Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Хрусталик гидробионтов как тест-объект в водной токсикологии .9
1.1. Морфология хрусталика низших позвоночных животных 9
1.2. Морфогенез хрусталика во время эмбрионального развития 10
1.3. Цитология и биология митозов 11
1.4. Биохимия хрусталика позвоночных животных 14
1.5. Классификация и характеристика сточных вод и их компонентов 22
1.6. Симптомы отравления рыб 25
1.7. Обратимость процессов интоксикации, адаптация к токсикантам, кумуляция 27
1.8. Влияние экологических факторов водной среды на токсикорезистентность 29
1.9. Влияние видовых, возрастных и индивидуальных особенностей, сезонных и некоторых других факторов на токсикорезистентность 32
1.10. Методы комплексных исследований отравлений и токсичности водной среды 35
1.11. Методы оценки качества вод при наличии разнородных загрязнителей 37
1.12. Влияние загрязнений на морфологию рыб 41
1.13. Недостатки принятой системы установления ПДК токсических веществ в водной среде 43
1.14. Воздействие тяжелых металлов на гидробионтов 47
Глава 2. Объекты и методы исследований 65
2.1. Приготовление плоскостных препаратов эпителия хрусталика.. 67
2.2. Схема подсчета митотического индекса 68
2.3. Гистологические и гистохимические методы исследования хрусталика гидробионтов и амфибий 70
2.4. Электронно-микроскопическое исследование хрусталиков гидробионтов 70
2.5. Изучение влияние травмы на митотическую активность эпителия хрусталика рыб 71
2.6. Методы исследования совместного действия травмы и токсикантов на митотическую активность эпителия хрусталика рыб 72
2.7. Биомикроскопия хрусталика карпа при наличии метацеркарий диплостом 73
2.8. Методы исследования влияния растворимых фракций хрусталика рыб на митотическую активность в эпителии хрусталика рыб и амфибий 73
2.9. Экспериментальная пересадка хрусталика рыб амфибиям 74
2.10. Оценка чувствительности митотическои активности эпителия хрусталика рыб 75
2.10.1. Краткая характеристика исследованных веществ и соединений 77
2.10.2. Подбор гидробионтов для проведения экспериментов по сравнительной оценке чувствительности биологических показателей к действию токсикантов 84
2.11. Изучения влияния тяжелых металлов на цитогенетические характеристики клеток эпителия хрусталика рыб 87
2.12. Изучение элементного состава хрусталика 90
2.13. Статистическая обработка экспериментального материала 91
Глава 3. Морфология хрусталика гидробионтов 92
3.1. Морфология хрусталика рыб и брюхоногих моллюсков 93
3.2. Морфологические изменения в хрусталике рыб при паразитарных катарактах 102
Глава 4. Изменение митотическои активности эпителия хрусталика под влиянием различных факторов 106
4.1. Изменение митотическои активности в различных зонах цитодифференцировки эпителия хрусталика рыб при травматизации 106
4.2. Пространственное распределение митозов при травматизации эпителия хрусталика 111
4.3. Совместное действие травмы и токсикантов на цитодифферинцировку хрусталика рыб 117
4.4. Влияние теплового загрязнения на митотическую активность
в эпителии хрусталика рыб и амфибий в зимний период 121
4.5. Влияние растворимых фракций хрусталика рыб на митотическую активность в эпителии хрусталика рыб и амфибий 124
4.6. Экспериментальная пересадка хрусталика рыб амфибиям: влияние на клеточную пролиферацию 129
Глава 5. Сравнительный анализ чувствительности показателя митотическои активности эпителия хрусталика рыб с чувствительностью существующих методов оценки токсичности веществ 131
Глава 6. Влияние тяжелых металлов на цитогенетические характеристики клеток эпителия хрусталика рыб 181
6.1. Влияние тяжелых металлов на эпителий хрусталика рыб 181
6.2. Изменение элементного состава хрусталика под влиянием тяжелых металлов 196
Заключение 211
Основные выводы 215
Литература 218
- Морфогенез хрусталика во время эмбрионального развития
- Схема подсчета митотического индекса
- Экспериментальная пересадка хрусталика рыб амфибиям
- Морфологические изменения в хрусталике рыб при паразитарных катарактах
Введение к работе
Усиливающееся антропогенное воздействие на природные и искусственные водоемы в значительной степени нарушает естественные гидробиоценозы. Анализируя процессы антропогенного влияния на биосферу Земли, академик Н.Н. Моисеев приходит к выводу: "Если человек не найдет нужного ключа к своим взаимоотношениям с природой, то он обречен на погибель, каким бы ни были политика и государственное устройство...", поскольку "...человечество обрело возможность мирного самоуничтожения". "Человек подошел к пределу, который нельзя переступить ни при каких обстоятельствах. Дело в том, что антропогенная нагрузка на биосферу стремительно возрастает и она близка к критической. Биота может потерять стабильность. В новом состоянии биосферы человеку может не найтись места" (Моисеев, 1999).
Функционирование природных биологических систем с каждым днем все больше и больше зависит от деятельности человека. В последнее время все труднее найти реки или водоемы, естественный режим которых так или иначе не изменился. "Даже в том случае если промышленные предприятия будут свято выполнять все меры охраны среды, развивающееся общество будет оказывать на природу прогрессирующее воздействие" (Шварц, 1973).
Контроль загрязнения рек регулярно проводиться подразделениями Природоохранных органов, службами санитарного надзора, управлениями Главрыбвода. Данный контроль позволяет систематически оценивать содержание в воде не более 45-50 основных токсикантов и сравнивать полученные данные с соответствующими показателями ГТДК, но этой работы не всегда достаточно для оценки комплексного, суммарного воздействия токсикантов на гидробионтов. По данным института системного анализа Российской Академии Наук многие нетоксичные или малотоксичные компоненты, попадающие в реки со сточными водами, вступая во взаимодействие между собой, образуют столь высокотоксичные соединения, что негативное влияние на природу возрастает многократно, а сами токсиканты остаются вне контроля,
Современное загрязнение природной среды не есть лишь простое следствие плохо контролируемых выбросов антропогенных загрязнителей. Оно также обусловлено всей совокупностью перестроек природы, производимых человеческим обществом. Именно поэтому в гидробиологических исследованиях нельзя ограничиваться только биоиндикацией загрязнения, а необходимо всестороннее изучение антропогенного воздействия на водные экосистемы в целом (Захаров, Кларк, 1993).
Для оценки антропогенного воздействия вредных веществ на гидробионтов необходимо найти тест-объект, с помощью которого можно было бы интегрально оценивать изменение жизненных функций под влиянием ксенобиотиков. Вполне понятно, что найти универсальный интегральный тест-объект невозможно. Однако можно приблизиться к этому, если адекватно подобрать тест-объект и метод оценки токсического воздействия загрязнителей водной среды.
Общеизвестно, что рост гидробионтов нарушается при действии токсических веществ, но для проведения подобных экспериментов требуется продолжительное время и значительное число подопытных организмов, чтобы провести биометрические измерения. Рост гидробионтов непосредственно связан с митотической активностью в тканях организма. Поэтому мы предлагаем оценивать токсическое воздействие загрязнителей на гидробионтов по митотической активности. Это даст возможность также выявить цитотоксическое действие загрязнителей водной среды.
По нашему мнению всем перечисленным выше условиям отвечает хрусталик глаза рыб и амфибий, так как на его монослойном эпителии можно определять митотическую активность, а по нарушению прозрачности под влиянием токсикантов судить о перестройках биологических структур на молекулярном уровне.
7 Предлагаемый в качестве интегрального тест-объекта хрусталик низших позвоночных для оценки токсичности веществ антропогенного происхождения, может быть использован в том случае, если его биологические показатели окажутся сопоставимы по чувствительности с общепринятыми тест-объектами, используемыми в водной токсикологии. В силу этого необходимо провести сравнительный анализ чувствительности биологических показателей хрусталика и классических тест-объектов, используемых для оценки токсичности вредных веществ, попадающих в рыбохозяйственные водоемы.
Цель и задачи исследований: Выявить наиболее чувствительные к действию токсикантов морфологические и цитологические показатели хрусталика у ряда гидробионтов и дать сравнительную характеристику чувствительности биологических показателей хрусталика и классических тест-объектов, используемых в водной токсикологии.
В соответствии с намеченной целью были поставлены следующие основные задачи;
Провести сравнительные гистологические и цитогенетические исследования хрусталика моллюсков, рыб и амфибий, содержащихся в лабораторных условиях, и выявить наиболее перспективный тест-объект для токсикологических исследований.
Исследовать воздействие травмы и токсикантов на митотическую активность эпителия хрусталика рыб.
Вскрыть закономерности пространственного распределения митозов в эпителии хрусталика рыб при травматизации.
Провести исследования широкого спектра токсикантов различной степени токсичности и механизма токсического воздействия на митотическую активность хрусталика радужной форели.
Исследовать комплексное воздействие тяжелых металлов на митотическую активность хрусталика радужной форели.
Провести сравнительный анализ воздействия ряда загрязнителей рыбохозяйственных водоемов на классические тест-объекты, применяемые в водной токсикологии (коловратки, дафнии, моллюски, рыбы) и на цитогенетические показатели хрусталика рыб.
Дать сравнительную характеристику чувствительности к токсикантам ряда биологических показателей классических тест-объектов и цитогенетических показателей эпителия хрусталика рыб.
Морфогенез хрусталика во время эмбрионального развития
На ранних стадиях эмбрионального развития из первичного мозга вырастают глазные пузыри (vesicula ophthalmica), каждый из которых затем трансформируются в двухслойную глазную чашу (Агеу, 1974; Ромер, Парсонс, 1992). Формирование хрусталика индуцируется приближением глазной чаши к эпидермису эмбриона (Аникин, 1961; Bose, Medda, 1965; Chang et al., 2002). На начальной стадии формирования хрусталика эмбриональный эпителий, образующий хрусталик, инвагинирует в первичный зрительный пузырек у высших млекопитающих, либо дает плакоду у низших позвоночных. Позже капсула хрусталика окружает всю его поверхность, и с этого момента хрусталик развивается как изолированный орган внутри глаза.
Первичные волокна хрусталика образуются из эпителиальных клеток на задней поверхности пузырька хрусталика. Дальнейший рост хрусталиковых волокон продолжается за счет эпителия передней поверхности хрусталика (Гирберт, 1993). Деление клеток эпителия происходит с замедляющейся скоростью в течение всей жизни в узкой полосе перед экватором хрусталика. В экваториальной области клетки эпителия дифференцируются, образуя хрусталиковые волокна (Balinsky, 1970; Дашевский, 1956; Knerr et al., 2002).
В молодом хрусталике преобладают молодые клетки, но даже во взрослом и старом хрусталике на периферии еще имеются молодые волокна. В центре хрусталика расположены волокна, в большинстве своем потерявшие клеточные ядра (Робертис и др., 1967; Макеева, 1992). Отличительной особенностью хрусталика является то, что по мере роста его старые клетки не отторгаются. Превращаясь в волокна, они становятся более компактными и за счет появления новых волокон на периферии уплотняются в центре хрусталика, образуя ядро хрусталика (Кауфман, 1990). Эти процессы, происходящие на протяжении всей жизни в пределах капсулы хрусталика, ведут к постепенному затвердению ядра хрусталика, который у старых особей может быть настолько твердым, что его трудно разрезать скальпелем (Архангельский, 1957; Vazquez et al., 2002). При этом, кортикальные слои хрусталика остаются мягкими на протяжении всей жизни (Bloemendal, 1977). Характер обмена веществ хрусталика мало изменяется на всех стадиях его развития.
Митоз представляет собой способ закономерного деления клетки, при котором каждая из двух дочерних клеток получает в точности такое же число и те же типы хромосом, какие имела материнская клетка (Робертис и др., 1967; Younan et al., 2002). Митотическое деление представляет собой непрерывный процесс, каждая стадия которого незаметно переходит в следующую за ней. Для удобства описания этих сложных процессов, как правило, выделяют 4 стадии: профазу, метафазу, анафазу и телофазу. Между двумя митозами клетка находится в состоянии покоя (Paraconstantinou, 1967; Weintraub et al., 2002).
В профазе хроматиновые нити начинают конденсироваться и образовывать хромосомы, видимые в световой микроскоп. Вначале хромосома максимально растянута и в ней ясно видны отдельные хромомеры. Позже хромосомы сокращаются, хромомеры сближаются настолько, что отдельные хромомеры становятся неразличимы. Каждая хромосома предварительно редуплицируется (Harding, Thayer, 1964; Dykens et al., 2002). Центриоль, находящаяся в цитоплазме клетки, в начале профазы делится, и дочерние центриоли отходят в противоположные концы клетки. Между центриолями образуется так называемое митотическое веретено. Нити веретена протягиваются от экватора к полюсам. В то время как центриоли разъединяются и формируют веретено, хромосомы в ядре сокращаются, становятся короче и значительно утолщаются (Робертис и др., 1967; Han et al., 2002). Когда сокращение хромосом достигает максимальной степени, они превращаются в короткие, сильно окрашивающиеся палочкообразные тельца. Ядерная оболочка растворяется, и хромосомы выстраиваются в плоскости экватора. К этому моменту профаза заканчивается, и короткий промежуток времени, в течение которого хромосомы находятся в плоскости экватора, представляет собой метафазу (Davis et al., 2002).
Выстроившись вдоль экватора, хромосомы тотчас же начинают расходиться, причем каждый член разъединяющейся пары отходит к одному из полюсов. Фазу деления с момента начала расхождения хромосом и до достижения ими полюсов, называют периодом анафазы.
Когда хромосомы достигают полюсов, начинается телофаза. Хромосомы удлиняются, теряют способность сильно окрашиваться и возвращаются в покоящееся состояние, в котором видны лишь хроматиновые нити, а вокруг каждого дочернего ядра образуется ядерная оболочка. На этом завершается деление ядра, называемое кариокинезом, затем следует деление тела клетки, или цитокинез (Малаян, 1969; Baldo et al., 2001).
Факторы, побуждающие клетку к митозу, очень многоплановы. По-видимому, важную роль здесь играет соотношение объемов ядра и цитоплазмы (т.н. ядерно-плазменное отношение).
Большинство токсикантов оказывают заметное влияние на регуляцию клеточной пролиферации у гидробионтов, в частности у рыб (Дре, 1976; Симаков, 1987; Chiang et al., 2001). Нарушение митотической активности под воздействием некоторых веществ можно считать одним из наиболее показательных параметров для выявления цитостатиков (Deysson, 1968; Fischer-Lougheed et al., 2001). Показано, что под воздействием ряда токсических веществ может нарушаться митотическая активность в эпителии хрусталика рыб (Симаков и др., 1991). При этом в зависимости от действующей концентрации и природы химического соединения митотический индекс в эпителии хрусталика радужной форели (Parasalmo mykiss) может существенно меняться (Симаков, 1982).
Выделенные из хрусталиков с помощью гель-фильтрации фракции 0-кристаллинов снижают митотический индекс в культуре эпителиальных клеток хрусталика на 58% (Балаж, Балажек, 1982; Graw et al., 2001). Эксперименты с прединкубацией показали, что помимо (З-кристаллина в препарате присутствует еще некий фактор, который снижает митотическую активность примерно на 55%. Этот фактор оказался чувствителен к этилмалепмиду - реактиву, блокирующему SH- группы (Балаж, Балажек, 1982).
Длительное воздействие малых концентраций токсических веществ на клеточные деления и цитодифференцировку у гидробионтов в ряде случаев значительно отличается по характеру от действия больших концентраций данных веществ.
При действии высоких концентраций токсиканта митотическая активность в некоторых случаях может быть полностью подавлена (Данильченко, 1977; Shiels et al, 2001). При действии малых доз организм активирует репаративные системы, которые позволяют в физиологическом плане поддерживать организм в относительно удовлетворительном состоянии (Braverman et al,, 1969; Yin et al., 2001). Изучение митотической активности эпителия хрусталика рыб может послужить основой для оценки токсичности различных веществ и соединений (Новикова, 1993).
Схема подсчета митотического индекса
В наших исследованиях подсчет митотического индекса на тотальных плоскостных препаратах эпителия хрусталика осуществлялся как по всему эпителию в целом, так и в отдельных зонах цитодифференцировки эпителия хрусталика (центральной, герминативной и предэкваториальной зонах). Для этой цели использовалась окулярная сеточка и препаратоводитель микроскопа.
Подсчет митотического индекса проводился в полосе, равной ширине окулярной сеточки, от центра препарата до периферии. Для тотального подсчета митозов обсчитывалось 20 случайным образом выбранных участков в разных частях эпителия хрусталика. Схема подсчетов митотического
При подсчете митотического индекса в отдельных зонах цитодифференцировки эпителия для каждой из зон обсчитывалось по 6 случайным образом выбранных участков. Затем полученные данные подвергались статистической обработке (Лакин, 1980).
В исследованиях по изучению изменения митотической активности в различных зонах цитодифференцировки эпителия хрусталика рыб при травматизации вычислялись площади травмы и площади участков эпителия хрусталика, ограниченных полосой посттравматических митозов.
Подсчет хромосомных аберраций проводился на стадиях ана-телофазы в клетках эпителия как для всего хрусталика, так и для отдельных зон цитодифференцировки эпителия: центральной, герминативной и предэкваториальной. Высокая митотическая активность у сеголеток радужной форели, а также локализация митозов главным образом в герминативной и предэкваториальной зонах позволяет более полно выявить хромосомные
Для гистологических исследований фиксация глаз моллюсков, рыб и амфибий осуществлялась в смеси Карнуа (этанол и уксусная кислота в соотношение 3/1), затем хрусталики заливались в парафин и резались на микротоме (Лилли, 1969). Особенностью приготовления срезов хрусталиков рыб, как и других позвоночных, является наличие очень плотного ядра, которое выпадает при получении срезов. Для предотвращения этого используется несколько способов, либо нанесение слоя парафинов на каждый срез, либо смачивание кисточкой с водой (Ромейс, 1954).
Для морфологического исследования хрусталиков рыб использовалась окраска гематоксилин эозином, а хрусталики брюхоногих моллюсков, после получения полутонких срезов, окрашивались толуидиновым синим (Саркисов и др., 1996; Симаков и др., 2003 б).
При приготовлении препаратов для электронно-микроскопических исследований хрусталики рыб фиксировались раствором глутарового альдегида, который характеризуется быстрым проникновением в ткани и ровной стабилизацией мембран в клетках (Втюрин, Пальцын, 1985). Продолжительность фиксации составляла 4 часа при комнатной температуре. Затем препарат проводился через спирты. Для заливки материала использовались полиакриламидные смолы (Симаков, Никифоров-Никишин, 2001). Исследование полученных препаратов проводили с помощью сканирующего электронного микроскопа Philips XL-30. Препараты
Исследования влияния травмирования эпителия на митотическую активность эпителия хрусталика проводились на сеголетках радужной форели массой 12 гр и длиной 9,5 см и сеголетках окуня. Рыб содержали в аквариумах объемом 100 л с непрерывной аэрацией. В аквариумах производили смену воды через день. Сеголеток кормили мелким мотылем. Травмы наносились иглами диаметром 0,2 - 0,8 мм под контролем микроскопа МБС-10 (Симаков и др., 1991). Для предупреждения обсыхания и повреждений покровов тела, рыб перед процедурой нанесения травмы заворачивали в мокрую вату. Травма наносилась во всех случаях в правый глаз рыб (Никифоров-Никишин, Бородин, 2004 а). Через 48 ч после нанесения травмы из эпителия хрусталика опытных рыб готовились тотальные препараты.
На тотальных плоскостных препаратах эпителия хрусталика осуществлялся подсчет митотического индекса как по всему эпителию в целом, так и в отдельных зонах цитодифференцировки эпителия хрусталика (центральной, герминативной и предэкваториальной зонах), определялась площадь травмы и площадь участков эпителия хрусталика, ограниченных полосой посттравматических митозов.
Также вычислялся периметр травмы как произведение числа клеток,ограничивающих травму на их средний диаметр. Для множественной травмы определялось минимальное расстояние между отдельными неперекрывающимися участками.
Исследование проводилось на сеголетках радужной форели массой 12 г и длиной 9,5 см. Рыб по 10 экз. помещали в аквариумы объемом 60 л, с непрерывно аэрируемой водой, смену воды производили через день. Сеголеток кормили мотылем. Длительность опыта составила 30 дней (Никифоров-Никишин, Бородин, 1997; Симаков и др., 2003 а).
Изучалось влияние на митотическую активность эпителия хрусталика трех веществ: дибутилсебацината ДБС, политерпенов (ПТП) и аминопропилтриэтоксисилана АГМ-9. Для ДБС и ПТП были взяты концентрации 10,0; 1,0; 0,1; 0,01; 0,001 мг/л, а для менее токсичного АГМ-9 -10,0; 1,0; 0,1; 0,01 мг/л. Указанные концентрации были выбраны ниже границы, определяемой органолептическими исследованиями по образованию пленки на поверхности воды и запаху.
За два дня до окончания опыта сеголеткам радужной форели в правый глаз наносили укол под контролем микроскопа МБС-10 с учетом, чтобы игла проникала в передний полюс хрусталика на глубину не более 1/5 его диаметра. Время травматизации выбрано таким образом, чтобы к моменту фиксации в герминативной зоне эпителия был наиболее высокий МИ от воздействия травмы, Рыбы, находящиеся в контрольном аквариуме с чистой водой, также получали укол в передний полюс правого глаза. Левый глаз всегда служил в качестве контроля (Никифоров-Никишин, Бородин, 1997).
На 30 день опыта сеголеток форели забивали. Оба глаза фиксировали в смеси абсолютного этанола ледяной уксусной кислоты в соотношении 3:1 (Лилли, 1969). На дно сосуда помещали обезвоженный медный купорос для отнятия водянистой влаги. С хрусталиков снимали эпителий и готовили тотальные препараты, залитые в канадский бальзам (Howard, 1952). Окраску проводили гемалаумом по Майеру. Как известно (Балаж, Блажек, 1982) фазы клеточного цикла Gi, S, G2 в эпителии хрусталика более продолжительны, чем
Экспериментальная пересадка хрусталика рыб амфибиям
Для выявления взаимодействия хрусталиков рыб и амфибий, хрусталики (Brachydanio rerio) передсаживались в переднюю камеру глаза лягушек (Rana temparia L). У данио после декапитации хрусталик изымался из глаз, помещался в физраствор и был подготовлен для трансплантации. После этого под контролем бинокуляра тонко отточенным микроскальпелем у лягушки, находящийся под эфирным наркозом по лимбу роговицы делался надрез, в который подсаживался хрусталик рыб с таким расчетом, чтобы передний полюс хрусталика рыб соприкасался с эпителием хрусталика лягушки. Через три дня рана зарастала, и хрусталик рыбы оказывался полностью включенным в переднюю камеру амфибий (Симаков и др., 2004). Продолжительность опыта составила 9 дней. Пересадка была проведена 14 лягушкам в правый глаз. По окончанию опыта лягушки забивались, хрусталики рыб и амфибий изымались и из их эпителия готовились плоскосные препараты по методикам описанным выше.
Одной из важнейших задач проведенных исследований было определение степени чувствительности митотическои активности эпителия хрусталика рыб и сравнение данного показателя с другими биологическими показателями ряда представительных гидробионтов. В рыбохозяйственные водоемы чаще всего попадают вещества 3-го и 4-го класса опасности, однако существует вероятность попадания в результате техногенных катастроф и аварий высоко-и сильнотоксичных веществ и соединений (Глушко, 1976; Шерстнева и др., 1993). Сравнительный анализ чувствительности ряда биологических показателей гидробионтов к токсическому воздействию проводился с использованием: - высокотоксичных веществ - хлорбензола, трихлорбензола; - сильнотоксичных веществ, обладающих выраженным генотоксичным и мутагенным действием - 2-нафтола и эпихлоргидрина (алкилирующее хлорорганическое соединение); - умеренно токсичного вещества - флокулянта "Праестол" (токсичное акриловое соединение, широко используемое в промышленности в качестве ускорителя процессов осаждения, флотации и др.); - слаботоксичного вещества 4-го класса опасности — органоминерального материала "Прекан", которое представляет собой известковые гранулы с закапсулированной нефтью (данный материал, попадая в водоемы, оседает на дно, оказывая токсическое воздействие на бентосные организмы). Таким образом, сравнительный анализ чувствительности различных биологических показателей представительных гидробионтов и показателя митотической активности эпителия хрусталика рыб к действию токсикантов проводился для веществ, обладающих разной степенью токсичности (от слаботоксичных до высокотоксичных) а также веществ, обладающих выраженным генотоксичньш и мутагенным действием (Никифоров-Никишин, л Бородин, 2004 б; Симаков и др., 2005). Влияние токсикантов на выживаемость, эмбриональное развитие, размножение, овогенез и некоторые онтогенетические показатели исследовалось на представительных гидробионтах различного систематического уровня: зоопланктоне, зообентосе, а также на рыбах. Один из основных принципов отбора тест-объектов заключался в том, чтобы у них был явно выражен в онтогенезе период эмбрионального и постларвального развития.
Одной из важных проблем мониторинга водных биоценозов является не только оценка токсикологического воздействия веществ, попадающих в водоемы, но и оценка их влияния на генетический аппарат гидробионтов; (Никифоров-Никишин, 1989; Никифоров-Никишин и др., 2001; Никифоров Никишин, Бородин, 2004 в). Исследования генотоксичности загрязняющих веществ традиционно ведутся на основе анализа аберративных хромосом в клетках тканей и органов гидробионтов на стадиях ана-телофазы и иногда профазы.
В качестве объектов исследования генотоксичности веществ чаще всего используются политенные хромосомы личинок хирономид (Симаков, Никифоров-Никишин, 1991), клетки костного мозга амфибий (Макгрегор, Варли, 1986), клетки жаберного эпителия рыб1 (Симаков, 1998), клетки эпителия хрусталика рыб. Эпителий хрусталика рыб представляет собой монослой клеток, что делает его исключительно удобным объектом дляданных исследований.
Хлорбензол. Монохлорбензол относится к группе высокотоксичных веществ и представляет собой прозрачную жидкость с молекулярной массой 112,56 (Мамонтова и др., 2000). Плохо растворим в воде (0,49 г/л при температуре 30 С) (Беспамятнов и др., 1975). Хлорбензол - производное бензола, в котором один атома водорода замещен на хлор. Данное вещество получается при прямом хлорировании бензола газообразным хлором и находит применение в лакокрасочной промышленности, а также для получения взрывчатых веществ. Хлорбензол является исходным продуктом для синтеза пикриновой кислоты и динитрофенола.
Хлорбензол оказывает выраженное токсическое воздействие на живые организмы, главным образом на кровеносную и нервную системы позвоночных животных. Кровь под воздействием данного вещества может подвергаться гемолизу (Oettingen, 1941; Авилова, Карпухина, 1985). Кроме того, хлорбензол способствует развитию лейкемии. Санитарные нормативы по лимитирующему показателю токсичности (ПДКВ) для хлорбензола составляют 0,02 мг/л. Низшие позвоночные животные менее устойчивы к действию хлорпроизводных соединений по сравнению с птицами и млекопитающими. Рыбохозяйственные ПДК, разработанные на низших позвоночных, значительно ниже санитарных ПДК и составляют 0,001 мг/л.
Токсическое воздействие хлорбензола исследовалось нами на дафниях, коловратках и брюхоногих моллюсках. Острые опыты на дафниях проводились при концентрациях хлорбензола 0,2; 0,1 и 0,01 мг/л. Было найдено, что концентрация 0,1 мг/л при 96-часовом опыте дает результаты, близкие к LC50. Поэтому спектр концентраций для хронического эксперимента составил: 0,01; 0,001; 0,0001 мг/л. В опытах с прудовиком
Морфологические изменения в хрусталике рыб при паразитарных катарактах
Паразитарным катарактам подвержены многие виды рыб (более 100 видов). Среди растительноядных рыб особенно восприимчивы белый амур, белые и пестрые толстолобики (Бауэр и др., 1981). Поражение хрусталика метацеркариями диплостом чаще всего приводит к необратимым помутнениям. На поздних стадиях развития паразитарной катаракты отмечается общее уменьшение белка и мукополисахаридов, а также гидратация волокон и капсулы хрусталика (Симаков, Никифоров-Никишин, 1993).
Наши исследования позволили установить различные типы реакции хрусталика у различных видов рыб на поражения паразитами. Наибольшая чувствительность к инвазии метацеркариями наблюдается у карпа (Cyprinus carpio) (Никифоров-Никишин и др., 2004 в). Даже незначительное количество диплостом приводит к потере прозрачности хрусталика. При 2—4 паразитах наблюдаются воспаление роговицы глаза, гидратация коры и волокон хрусталика, развитие ядерной катаракты (табл. 4). Наличие более 10 паразитов приводит к полной потери прозрачности хрусталика, что приводит к нарушению ориентации рыбы и ее гибели. Паразитарное поражение хрусталика сопровождается процессами повреждения роговицы и других частей глаза.
Проведенный анализ данных биомикроскопии хрусталика карпа показывает, что оптические отклонения чаще наблюдаются при наличии паразита в левом глазу, чем в правом (Никифоров-Никишин и др., 2004 в) (табл. 5). Наиболее часто встречающийся тип нарушений при единичных метацеркариях в глазу — отслоение ядра хрусталика, при этом волокна ядра и коры хрусталика остаются прозрачными. Визуальное наблюдение хрусталиков рыб с этим типом поражениями не позволяет выявитьотмеченной аномалии, она проявляется только при исследовании с помощьющелевой лампы.Рис. 14. Хрусталик пескаря, пораженный метацеркариями диплостом. Вид в щелевую лампу.
Пескарь (Gobio gobio) более устойчив к поражению хрусталика паразитами. Основная масса паразитов локализуется вокруг твердого ядра хрусталика. При небольшом количестве метацеркарий диплостом (менее 10), хрусталик сохраняет прозрачность. Более 20 паразитов в хрусталике приводят к частичной потери прозрачности, которая, по всей видимости, носит обратимый характер (рис. 14). При этом хрусталиковые волокна фрагментируются вокруг паразита не теряя прозрачности по всей длине.
Хрусталик головешки ротана (Percottus glehni) обладает рядом морфологических особенностей, которые делают его невосприимчивым к инвазии метацеркариями диплостом. В первую очередь, это наличие толстой многослойной капсулы, по всей видимости, не проницаемой для паразитов. Кроме того, симпластические многоядерные волокна хрусталика ротана обладают высокой способностью к регенерации. Все это делает хрусталик головешки ротана практически полностью не восприимчивым к паразитарному поражению. Следует отметить, что случаи непаразитарных катаракт у головешки ротана также не отмечены. Исследования динамики патологических процессов в хрусталике рыб в течение 30 дней показывают, что помутнение развивается медленно и, видимо, занимает несколько месяцев, прежде чем появляются новые оптические отклонения в хрусталике. Проведенные исследования показали, что присутствие метацеркарий диплостом может приводить к тотальному поражению хрусталика, даже если паразиты встречаются в единичных экземплярах. В тоже время, у некоторых особей оптические свойства хрусталика при наличии паразитов не меняются (24,3 % обследованных хрусталиков). Смещение ядра хрусталика при локализации паразита на переднем полюсе, возможно, указывает на наличие токсического действия метаболитов метацеркарий, проявляющегося в изменении адгезивных свойств мукополисахаридов, играющих роль цементирующего вещества хрусталиковых волокон (Симаков и др., 1993).
Полученные результаты заставляют обратить внимание на частые случаи поражения метацеркариями хрусталиков подопытных рыб. При использовании хрусталика рыб в качестве тест-объекта в токсикологических исследованиях необходимо проводить тщательный предварительный отбор подопытного материала, с тем, чтобы исключить из эксперимента особей, имеющих различные нарушения прозрачности хрусталика, в частности, вызванные паразитарной катарактой. Подобный отбор осуществлялся на всех этапах данного исследования.
