Введение к работе
,xv
Актуальность исследования. Нехромосомная наследственность, как одна из ветвей генетики, была открыта при изучении наследования спонтанных хлорофильных мутаций у высших растений (Baur, 1909, Correns, 1909). Открытие ДНК в хлоропластах в начале 60-х годов, явилось стимулом к экспериментальным исследованиям пластид как относительно автономных генетических систем растительной клетки, и поставило вопрос о роли пластома в процессах регуляции развития и жизнедеятельности растительных организмов. ДНК пластид, на долю которой приходится всего несколько процентов всей клеточной ДНК, участвует в реализации жизненно важных функций растений. Геном пластид кодирует около половины белков, участвующих в фотосинтезе, а также ряд компонентов органелльной белок-синтезирующей системы (Одинцова, Юрина, 2003). С ним связаны многие хозяйственно ценные признаки растений, такие как общая продуктивность, устойчивость к неблагоприятным факторам внешней среды, некоторым антибиотикам, гербицидам, грибным патогенам
Мутанты для генетиков всегда представляли прекрасную модель для изучения проблемы «ген-признак». В этом плане не составляют исключение и пла-стидные хлорофильные мутации. Однако их ценность возрастает в связи с тем, что биогенез и функционирование хлоропластов, их фотосинтетическая активность находятся под двойным ядерно-органелльным контролем. Поэтому генетический анализ таких наследственных изменений дает возможность выявлять не только структурные компоненты органелл. детерминированные пластомом, но и закономерности пластидно-ядерньтх взаимоотношений. Именно благодаря изучению пластидных мутантов удалось локализовать целую группу цитогенов, определяющих некоторые реакции фотосинтеза: 6 генов ФС I, 13 генов, кодирующих белки полипептидного комплекса ФС II, 11 гечов комплекса цитохром b/f, АТФ-синтазы и белков стромы хлоропластов (Rochaix, 1997) Кроме того, нельзя недооценивать роль пластидных мутаций в генетике устойчивости растений к абиотическим факторам. В настоящее время приходит признание цито-плазматической изменчивости, как значимого дополнительного фактора в эволюции и селекции растительных организмов.
Как правило, в естественных условиях мутации з пластидной ДНК возникают с частотой не выше 0,02 - 0,06% (Hagemann, 1971; 1979). Поэтому увеличение ассортимента пластидных мутаций с помощью индуцированного мутагенеза, существенно ускоряет решение многих проблем, относящихся не только к генетике пластид, но и к некоторым разделам биохимии, физиологии растений и селекции.
Долгое время четких и воспроизводимых способов получения мутаций пластид у высших растений не существовало, несмотря на неоднократные попытки, предпринимавшиеся в этом направлении (Белецкий, 1989). Для искусственного получения внеядерных мутантов были исследованы различные химические мутагены. Однако по причине низкой эффективности и отсутствия специфичности от большинства_и.з них пришлось довольно быстро отказаться
(Даниленко, Давьгденко,
0Є&ЗГ- В 1969г. -КЩиЦлецким и ЕК. Разорителевой
Г." М К А
200 6 ^
впервые была доказана возможность индукции мутаций пластид у подсолнечника при помощи ]Ч-нитрозо-Ы-метилмочевины (НММ) (Белецкий и др , 1969; Разорителева и др., 1970а; 19706). На базе этих пионерских работ в НИИ биологии РГУ было положено начало всестороннему исследованию НММ-мутагснеза пластид высших растений, в которых непосредственное участие принимал автор настоящей работы. Результат многолетних исследований в данной области оформился в виде уникальной коллекции внеядерных хлорофильных мутантов подсолнечника и горчицы (Разорителева и др . 1995, Usatov et а! , 2001; Усатов и др., 2003а; Усатов и др., 20036; Усатов и др , 2004). Получение и исследование этих мутантных форм стало содержанием настоящей работы.
Цель и задачи исследования. Целью работы является оптимизация метода эффективного получения внеядерных хлорофильных мутантов у высших растений при использовании НММ: выявление закономерностей индукции и фенотипического выражения пластидных мутаций, а также способов модификации этих процессов; изучение возможности и особенностей ревертирования пластидных мутаций; анализ состояния системы биосинтеза хлорофилла, особенности биогенеза и функционирования фотосинтетического аппарата, оценка активности ряда гидролитических ферментов у мутантов; создание на основе НММ - мутагенеза солеустойчивых форм с/х культур.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
определить эффективность НММ как индуктора пластидных мутаций в зависимости от концентрации и времени действия мутагена на прорастающие семена подсолнечника;
исследовать частоту и спектр внеядерных хлорофильных мутаций после обработки семян подсолнечника НММ и особенности их наследования;
отобрать и поддерживать в поколениях, генетические линии, индуцированных пластомных мутантов;
- выявить особенности ревертирования и характерные типы реверсий
внеядерных хлорофильных мутаций en-chlorina;
оценить норму реакции хлорофилл-дефицитности у внеядерных пестролистных форм и мутантов enxhlorina подсолнечника в зависимости от условий выращивания растений;
изучить структурные изменения фотосинтетического аппарата у внеядерных пестролистных форм и мутантов enxhlorina подсолнечника;
- определить содержание редуцирующих Сахаров и активность |3-
гликозидаз у пестролистных форм и мутантов en.xblorma подсолнечника;
- оптимизировать метод получения солеустойчивых форм подсолнечника
и горчицы с помощью НММ-мутагенеза.
Научная новизна и значимость полученных результатов. Научная новизна исследования состоит в получении, поддержании и генетическом анализе уникальной коллекции внеядерных хлорофильных мутантов подсолнечника и горчицы, представленной более 100 линиями пестролистных химер, форм chlorina и реверсионных мутантов, многоплановом изучении структурно функциональных характеристик мутантных пластид, выявлении способов реверти-
рования мутантов и получении, с помощью НММ-мутагенеза, солеустойчивых форм, не отягощенных хлорофильными дефектами. В результате исследований впервые:
экспериментально обоснованы наиболее чувствительные периоды развития проростков подсолнечника к действию НММ и определены оптимальные концентрации мутагена, приводящие к эффективной индукции внеядерных хлорофильных мутаций;
проведен гибридологический, биохимический и ульраструктурный анализ полученных мутантов, свидетельствующий об их пластомной природе. Установлены внеядерный тип наследования мутантных признаков, постоянное соматическое расщепление, дефекты в структурно-функциональной организации хлоропластов, наличие гетеропластидных клеток, различия в структуре ДНК нормальных и мутантных пластид;
проведен сравнительный анализ эффективности индукции хлорофильных мутаций у подсолнечника тремя алкилирующими мутагенами, НММ, ЭИ и ДЭС, показавший специфичность действия только НММ, как пластидного мутагена;
создана модель для изучения особенностей становления внеядерных мутаций на уровне фенотипа, основанная на выщеплении в потомстве (на протяжении 7 генераций) пластомных мутантов en-chlorina, после действия на них НММ, внеядерных ревертантных (мутантных) растений. Частота возникновения реверсионных мутантов, определенная по количеству семей Мь составила около 50%;
обнаружено, что в пластидах мутантов var-10 и en-chlorina-5 регистрируются все типы пигмент-белковых комплексов фотосинтетического аппарата, характерные для зеленых растений инбредной линии 3629, с измененным соотношением и редуцированным количеством. Первичным признаком дефицита хлорофилла является снижение светимости комплексов ФС 1, последующее разрушение комплексов ФС 2, а затем и ССК по мере усиления фотодеструкци-онных процессов. Нарушение структуры фотосинтетического аппарата сопровождается снижением активности РБФК, содержания редуцирующих Сахаров и активацией Р-гликозидаз;
обнаружена свето- и температуро-зависимость хлорофилл - дефицитности у мутантов var-10 и en-chlorina-5;
- разработан способ получения солеустойчивых форм подсолнечника и
горчицы, с помощью НММ.
Практическая значимость полученных результатов. Разработаны методологические основы эффективного получения пластомных мутаций высших растений с помощью алкилирующего мутагена НММ. Обнаруженная в данном исследовании высокая изменчивость генетического материала клеточных орга-нелл может служить базой для создания разнообразных внеядерных форм у с/х культур, как исходного материала для селекции.
Показана принципиальная возможность получения солеустойчивых форм подсолнечника и горчицы с помощью НММ-мутагенеза, проявивших повы-
шенную продуктивность по сравнению с исходными растениями при их культивировании в условиях хлоридного засоления.
Уникальная коллекция внеядерных мутантов подсолнечника и горчицы с различной степенью выраженности хлорофильных дефектов, созданная в результате данного исследования, является моделью для изучения роли пластома в биогенезе и функционировании хлоропласгов, различных аспектов пластид-но-ядерных взаимоотношений.
Материалы диссертации включены в программу заняіий студентов био-лого-почвенпого факультета РГУ по специальным курсам на кафедрах генетики и биохимии.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
-
Воздействия НММ индуцирует появление у подсолнечника и горчицы хлорофильных мутантов двух гипов - пестролистные химеры (variegated) и желто-зеленые формы (en chlorina), с внеядерным типом наследования мутантних фенотипов. Выявлены специфические различия в реципрокных скрещиваниях с исходной формой, постоянное, на протяжении нескольких десятилетий, соматическое расщепление, дефекты структуры и функции мутантных пластид, наличие гетеропластидных клеток, изменения в структуре пластидной ДНК, что свидетельствует о пластомной природе индуцированных мутаций.
-
В потомстве пластомных мутантов erf chlorina реверсии к исходной форме возникают спонтанно в единичных случаях Индуцированные НММ внеядер-ные реверсии возникают в потомстве мутантов en chlorina на протяжении как минимум 7-ми генераций с частотой около 50%, по количеству семей в М.. Ре-вертирование пластидных мутаций реализуется различными механизмами, приводя, либо к полному восстановлению мутантного фенотипа (истиная реверсия), или частичному - (ядерная, митохондриальная и пластидная супрессии).
-
Первичным проявлением дефицита хлорофилла у мутантов на уровне организации фотосинтетического аппарата является прогрессирующая редукция комплексов ФС I, а затем, по мере усиления с возрастом растений фотодест-рукционных процессов, разрушение комплексов ФС II и ССК.
4 Нарушения структурной организации фотосингетического аппарата у хлорофильных мутантов сопровождаются снижением активности темновых стадий фотосинтеза, редукцией содержания восстановленных Сахаров и усилением катаболических процессов, а именно многократным повышением активности (3-гликозидаз и интенсивной внутриклеточной вакуолизацией.
5. Индуцированный НММ мутагенез высших растений использован в практике для получения солеустойчивых форм подсолнечника и горчицы
Апробация работы. Резулыаш исследований были представлены и обсуждены на IV и V Всесоюзных межуниверситетских конференциях по «Биологии клетки» (Тбилиси, 1985; 1987); V и VI съездах ВОГиС им. Н.И Вавилова (Москва, 1987; Минск, 1992); Всесоюзном совещании «Химический мутагенз и проблемы экологии (Москва, 1992): 1, П и III съездах Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Саратов, 1994; Санкт-Петербург, 2000; Москва 2004); Международной конференции «Молекулярно-генетические маркеры
растений» (Киев, 1996); Международной конференции «Актуальные проблемы с/х биотехнологии» (Москва, 1996); Международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Москва, 2001); Международной конференции «Генетические коллекции, изогенные и аллоплазма-тические линии» (Новосибирск, 2001); научно-пракгической конференции с международным участием «Свободные радикалы, антиоксиданты и болезни человека» (Смоленск, 2001); VIII съезде генетиков и селекционеров Республики Беларусь (Минск, 2002); V съезде Белорусского общества фотобиологов и биофизиков (Минск, 2002); V съезде общества физиологов растений России (Пенза, 2003); Международной конференции «Клеточные ядра и пластиды растений: биохимия и биотехнология» (Минск, 2004); научных конференциях по генетике и селекции Ростовского отделения ВОГиС (Ростов-на-Дону, 1982 - 2004 гг).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 44 печатных работы.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, четырех глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Диссертация изложена на 229 страницах текста, содержит 47 таблицы и 36 рисунка. Список литературы включает 423 цитируемых источника.
