни была его ориентация при имплантации (Zackson, Steinberg, 1987). Согласно полученным данным, у зародышей хвостатых амфибий на поверхности мезодермы существует градиент щелочной фосфатазы; этот градиент располагается в вентродорсальном и переднезаднем направлении. Устранение градиента ингибиторами щелочной фосфатазы останавливает миграцию протока пронефроса. Таким образом, вдоль клеточных поверхностей, по-видимому, существуют градиенты молекул, ориентирующие клетки при их миграции в зародыше.
ГальванотаксисВозможен еще один источник полярных градиентов в зародыше -заряженные ионы. Разница потенциалов между клетками и их окружениемможет играть ключевую роль в развитии (как и в процессе оплодотворения). Существует ли разница потенциалов между отдельными частями зародыша и насколько важна такая разница для морфогенеза?
В 1920 г. в лаборатории Гаррисона были получены данные, свидетельствующие о том, что растущие нервные волокна располагаются вдоль электрических силовых линий. Однако спустя 14 лет аналогичные эксперименты в той же лаборатории дали иные результаты, в связи с чем представление о влиянии электрических токов на морфогенез (гальванотаксис) потеряло свою популярность. Положение изменилось, когда Яффе и Нуччителли (Jaffe, 1981; Nuccitelli, 1984) сконструировали зонд, способный выявлять исключительно малые электрические токи в живом организме. Этих слабых электрических полей (10-100 мВ-мм"1) оказалось достаточно для изменения направления роста нервов или для его ускорения в направлении отрицательного полюса. По-видимому, электрический ток обусловливает приток ионов Са+ в особую зону конуса роста, вызывая сборку цитоскелета и движение в определенном направлении (Cooper, Schuwa, 1985). Фибробласты куриного зародыша также мигрируют к отрицательному полюсу при культивировании их в слабом поле постоянного тока. Более сильные электрические токи зарегистрированы у раннего куриного зародыша, в регенерационной бластеме конечностей некоторых амфибий и в яичнике бабочки Cecropia (Гильберт, 1995). В последнем случае электрический ток, вероятно, играет важную роль в избирательном транспорте (наподобие электрофореза) материала из фолликулярных клеток в ооцит. Однако роль таких токов в направленной миграции аксонов еще недостаточно изучена.
Изменения в строении клеточной поверхности
Формирование тканей и органов обусловлено событиями, происходящими на клеточной поверхности соседних клеток. Клеточная поверхность включает: плазматическую мембрану клетки, молекулы, расположенные непосредственно под ней и с ней связанные, и молекулы, находящиеся во внеклеточном пространстве. Эукариотические клетки окружены сложным молекулярным пограничным слоем, называемым плазматической (или клеточной) мембраной. Современные представления о строении этой мембраны укладываются в жидкостно-мозаичную модель. Основу мембраны составляют два слоя фосфолипидов, полярные концы которых ориентированы в сторону водных растворов с каждой стороны фосфолипидной среды. Некоторые белки пронизывают мембрану насквозь, тогда как другие лишь частично погружены в фосфолипидный би-слой. Распределение белков обусловливает «мозаичность» мембраны. Способность белков перемещаться в плоскости фосфолипидного матрикса служит свидетельством ее «жидкостной» природы. Многие мембраны содержат также достаточно большие количества углеводов. Эти сложные сахара присоединены к липидам и белкам на наружной поверхности мембраны.
Диффузия белков в мембране служит примером пассивной диффузии и не требует затраты энергии клеткой. Специфические белки, однако, могут быть вынуждены перемещаться определенным образом. Если антитела, полученные к специфическим мембранным белкам, добавить к содержащим эти белки клеткам в избытке, то белки перераспределяются, образуя сначала пятна, а затем «колпачки» ("caps") на одном из концов клетки. Этот процесс, называемый кэпингом, зависит от энергии и от системы микротрубочек и микрофиламентов клетки (Edelman, 1976; Nicolson, 1976). Он наблюдается в нормальных клетках при перемещении специфических молекул вопределенную область мембраны. Его можно наблюдать также при поляризации бластомеров млекопитающих перед компактизацией.
Мы располагаем данными о том, что микрофиламенты и микротрубочки находятся в контакте с плазматической мембраной и контролируют движение мембранных белков. Например, в процессе фагоцитоза количество клеточных мембранных ферментов не уменьшается: несмотря на включение мембраны в клетку (интернализацию), ферменты остаются снаружи. Следовательно, клетка каким-то образом запрещает белкам помещаться в том участке мембраны, который подлежит интернализации. Если же фагоцитоз частиц происходит в присутствии ингибитора образования микротрубочек колхицина, то количество ферментов на поверхности клеток уменьшается (Ukena, Berlin, 1972). Эти данные свидетельствуют о том, что взаимодействия цитоскелета и мембраны контролируют положение некоторых мембранных белков (Hoop et all., 2000).
Изменения, происходящие при действии антропогенных факторов, во фракталоподобной структуре меланофоров рыб, которые мы рассмотрим ниже, скорее всего, связаны взаимоотношениями цитоскелета и мембраны в пигментных клетках гидробионтов.
Регуляция пространственной организации за счет колебательныхпроцессовФракталы образованные отдельными клетками, а то и молекулами, составляющими клетку, огромны по сравнению с элементами, из которых они составлены. Например, в клетке эукариот содержится не менее 107 молекул белка. Расчет поведения таких молекул в макросистеме, в который образован фрактал, невозможен. Возникает также вопрос, как вообще существуют такие огромные по сравнению с молекулами макросистемы, ведь различные спонтанные флуктуации должны были бы привести к разрушению структуры (Белоусов, 1987). Ранее мы уже говорили о механизмах, которые могут поддерживать структуру живых фракталов, как целостную систему. Помимоэтого важную роль в регуляции пространственной организации фракталов играют колебательные процессы, как линейные, так и нелинейные, порождающие биосолитоны (Петухов, 1999).
Одной из ранее выдвинутых гипотез влияния колебательных процессов на формирование пространственной структуры у развивающихся организмов была концепция разработанная Б.Гудвиным.
Гипотеза Гудвина позволяет объяснить регулярную пространственную структуру сомитов и тот факт, что подобные структуры у многих, животных всегда повторяются (метамерная сегментация), что характерно также для фракталов и выражает принцип самоподобия. Однако, создавая свою гипотезу, Гудвин (Goodwin, 1971) не имел в виду эту проблему. В это время еще не откристаллизовалась теория фракталов. Гудвин рассматривал два колебательных сигнала, испускаемых некоторым участком зародыша, выполняющим регуляторныё функции, и следующих один за другим через определенные промежутки времени. Если представить себе, что эти сигналы проходят по оси симметрии зародыша, и если один из них имеет более высокую частоту, чем другой, то временной интервал между поступлением двух разных сигналов "будет различаться в зависимости от точки, достигаемой ими на оси зародыша (Рис. 1). Можно допустить, что это различие в интервалах обусловливает активацию разных генов в разных точках оси зародыша и тем самым приводит к образованию разных органов; оно, вероятно, могло бы создавать основу для кранио-каудальной дифференцировки зародыша. Можно представить себе также другой эффект, который возникал бы, если бы оба сигнала имели достаточно высокую частоту, так что на оси зародыша было бы несколько точек, которые имели бы одинаковые временные интервалы или даже совпадали бы (Рис. 2). Это могло бы привести к активации одних и тех же генов в равноотстоящих точках вдоль оси (если допустить, что сигналы проходят вдоль всего зародыша с одинаковой скоростью).
Два последовательных сигнала S и Pj испускаются в виде колебаний от области Сі у анимального полюса. Следующий сигнал Р2 испускается из области будущей дорсальной губы бластопора, которая является центром серого серпа (Сг). В точках, обозначенных Xj и Х2, интервалы во времени между сигналами Pi и Р2, постепенно возрастают. Согласно гипотезе Гудвина, эти различающиеся временные интервалы несут информацию, обусловливающую дифференцировку зародыша вдоль передне-задней оси.
В другом случае к образованию ряда одинаковых структур, расположенных вдоль оси зародыша с равномерными промежутками, также могут привести колебательные процессы в двух центрах. В качестве простейшей аналогии можно представить себе два звуковых колебания разной частоты. При совпадении их максимумов через равномерные временные интервалы происходят резонансные явления. Гудвин не дошел в своих первоначальных построениях до допущения такого рода эффектов, однако, другие исследователи представляют, что подобное многократное взаимное подкрепление двух рассматриваемых сигналов, происходящее с равномерными интервалами вдоль оси зародыша, может служитьмеханизмом, объясняющим возникновение таких повторяющихся сегментированных структур, как сомиты (Дьюкар, 1978). Можно, следовательно, считать, что при экспериментальном удалении или добавлении ткани зародыш оказывается способным восстановить status quo, регулируя частоту двух рассмотренных сигналов таким образом, чтобы число совпадающих пиков при новой длине ткани было равно их числу у нормального зародыша (При этом, естественно, возникает следующий вопрос: а как осуществляется эта регуляция?) (Рис. 2).
Гипотезы, подобные гипотезам Гудвина, в настоящее время могут показаться архиспекулятивными, однако ценность их в том, что они подсказывают направления экспериментальных исследований. В сущности, успех научных исследований в любой области зависит от сочетания интуитивных построений и их экспериментальной проверки. Для того чтобы подтвердить гипотезу Гудвина, необходимо установить, что в зародышах действительно возникают какие-то колебательные явления, а затем продемонстрировать, что искусственные колебательные сигналы, имитирующие эти явления, оказывают на осевую дифференцировку зародыша определенное влияние, характер которого можно предсказать. Необходимую для этого информацию клетки, по-видимому, добывают активным образом, выбрасывая псевдоподии и «обследуя» поверхностисоседних клеток. На более поздних стадиях, когда клетки менее подвижны, гораздо труднее выявить, реагируют ли они на изменение положения и если реагируют, то каким образом. Возможно, однако, что они все еще обследуют поверхности соседних клеток, хотя и в более скромных масштабах, при помощи микроворсинок, которые видны в некоторых точках на их поверхности при изучении с помощью электронного микроскопа. Возможно также, что клетки обмениваются информацией о своем относительном пространственном расположении благодаря наличию разного рода контактов между их мембранами. Дальнейшие наблюдения и экспериментальные исследования в этой области крайне необходимы.
Еще ранее в реакционно-диффузионной модели Тьюринг описал поведение двух веществ, одно из которых, S, ингибирует продукцию другого - Р. Вещество Р способно к автокатализу и катализу вещества S. Если вещество S диффундирует быстрее Р, то в соответствии с уравнением Тьюринга концентрация вещества Р будет представлять собой волнообразную кривую с резкими пиками (Рис. 3). Подобные волны можно наблюдать в некоторых химических реакциях, причем они распространяются в трех измерениях (Welsh et al., 1983). (Описанный процесс аналогичен гармонике вибрирующих струн, как, например, у гитары, где разрешаются лишь определенные резонансные вибрации, определяемые длиной струны.)
Исследование фракталов на органном уровне
Исследование фракталоподобных структур на органном уровне проводилось на примере хрусталика лягушек Rana temporaria.
Естественные отклонения в строении хрусталика, роговицы и сетчатки, вызванные как наследственными факторами, так и факторами среды, встречаются у животных довольно часто (Bellows, 1944; Nordmann, 1954; Попов и др., 1962).
Нередко врожденные отклонения в строении хрусталика морфологически сходны с поражениями, полученными глазом под действием различных физических и химических факторов, исключая только сильные механические травмы (Francois, 1936, 1941). Механизм действия генного аппарата при наследственных заболеваниях хрусталика, приводящий к гистологическим изменениям волокон и эпителия, не выяснен. Известно, что ретикуло-эндотелиальная система (РЭС) в ответ на поражение хрусталика одного глаза вырабатывает аутоанититела (Мишер, Форлендер, 1963), которые могут воздействовать на хрусталик второго глаза, вызывая в нем подобные же изменения. Поэтому определить, один или оба глаза имеют врожденный дефект, невозможно. Свойство хрусталика бесхвостых амфибий (не обладающего регенерационной способностью) сохранять полученное им однажды поражение в течение всей жизни делают его удобным объектом для изучения аномалий и аутоиммунных реакций. Требования к оптическим свойствам хрусталика и как следствие к правильности его геометрической формы и позволяют использовать данный орган как объект для изучения процессов морфогенеза, обладающих повышенной точностью и согласованностью разных частей развивающихся тканей. В то же время хрусталик имеет относительно простую цитологическую архитектуру. Особый интерес представляет механизм образования шва при стыковке формирующих хрусталик волокон в передней и задней частях хрусталика. Данный шов обладает самоподобной структурой, что позволяетпредположить его формирование при помощи относительно несложных итеративных процессов.
Процесс морфогенеза хрусталика был смоделирован при помощи численных методов компьютерной графики. Была разработана серия трехмерных моделей с разным уровнем детализации и количеством параметров для проверки промежуточных гипотез. Для моделирования были использованы библиотека трехмерной графики OpenGL и среда программирования Delphi. Вычислительная сложность модели требовала производительного PC-совместимого компьютера и позволяла производить моделирование в реальном времени для небольшого количества клеток и слоев и в замедленном временном масштабе для более сложных моделей. Модели позволяли отследить не только конечные или промежуточные результаты развития органа, но и проследить процесс роста и межклеточного взаимодействия в динамике. В модели были реализованы известные механизмы морфогенеза, включая контактное торможение и контактное ориентирование, гаптотаксис и хемотаксис.
Компьютерная модель позволяет изучать процесс развития хрусталика, начиная с фазы образования первого слоя после миграции клеток переднего эпителия хрусталикового пузырька в его экваториальную область и заканчивая завершением роста заданного в модели количества слоев хрусталиковых волокон. Численный эксперимент по моделирования роста органа считался законченным, когда модель достигала устойчивого состояния, и в течение фиксированного числа тактов (является задаваемым параметром) не происходило существенных изменений в состоянии составных частей модели.
Все построенные модели являются дискретными итеративными моделями, в которых моделирование непрерывных процессов развития слоев хрусталика рассчитывается при помощи последовательных итераций расчета роста на небольшую величину (задаваемую при начале симуляции) ипоследующего расчета взаимодействия между клетками растущего слоя. Соответственно, точность моделирования зависит от размера временного и пространственного шага. С другой стороны, время и производительность компьютера, требуемые для симуляции даже небольших систем, растут с уменьшением шага симуляции (увеличением точности) и быстро становятся неприемлемыми с точки зрения временных и вычислительных ресурсов, поэтому обычно на практике из эмпирических соображений выбирается некоторый оптимальный уровень точности.
Первая модель содержала один слой клеток, растущих равномерно и с одинаковым угловым шагом от экватора к полюсам хрусталика. Хрусталиковый пузырек моделировался сферой, клетки были представлены сегментами тора с полусферами на концах. Внутренний радиус клеток оставался постоянным в процессе роста. Радиус тора так же оставался постоянным и подбирался из условия прилегания клетки к хрусталиковому пузырьку. В процессе роста угол сегмента увеличивался с некоторого минимального значения в 0.2-1 градус до 180 градусов. Численно отслеживались пересечения концов различных клеток друг с другом для имитации контактного ингибирования. В случае пересечения концов рост обеих клеток останавливался. В случае пересечения растущей клетки с остановившейся в росте клеткой, рост также останавливался.
Вторая модель содержала усложненное поведение клетки на поверхности хрусталикового пузырька. Модель позволяла симулировать рост клеток, ассоциированный с утоньшением концов по мере приближения к полюсам, а так же имитировать закручивание на заданный угол, соответствующий углу кручения клеток in vivo. Угол закручивания был постоянен по всему пути роста клетки. Толщина клетки убывала по мере приближения к полюсам пропорционально длине текущей «параллели».
Первая и вторая модели были полностью детерминированными, т.е. состояние на каждом последующем шаге однозначно определялосьсостоянием модели на предыдущих шагах, и ход каждого эксперимента (моделирования роста данного слоя клеток) полностью определялся набором начальных параметров.
Третья модель была создана для проверки промежуточной гипотезы о влиянии случайности и асинхронности роста на конечную геометрию хрусталика и фракталоподобную форму швов. Данная модель использовала генератор случайных чисел, который влиял на скорость роста каждой клетки. Величина влияния задавалась в параметрах модели.
Четвертая модель не использует генератор случайных чисел (в процессе эксперимента цель получения фракталоподобного рисунка шва была достигнута без применения случайных чисел), но в то же время не является полностью детерминистической, поскольку использует «эволюционный подход». Суть данного подхода заключается в том, что путь роста каждой клетки явно не использует случайные параметры, но и не определен точной формулой, а зависит от столкновения с соседними клетками. Более того, каждая клетка не прекращает расти на протяжении всего процесса моделирования, а все время продолжает искать пути возможного роста при помощи регулярных продольно-поперечных колебаний в некотором интервале углов к общему направлению роста к полюсам. Данный принцип часто проявляется при морфогенезе органов, в процессе миграции клеток к месту назначения или в процессе прорастания клеток по заданным теми ли иными факторами (морфогенами или физическими свойствами среды) путям к месту назначения. На данной модели из-за ее специфики (большого количества вычислительных итераций и сильной зависимости от значений параметров модели на предыдущем шаге) проявляется эффект возникновения неопределенности из-за усиления малых погрешностей вычисления формул на компьютере, обычно незначимый для моделей с меньшими возможностями накопления ошибки. С другой стороны, данная особенность модели не рассматривалась как
Формирование фракталоподобных структур на надклеточном уровне в норме и при действии антропогенных факторов
Процессы формирования фракталов на уровне популяций микроорганизмов изучались на примере структур, образованные свободноплавающими хламидомонадами в нормальных условиях и в условиях физико-химического воздействия на культуру.
При помещении культуры хламидомонад в стеклянные трубки диаметром от 5 до 20 мм и длиной от 50 до 1 000 мм жгутиконосцы образуют клеточные скопления, которые при горизонтальном расположении трубки представляют собой поперечно-исчерченный паттерн. Ширина полос колеблется от 2 до 3 мм, расстояние между полосами 4-10 мм, полосы направлены перпендикулярно поверхности Земли (Рис. 27). От длины трубки и ее диаметра чередование полос мало зависит. Наклон трубки относительно горизонтальной плоскости па 20, 30 и 45 показывает, что полосы скоплений хламидомонад перестраиваются в ней и через 60-80 сек. снова принимают перпендикулярное направление к поверхности Земли (Рис. 28). При охлаждении трубки с культурой до -3С расстояние между полосами не меняется, зато полосы уплотняются, и их толщина становится около 1,5 мм.
Культуры хламидомонад в прямоугольную ванночку 220x50 мм дает им возможность сформировать паттерн с центральной полосой, от которой до боковой стенки ванночки отходят дополнительные ветви (Рис. 27).
В чашке Петри популяция хламидомонад образует своеобразно изогнутую полосу, идущую на одинаковом расстоянии от боковой стенки чашки. Выпуклой поверхностью полоса соединяется отходящими от нее ветвями со стенкой чашки, а от вогнутой поверхности боковые ветви оторваны, но направлены по радиусам чашки (Рис. 29).
Наконец, помещение свободноплавающих хламидомонад в квадратную ванночку 220x220 мм, позволяет им полностью реализовать образование паттерна, то есть использовать пространственную информацию для построения рисунка без ограничения стенками сосуда. При этом также наблюдается скопление клеток в виде полосы и отходящими от нее ветвями,которые на конце дихотомически расходятся. Общий узор напоминает рисунок «дерева», у которого ствол и ветви одинаковой толщины, за исключением самих концов ветвей, имеющих заострение (Рис. 30).
Время формирования паттерна во всех сосудах занимает примерно 60 секунд. Форма сосуда на время формирования узора, образованного хламидомонадами, не влияет.
Механическое разрушение узора путем перемешивания всей культуры хламидомонад приводит к новому формированию паттерна заново за то же самое время, как и после помещения жгутиконосцев в сосуд. Механическое разрушение части узора, в данном случае удалялась локальным перемешиванием одна ветвь, приводит к своеобразной регенерации, когда недостающая ветвь заново восстанавливается. Время восстановления занимает тот же промежуток, который требуется для становления целого узора после разрушения. При этом «регенерирующая» часть не нарастает к сохранившейся ветке, а появляется одномоментно. Морфологически восстановившаяся ветвь в общих чертах напоминает предшествующую ей, сохраняются размеры ветвей, их число, но месторасположение ветвей относительно общего паттерна может меняться.
Загрязнители действуют на формирование паттерна в зависимости от примененной концентрации. Сернокислый цинк в концентрации 50 мг/л в горизонтально расположенных пробирках приводит к осаждению хламидомонад. Растворы, содержащие сернокислый цинк в концентрации 10 мг/л, подавляют процесс образования клеточных узоров, хотя хламидомонады не теряют своей подвижности и равномерно распределены в толще воды. При концентрациях сернокислого цинка 1,0 и 0,1 мг/л формируются поперечно-полосатые паттерны, характерные для контрольных проб. Однако концентрация 1,0 мг/л задерживает формирование узора до 180 сек., то есть в три раза по сравнению с контролем. Концентрацию 0.1 мг/лможно считать допустимой по этому показателю, так как она не изменяет ни времени формирования узора, ни его морфологических особенностей.
Все вышеописанные эксперименты проведены с культурами, находящимися на фазе экспоненциального роста. Стабильные, старые культуры, как в чашках Петри, так и в прямоугольных ванночках, образуют мелкоячеистую сеть, либо точковидные скопления хламидомонад, стоящие друг от друга на расстоянии 5-7 мм, расположенные по узлам сеточки. При этом в каждом скоплении клеток видно наиболее плотное ядро, образованное сгруппировавшимися хламидомонадами.
Обсуждение результатов. Фракталы или паттерны, образованныесвободноплавающими хламидомонадами, представляют собойнадорганизменные пространственные структуры, формирование которых идет сходно с морфогенезом многоклеточных организмов, собирающихся из отдельных клеток, таких, как миксомицеты или миксобактерии (Иберт, 1968, Тринкаус, 1972, Фробишер, 1965). Однако у миксомицет и миксобактерии наблюдается еще и дифференцировка - часть клеток дает споры, часть спорангий, а остальные - ножку.
Морфология узора, образованная скоплениями хламидомонад, также претерпевает своего рода «онтогенез» в зависимости от возраста культуры. В молодых культурах это древовидное образование, с возрастом паттерн становится диффузным и даже точечным. На формирование узора, также как и на индивидуальное развитие или регенерацию, ингибирующее действие оказывают токсические вещества, а при высоких концентрациях они вообще подавляют формирование паттерна популяциями хламидомонад. Сходное явление отмечено другими авторами у ряда простейших (Young et all., 2001), а ранее было открыто у тетрахимен Tetragfcythetra pyriformis (Leefuretall, 1952) у эвглен Euglena gracilis (Pobertis, 1985) в последнем случае отмечается зависимость формирования узоров от возраста культуры и температуры.
