Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Морфология и биохимия хрусталика гидробионтов 6
1.1. Морфология хрусталика низших позвоночных животных 6
1.2. Эмбриогенез хрусталика 12
1.3. Некоторые аспекты биохимии хрусталика 14
1.4. Изменения, происходящие в хрусталике при катарактах различной этиологии 22
Глава 2. Материал и методика исследований 40
2.1. Исследования динамики накопления макро и микроэлементов при развитии хрусталика (на примере амфибий) 40
2.2. Исследования микроэлементного состава хрусталика (атомно-абсорбционной спектрометрия) 40
2.3. Исследования пространственного распределения химических элементов хрусталика гидробионтов 41
2.4. Исследование изменений пространственного распределения химических элементов в хрусталике рыб под влиянием токсикантов .42
2.5. Изучение помутнений различной этиологии хрусталика гидробионтов 43
2.6. Статистическая обработка экспериментального материала 44
Глава 3. Динамика накопления макро и микроэлементов при развитии хрусталика (на примере амфибий) 45
Глава 4. Микроэлементарный состав хрусталика некоторых видов рыб и его изменение под влиянием различных факторов (методы атомно-абсорбционнои спектрометрии) 54
4.1. Видовые различия в микроэлементарном составе хрусталика некоторых видов рыб 54
4.2. Различия в микроэлементарном составе хрусталика в зависимости от массы тела 57
4.3. Изменения микроэлементарного состава хрусталика рыб при развитии паразитарной катаракты 59
Глава 5. Пространственное распределение химических элементов в хрусталике гидробионтов и его изменение под влиянием различных факторов (методы рентгеновского спектрального анализа) 62
5.1. Пространственное распределение химических элементов в нормально развивающемся хрусталике гидробионтов 62
5.2. Изменение пространственного распределение химических элементов в хрусталике гидробионтов при катарактах различной этиологии 67
5.3. Изменение пространственного распределение химических элементов в хрусталике рыб под влиянием тяжелых металлов 76
Основные выводы 84
Литература 87
- Изменения, происходящие в хрусталике при катарактах различной этиологии
- Исследования микроэлементного состава хрусталика (атомно-абсорбционной спектрометрия)
- Динамика накопления макро и микроэлементов при развитии хрусталика (на примере амфибий)
- Изменения микроэлементарного состава хрусталика рыб при развитии паразитарной катаракты
Введение к работе
Зрительной системе гидробионтов принадлежит значительная, а у многих видов - ведущая роль в осуществлении важнейших поведенческих реакций. У большинства видов низших позвоночных животных зрение является одним из основных дистантных рецепторов. Оптомоторная реакция - врожденная, зрительно-обусловленная форма поведения отчетливо выражена у многих видов рыб (Павлов, 1979). Уже на самых ранних этапах онтогенеза зрение играет существенную роль в общей ориентации в окружающей среде, являясь доминирующим каналом (Крыжановский, 1959; Дислер, 1960; Бабурина, 1972; Гирса, 1981). Хрусталик гидробионтов играет ведущую роль в формировании изображения на сетчатке глаза. От рефракционных характеристик хрусталика в значительной мере зависит функционирование всей зрительной системы гидробионтов в целом.
При появлении оптических аномалий хрусталика и развитии катаракты, у гидробионтов (в частности у рыб) нарушаются процессы питания, роста организма и увеличивается процент их гибели. Патогенез катаракты у высших и у низших позвоночных имеет однотипный биохимический базис -окислительное повреждение липидов и белков, деструкция мембран хрусталиковых волокон. Но у рыб ввиду их филогенетических особенностей он заметно специфичен (Нефедова, Тойвонен, 1997). Хрусталик лишен кровообращения, и питание его осуществляется за счет диффузии метаболитов из камерной влаги через капсулу, состояние которой оказывает влияние на обменные процессы и предопределяет развитие болезней хрусталика. При этом важную роль в метаболизме хрусталика играют макро- и микроэлементы. С возрастом и при катарактогенезе наблюдается увеличение концентрации ряда микроэлементов в хрусталике (Stanojevic-Paovic et al., 1987; Rasi et al., 1992; Srivastava et al., 1992). В тоже время недостаток некоторых микроэлементов может приводить к экзофтальмии и развитию катаракты (Ketola, 1979; Barash et al., 1982; Richardson et al., 1985; Waagbo et al., 1996;
Козлов и др., 2004). Несмотря на большое разнообразие факторов, приводящих к возникновению катаракты, наиболее существенным является то, что при катаракте всегда происходит уменьшение общего количества белков в хрусталике, прежде всего низкомолекулярных. Эти процессы сопровождаются перестройкой основных ферментных систем и существенными изменениями микроэлементного состава хрусталика. Таким образом, микроэлементный состав хрусталика может служить индикатором "благополучия" хрусталика.
Выявление основных закономерностей изменения макро- и микроэлементного состава хрусталика при катарактогенезе и под воздействием неблагоприятных факторов позволило бы найти решение ряда актуальных рыбохозяйственных проблем, а также некоторых прикладных вопросов водной экологии.
Изменения, происходящие в хрусталике при катарактах различной этиологии
В зависимости от локализации и формы частичных катаракт их подразделяют на сумочные, дентикулярные, кортикальные, ядерные, слоистые, веретенообразные, звездчатые, дисковидные, розеточные, чашевидные и др (Жабоедов и др., 2000). В зависимости от этиологии катаракты подразделяют на несколько отдельных групп. Так, могут быть выделены катаракты, возникающие при общих заболеваниях организма, его органов и систем (общие инфекции, расстройства обмена, эндокринные нарушения); катаракты на почве общих отравлений, механических и химических повреждений хрусталика; катаракты, возникающие в результате повреждения хрусталика какими-либо из видов лучистой энергии; старческие катаракты и осложненные катаракты, вызванные заболеваниями самого глаза (Мучник, 1987).
Врожденные катаракты характеризуются мелкими точечными помутнениями в хрусталике, чаще в оптической (центральной) зоне, что приводит к снижению зрения (Хватова, 1991). Наиболее распространенной среди врожденных помутнений хрусталика является так называемая слоистая-зонулярная катаракта (Мучник, 1987; Азнабаев и др., 2000). Иногда такие изменения возникают на почве тетании. Слоистая катаракта может быть следствием некоторых тяжелых инфекционных или травматических воспалительных процессов в больном глазу. Эта патология включает в себя недоразвитие линзы или ее полное отсутствие, нарушение формы хрусталика (лентиконус), уменьшение линзы в размерах (микрофакия), часто сочетающееся с ее смещением (эктопия) (Пучковская, 1987; Nihalani et al., 2005).
Приобретенные катаракты могут развиваться после общих инфекционных заболеваний на почве истощения, или в результате выраженных расстройств питания, анемии, длительного голодания (Seitzman, 2005). Развивающиеся в таких случаях кахектические катаракты обусловлены, по-видимому, дефицитом необходимых для жизни линзы веществ. Аналогичные причины приводят к возникновению помутнений хрусталика при всякого рода эндокринных расстройствах, при миотонической дистрофии, дерматогенной патологии (Метелицына, 1998; Павлюченко и др., 1999; Абросимова и др., 2000). Помутнение хрусталика при тяжелых общих отравлениях развивается спустя несколько месяцев после того, как проходят их клинические признаки. Катаракты могут возникать также при недостаточности отдельных важных составных частей пищи, особенно провитамина РР, витамина A, D, С, В2 и др.
Различные травмы хрусталика, которые могут приводить не только к разрыву капсулы, но и к поражению волокон хрусталика, вызывают ряд физико-химических изменений, часто ведущих к развитию катаракты (Попов и др., 1962; Попов, Голиченков, 1964; Bjerkas, 1999). При разрывах капсулы происходит гидратация хрусталиковых волокон, что ведет к их дальнейшему помутнению. В первые часы после нанесения травмы в поврежденной части хрусталика уменьшается потребление кислорода. В хрусталике начинают накапливаться недоокисленные продукты промежуточного обмена. Одновременно усиливается анаэробный гликолиз, накапливается в большом количестве молочная кислота (Деев и др., 19996; Жабоедов и др., 2000). Данные процессы сопровождаются изменением микроэлементного состава хрусталика. В хрусталике происходит увеличение концентрации ионов калия, а также концентрации хлоридов. Повышается осмотическое давление, развивается осмотическая гипертония, которая ведет к набуханию хрусталиковых волокон (Шлопак, 1968; Чупров и др., 1997; Ersdal et al., 1999).
Травматизация хрусталика может провоцировать ускоренное развитие катаракт различной этиологии, например лучевых (Попов, 1962; Попов и др., 1964). При денервации глаза вероятность возникновения катаракты при травмировании переднего полюса хрусталика возрастает (Попов и др., 1962). Скорость регенерации травмы хрусталика в существенной мере зависит от степени митотической активности поврежденного участка эпителия (Чупров и др., 1997; Симаков и др., 1991).
Величина митотического индекса от центральной зоны эпителия к герминативной может увеличиваться в несколько раз. У некоторых рыб и амфибий в силу сезонных изменений митотической активности процессы регенерации хрусталика различным образом протекают в летнее и зимнее время (Сахарова, Голиченков, 1968). Регенерация в летнее время идет за счет активизации клеточной пролиферации в области травмы. В зимнее время митотическая активность в эпителии хрусталика снижена или вообще отсутствует.
Регенерация травмы переднего полюса хрусталика завершается в течение нескольких дней за счет миграции клеток эпителия в область разрыва капсулы и синтеза нового участка капсулы эпителиальными клетками (Ковалев, 1966; Симаков и др., 1991; Bjerkas, 1999). После завершения регенерации капсулы хрусталика вероятность возникновения катаракты резко падает (Симаков, 1974).
Травмирование переднего полюса хрусталика лягушек (Rana temporaria, Rana ridibunda) и рыб (Parasalmo mykiss, Perca fluviatilis, Cyprinus carpio) в ряде случаев приводит к появлению помутнений в непосредственной близости от заднего шва хрусталика (Симаков и др., 1969в; McDevitt et al., 1997). Одной из причин возникновения катаракт являются повреждения хрусталика различными видами излучения: ультрафиолетового, инфракрасного, лазерного, рентгеновского и пр. Хрусталик является особо чувствительным к воздействиям лучистой энергии, проходящей через прозрачную роговицу и поглощаемой веществом линзы. Латентный период развития лучевой катаракты варьирует в зависимости от дозировки излучения и чувствительности организма в широких пределах - от нескольких месяцев до нескольких лет (Киселева и др., 1996; Сергиенко, Рубан, 2000; Панченко, Дурас, 2000; Maarouf et al., 2005).
К ионизирующим излучениям в радиобиологии традиционно причисляют рентгеновское излучение, у-излучение, синхротронное и ондуляторное излучение, а также нейтронные пучки различных энергий, высокоэнергетические электронные пучки, называемые Р-лучами. Все эти разнотипные по своей природе излучения обладают ярко выраженным катарактогенным воздействием на подопытных особей (Бигел, 1959; Краузе, Бонд, 1959; Эптон и др., 1959; Шубик, Квасова, 1996; Черняева и др., 1999; Dovrat et al., 2005).
Исследования микроэлементного состава хрусталика (атомно-абсорбционной спектрометрия)
Исследования микроэлементного (интегрального) состава хрусталика карпа (Cyprinus carpio), белого толстолобика (Hypophthalmichthys molitrix) и радужной форели (Parasalmo mykiss) проводились методом атомно-абсорбционной спектрометрии на спектрометрах Spectr фирмы «Varian». Энуклеированные хрусталики после предварительного взвешивания подвергались минерализации. Для этого в течении 30-40 мин. образцы экспонировались в смеси азотной кислоты и пероксида 6:1, и затем подвергались термообработке, в процессе которой в течение 3-х часов температура повышалась со 160 до 2000 С. После проведения пробоподготовки дальнейший анализ тяжелых металлов, таких как Cr, Ni, Си, Zn, Cd и Pb проводился на атомно-абсорбционном спектрометре SpectrAA 220 FS. Анализ содержания мышьяка проводился на атомно-абсорбционном спектрометре с графитовой печью SpectrAA 220Z GTA-110. Исследования зависимости содержания тяжелых металлов в хрусталике от массы тела рыбы проводились на карпах, масса которых варьировала от 1 до 2-х кг.
Исследование изменения содержания тяжелых металлов в хрусталике в процессе развития катаракты, было проведено на толстолобиках средней массой 1,6 кг. В опыт было взято 96 особей, из которых: 42 особи - имели прозрачный хрусталик; у 35 особей - была отмечена начальная стадия развития паразитарной катаракты, вызванной внедрением метацеркарий диплостом; у 19 особей метацеркарий внедрились вплоть до ядра хрусталика, что способствовало появлению катарактальных изменений в слое, разделяющем ядро и кору хрусталика.
Исследования пространственного распределения химических элементов в хрусталике карпа (Cyprinus carpio), белого толстолобика (Hypophthalmichthys molitrix), сеголеток радужной форели (Parasalmo mykiss) и травяной лягушки (Rana temporaria) проводились методом рентгеновского спектрального микроанализа на основе анализа спектра характеристического рентгеновского излучения с использованием рентгеновского микроанализатора EDAX UTW, установленного на растровом сканирующем электронном микроскопе Philips XL-30 (Гоулдстейн и др., 1984; Бородин и др., 2005).
Энуклеированные хрусталики рыб подсушивались на открытом воздухе в течение двух часов, замораживались жидким азотом и раскалывались на две половины. Энергия пучка электронов (энергия инициализации) составляла 30 кЭв. Пространственная разрешающая способность составляла 7 мкм, спектральная разрешающая способность - 130,17 эВ, наклон оси детектора -37,83.
Исследования изменений пространственного распределения химических элементов в хрусталике карпа (Cyprinus carpio) и радужной форели (Parasalmo mykiss) под влиянием тяжелых металлов проводились по плану полного факторного эксперимента З4 (четыре фактора на трех уровнях). Рыб содержали в 100-литровых емкостях (с аэрацией) в течение 30 дней, смену воды производили один раз в неделю.
В качестве действующих факторов были взяты 4 металла: медь, цинк, кадмий и свинец. Функцией отклика являлось изменение содержания 7-ми химических элементов в различных зонах хрусталика. Использованные концентрации металлов для различных уровней факторов приведены ниже «таблица 1». Определение элементного состава хрусталика проводилось на основе анализа спектра характеристического рентгеновского излучения. Контроль за накоплением тяжелых металлов в хрусталиках рыб проводили методом рентгеновского спектрального микроанализа с использованием анализатора EDAX UTW, установленного на растровом электронном микроскопе Philips XL-30.
Исследования изменений оптических свойств хрусталика под воздействием лазерного излучения проводились на травяной лягушке (Rana temporaria). Использовался импульсный неодимовый лазер (на основе алюмо-иттриевоего граната, легированного неодимом - YAG:Nd) с длиной волны 1064 нм и 532 нм (вторая гармоника). Средняя мощность излучения составляла 18 Вт, частота повторения импульсов - 5 кГц, длительность импульса — 3-Ю-сек. В разных вариантах опыта общая энергия экспозиции составляла соответственно 0,04, 0,12 и 0,18 Дж.
Прижизненное изучение состояния хрусталика животных, подвергшихся воздействию лазерного излучения, проводилось при помощи щелевой лампы ЩЛ-56 через 30 минут, через 2 часа, на 2-й день и далее ежедневно в течение 30 дней после облучения.
Статистическая обработка экспериментального материала осуществлялась с использованием MS Excel (вычисление первичных статистик) (Кремер, 2003), пакета STATISTICA 5.5 (регрессионный анализ, корреляционный анализ). Многофакторный дисперсионный анализ проводился на основе самостоятельно разработанной программы (Бородин, Никифоров-Никишин, 2004).
Динамика накопления макро и микроэлементов при развитии хрусталика (на примере амфибий)
Для изучения распределения макро- и микроэлементов в процессе морфогенеза хрусталика Rana temporana L. нами была исследована динамика распределения следующих металлов: Са, Mg, Fe, Си, Pb, Be, Au. Если роль кальция, магния, железа и меди в какой-то мере изучена при исследовании сформировавшихся хрусталиков, то о роли свинца, бериллия, золота сведения отрывочны и противоречивы.
Бериллий в плакоде хрусталика и глазной чаше исследованных эмбрионов, находящихся на 24 - 30-й стадиях развития, распределен равномерно в следовых количествах. Только к 32-й стадии его содержание в хрусталике становится несколько большим, чем в глазной чаше. После этого до конца метаморфоза изменений в содержании бериллия в хрусталике не обнаружено, лишь в формирующейся радужной оболочке и недифференцированной части сетчатки, концентрация бериллия немного повышается.
Золото на ранних стадиях развития содержится почти во всех закладках, особенно в эктодермальной части зародыша. Оно выявляется и на более поздних стадиях развития в формирующейся нервной системе в слое эпендимы. Эмбриональная кожа содержит следы золота. После 28-й стадии, по мере отшнуровывания хрусталика, золото полностью мигрирует из него, по-видимому, в будущую радужную оболочку и к 30-й стадии развития остается только по краям глазной чаши. С 44-й стадии развития в сетчатке золото не выявляется, оно остается только в пигментном эпителии, в котором сохраняется в течение дальнейшей жизни животного.
Железо. Свободное железо в хрусталике выявляется с ранних стадий развития. С 30 по 48-ю стадию оно в большом количестве находится в ядре хрусталика, затем появляется также в верхних слоях коры, сохраняясь в них у взрослого животного. Количество гемосидерина увеличивается по мере роста хрусталика; гемосидерин равномерно распределен по всем частям глаза, как на ранних, так и на поздних стадиях развития. Микрофотометрическим способом не удается обнаружить изменений относительного содержания гемосидерина в процессе развития глаза.
Магний равномерно распределен по зачаткам глаза и по эктодерме зародыша, находящегося на 24-й стадии развития. С 44 до 48-й стадии содержание магния в хрусталике, как показывает микрофотометрия, возрастает примерно вдвое. После этого содержание магния в хрусталике до конца метаморфоза не меняется. По мере увеличения количества магния в хрусталике увеличивается его содержание и в недифференцированной части радужки; при этом реакция на выявление магния хрусталика и края радужки почти одинакова.
Свинец в эмбриональных тканях отмечен во всех закладках органов на 24-й стадии развития зародыша. С 40 по 52-ю стадию развития идет накопление свинца в хрусталике, затем его содержание остается постоянным. Много свинца обнаруживается в формирующихся частях радужной оболочки и в сетчатке. Однако содержание свинца в хрусталике выше, чем в других частях глаза. С 40 по 48-ю стадию развития оно возрастает примерно в 10 раз.
Кальций. На начальных стадиях развития кальций, как и большинство металлов в зародыше, распределен равномерно. С 28-й стадии после отделения хрусталика от кожи количество кальция в нем убывает. В это время он хорошо выявляется в глазной чаше. На 34-й стадии развития кальций начинает поступать из края глазной чаши в экваториальную зону развивающегося хрусталика. На 44-й стадии кора хрусталика заполняется кальцием, а с 48-й стадии его количество остается постоянным. На поздних стадиях развития содержание кальция в дифференцированной сетчатке убывает, а ее недифференцированная часть содержит кальция почти столько же, сколько и хрусталик.
Распределение кальция на 24-й стадии развития, в только что начавшей образовываться плакоде, такое же, как и в остальных частях развивающегося глаза. На 26-й стадии содержание кальция не меняется; по мере отшнуровывания хрусталика оно убывает. На 28-й стадии, когда хрусталик почти отделился от кожи, содержание кальция в нем близко к содержанию в эпидермисе, что, по-видимому, указывает на происхождение коры хрусталика из верхнего края глазной чаши (рисунок 3.1).
В клетках глазной чаши содержание кальция остается таким же, что и на 24-й стадии. На 30-й стадии, когда закладка хрусталика полностью отделилась от кожи, кальция в хрусталике не больше, чем на 28-й стадии, а в клетках глазной чаши кальций начинает накапливаться в месте формирования будущей радужной оболочки (рисунок 3.2, рисунок 3.3).
На 32-й стадии в развивающемся глазу Rana temporaria начинается миграция кальция из глазной чаши в экваториальную зону хрусталика, в котором к этому времени начинается дифференцировка волокон и переднего эпителия. Все первичные волокна не содержат кальция, он поступает только в эпителиальный слой; на этой стадии концентрация кальция выше в месте образования радужной оболочки.
В это время край глазной чаши почти соприкасается с экватором хрусталика, и расстояние, по которому осуществляется миграция кальция минимально (рисунок 3.4). На 34-й стадии развития в сетчатке начинается дифференцировка нервных элементов и фоторецепторов, и количество кальция в ней убывает; кальций мигрирует к краям глазной чаши. В экваториальной зоне хрусталика содержание кальция увеличивается, но кальций не остается там, а начинает равномерно распределяться по коре хрусталика (рисунок 3.5, рисунок 3.6).
Изменения микроэлементарного состава хрусталика рыб при развитии паразитарной катаракты
Исследование изменения содержания тяжелых металлов в хрусталике в процессе развития катаракты было проведено на толстолобиках массой 1,6 кг. Изменение содержания микроэлементов в хрусталике толстолобиков на различных стадиях развития катаракты изучалось методом адсорбционной спектроскопии. Результаты проведенного дисперсионного анализа показали, что в процессе развития катаракты наблюдаются значимые изменения в содержании Cr, Zn, As, Cd и Pb, в то время как значимых на уровне а = 0,05 изменений в содержании Ni и Си не отмечается (таблица 6). Таблица 6 - Результаты дисперсионного анализа изменения содержания тяжелых металлов в хрусталике толстолобика в процессе развития катаракты По данным проведенного корреляционного анализа в процессе развития катаракты содержание Сг и Pb в хрусталике значимо увеличивается. В тоже время наблюдается значимое уменьшение содержания Zn, As (таблица 7, рисунок 4.5). Существует ряд закономерностей в изменениях содержания элементов в процессе развития катаракты. Между изменениями уровней цинка и мышьяка, а также никеля и кадмия существует значимая положительная корреляция. Аналогичным образом коррелируют уровни меди и цинка, меди и хрома. В тоже время, между изменениями уровней хрома и никеля, хрома и кадмия, свинца и цинка, а также свинца и мышьяка выявлена значимая обратная корреляция (таблица 8)
Таким образом, нами впервые показано, что уже на ранних стадиях развития паразитарной катаракты микроэлементный состав хрусталика белого толстолобика претерпевает значительные изменения. Выявленные закономерности изменения микроэлементного состава хрусталика могут лечь в основу прогностических тестов, позволяющих диагностировать начальные стадии развития паразитарной катаракты, вызванной метацеркариями диплостом у рыб. В подавляющем большинстве работ, посвященных исследованиям элементного состава хрусталика, объектами исследования являются хрусталики наземных животных и человека (Galin et al., 1975; Rosenthal, Eckhert, 1980; Wen et al, 1982; Eckhert, 1983; Koumantakis et al, 1983; Bentley, Grubb, 1991; Paterson et al., 1998; Fabe et al., 2000). Элементный состав определяется чаще всего атомно-адсорбционными методами и, как правило, измеряется общее содержание элементов, оставляя открытым вопрос о пространственном распределении химических элементов в хрусталике. Анализ спектров характеристического рентгеновского излучения химических элементов проводился в узлах ортогональной решетки с шагом 1/256 радиуса хрусталика (Бородин и др., 2005). Дисперсионный анализ полученных данных (в качестве действующего фактора на 128 уровнях рассматривается расстояние от центра хрусталика) позволяет сделать вывод о том, что для всех изученных видов гидробионтов существуют значимые (на уровне а = 0,001) различия в пространственном распределении химических элементов (таблица 9). Исключение составляет пространственное распределение кислорода в хрусталике исследованных видов, где различия значимы на уровне а = 0,05. Распределение кислорода в хрусталике исследованных видов в целом подвержено наименьшим вариациям в сравнении с другими химическими элементами (таблица 9, рисунок 5.1 - 5.2). В тоже время пространственное распределение магния, меди и цинка подвержено наибольшим изменениям в хрусталике. Общим для этих элементов во всех исследованных случаях является их наличие в верхних слоях коры при практически полном их отсутствии (в пределах чувствительности метода) в более глубоких слоях хрусталика. Содержание натрия в хрусталике радужной форели уменьшается к центру. Содержание калия в хрусталике всех исследованных видов существенно (в несколько раз) уменьшается. При этом соотношение Na / К к центру хрусталика растет.
