Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы.
1.1 Общая Характеристика Agrobacterium tumefaciens II
1.2 ТІ плазмиды как этиологические агенты корончатых галлов 15
1.2.1 Генетика ТІ плазмид 15
1.2.2 Механизмы интеграции рТі в геном растения 17
1.3 Роль фйтогормонов В Опс+ фенотипе A. Tumefaciens 26
1.4 Фитогормональная активность Agrobacterium rhizogenes , Pseudomonas savastanoi , Co
ry пеЪ act erium fasciens 36
1.5 Биологические факторы, ограничивающие ОНКОГенНОСТЬ A. tumefaciens 38
1.5.1 Агроцины - как один из биологических методов борьбы с корончатогалловой болезнью . , 38
1.5.2 Влияние плазмиды pSa группы inc v/ на
ОНКОГенНОСТЬ A. tumefaciens 40
1.6 Заключение по обзору 41
ГЛАВА 2. Материалы и методы.
2.1 Бактериальные штаммы и плазмиды 45
2.2 Среды и реактивы 45
2.3 Методы исследований 53
2.3.1 Культивирование бактерий 53
2.3.2 Конъюгация 54
2.3.3 Анализ трансконъюгантов 54
2.3.4 Биохимический тест на Agrobacterium tumefa-ciens 54
2.3.5 Аналитическое выделение плазмид 55
2.3.6 Определение продукции индолилуксусной кислоты 56
2.3.7 Количественное определение белка 57
2.3.8 Очистка эфира от перекисей 57
2.3.9 Определение онкогенности исследуемых штаммов. 57
2.3.10 Элиминация плазмид pSa и R388 58
2.3.11 Химическая комплементация экзогенной ИУК
One" фенотипа трансконъюгантов ът и LPIO. 58
2.3.12 Определение чувствительности штаммов A.tume-
faciens к генциан-виолету и дезоксихолату , 58
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований.
3.1 Связь между продукцией ИУК и Опс+ фенотипом A.tumefaciens 60
3.2 Корреляция между типом плазмиды ТІ В штамме A.tumefaciens И МОрфОЛОГИвЙ ОЩГХОЛИ 66
3.3 Свойства траНСКОНЪЮГаНТОВ A.tumefaciens , несущих R плазмиды из групп Inc W , Inc PIf Inc X 69
3.3.1 Получение трансконъюгантов, определение частот переноса R плазмид, уровней лекарственной резистентности 69
3.3.2 Изучение ОНКОГенносТИ ШТаММОВ A.tumefaciens АТСС 15955, С58 и их дериватов с
R плазмидами 72
3.3.3 Электрофоретический анализ плазмид в штаммах A.tumefасiens АТСС 15955, С58 И ИХ дериватах с R плазмидами 73
3.3.4 Восстановление онкогенности трансконъюган-тов A.tumefaciens АТСС 15955 после удалєния плазмид pSa и R388 75
3.3.5 Состояние липополисахарида клеточной стенки у ШТаММОВ A.tumefaciens АТСС 15955,
С58 и их трансконъюгантов с плазмидами pSa ИЛИ R388 . 76
3.4 Влияние r плазмид на продукцию Йук Штаммом A.tumefaciens АТСС 15955, содержа щим pTi 15955 90
3.5 Химическая комплементация One" фенотипа трансконъюгантов LP8 и LPIO с помощью
экзогенной ИУК 95
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 98
Выводы 115
Литература
- Общая Характеристика Agrobacterium tumefaciens
- Агроцины - как один из биологических методов борьбы с корончатогалловой болезнью
- Бактериальные штаммы и плазмиды
- Связь между продукцией ИУК и Опс+ фенотипом A.tumefaciens
Введение к работе
Актуальность темы. Среди патологических новообразований у растений, индуцируемых фитопатогенными бактериями, особое место занимают КОрончатОГалЛОВЫе ОПУХОЛИ, вызываемые Agrobacterium tumefaciens , A.tumefaciens поражает ДВудОЛЬНЫв растения, OT-НОСЯЩИЄСЯ К 60 семействам ( Elliot f 1951; De Cleene and De Ley ,
1976). Абсолютно иммунных к бактериальному раку растений нет, относительно иммунные и слабо поражаемые растения встречаются среди семейств РаЪасеае t Papaveraceae , Primulaceae , Berberiola- ceae t Ramuncuiaceae ( Галачьян, 1979). В Советском Союзе бактериальный рак зарегистрирован повсеместно, отличается большой вредоносностью, отмечен на многих культурных растениях, таких как цитрусовые, чайные кусты, ягодные кустарники, хмель, томаты, бобовые культуры, свекла ( Чернышева, Назарчук, 1975; Павленко, 1963; Исаева, 1975;,Калиниченко, 1975; Горленко, 1975). Однако наиболее часто им поражаются виноградная лоза и плодовые. Например, в Молдавии поражаемоеть бактериальным раком виноградников доходит в некоторых районах до 65 % ( Станко, Тутевич, 1972). В настоящее Время A.tumefaciens ЯВЛЯЄТСЯ третьим ПО значению фи- топатогеном и такая его агрессивность диктует необходимость использования различных подходов и методов борьбы с ним.
Бактериальный рак растений представляет собой гиперпластическое заболевание, при котором в зараженных тканях в результате ускоренного и неконтролируемого клеточного деления возникает опухоль. Свойства опухолей растений, индуцируемых агробактериями, изучаются давно и довольно хорошо описаны ( Байдербек, 1981 ; Punier,1983).
В настоящее Время установлено, ЧТО ОНКОГеННОСТЬ A.tumefaciens определяется наличием в клетках этих бактерий крупных
ПЛаЗМИД ( 95-160 МД ), Названных Ті, ИЛИ pTi ( Zaenen et al .,
1974)« Сравнительно небольшой участок ті плазмид, обозначенный как Т-район, включается в геном растительной клетки и изменяет ее метаболизм, морфологию и физиологию, т.е. приводит к ее
Трансформации ( Chilton et al,,I977; Schell et al.,I979; Learners et al ,,1980; De Beuckeler et al .,1981),
В Настоящее Время ВЫЗВаННЫе A.tumefaciens ОПУХОЛИ раСТв- ний используются в качестве модели для изучения этиологии и патогенеза рака у различных организмов, включая животных и человека, а ті плазмиды рассматриваются в качестве природного вектора для переноса, интеграции и экспрессии различных генов в растениях ( Van Montagu, Schell,1979; Schell ,1978; tester, ьїоп-toya ,1979; Lawton and Chilton ,1984; Винецкий,І984; Андриа-нов, 1984).'
Несмотря на интенсивные исследования, которые ведутся в последнее время с целью выявления механизма опухолеобразования
У растений при Заражении ИХ A.tumefaciens , ЭТОТ вопрос ДО СИХ пор остается дискуссионным. Экспериментальные модели онкогене-за, предложенные для растений и животных, во многом сходны. Одна из гипотез, объясняющая механизм внедрения Т-ДНК в геном растения, состоит в том, что Т-ДНК имеет транспозонную структуру и подобно другим "прыгающим" генам способна перескакивать с бактериальной ДНК на ДНК растения и экспрессироваться в составе
Последней. В ПОСЛеДНИе ГОДЫ ИЗ ГеНОМа ДрОЖЖеЙ ( Cameron et al,,
1979), дрозофилы и млекопитающих ( Georgiev et al .,1981) также изолированы мобильные диспергированные генетические элементы. Транспозиция мобильных диспергированных генов - относитесь- но частые события, они могут являться одной из наиболее существенных причин генетических перестроек, ведущих к опухолевой трансформации ( Георгиев с соавт.,1981).
Наряду с этим известно, что в составе ті плазмид находятся гены, контролирующие продукцию фитогормонов - ауксинов и пи-
ТОКИНИНОВ ( Liu et al ,,1981; Inze et ai,I984; Schroder et al.,
1984), Предполагают, что изменение баланса фитогормонов, связанного с активностью этих генов, лежит в основе злокачественного перерождения клеток двудольных растений под влиянием A.tu-mefaciens ( Nester, Kosuge ,1981; Schilperoort et al .,1980; Чернин,1983). Представления о гормональной природе онкогенной активности pTi нуждаются в дальнейшей экспериментальной проверке. Именно поэтому практическое и теоретическое значение проблемы канцерогенеза у растений обусловливает закономерный интерес к изучению опухолеобразования и роли основного природного ауксина - индолил-3-уксусной кислоты (ИУК) в этом процессе.
Обнаружение феномена подавления онкогенного фенотипа штаммов A.tumefaciens путем ВВЄДЄНИЯ В ИХ КЛЄТКИ ПЛаЗМИДЫ pSa ИЗ группы inc v» ( Loper and Kado ,1979) дает право предположить, что такие природные плазмид-плазмидные взаимодействия, направленные на подавление онкогенности, могут быть использованы в борьбе с корончатогалловой болезнью растений. Это определило необходимость изучения природы данного явления, поиск других плазмид с антионкогенной активностью и исследование возможности использования их в борьбе с опухолеобразованием у растений.
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение влияния R плазмид из различных групп несовместимости
На ОНКОГеННЫе СВОЙСТВа ВИрулеНТНЫХ ШТаММОВ Agrobacterium tumefa- ciens , относящихся к октопиновому и нопалиновому типам, а также исследование наличия взаимосвязи между онкогенностью различных штаммов A.tumefaciens и их способностьюпродуцировать ИУК. Исходя из целей исследования, перед нами стояли следующие задачи : - изучение природы антионкогенного действия плазмиды pSa
В ШТаММаХ A.tumefaciens. выявление новых плазмид с антионкогенной активностью.
Исследование Значения СПОСОбНОСТИ ШТаММОВ A.tumefaciens продуцировать основной природный ауксин - ИУК в проявлении их онкогенности. Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые установлено, что подавление онкогенной активности вирулентных штаммов A.tumefaciens октопинового и нопалинового типов не является уникальным свойством плазмиды pSa из группы inc w . Оно присуще по крайней мере еще одной плазмиде, R388 , которая также относится к группе несовместимости w , Антионкогенная активность является специфическим свойством плазмид pSa И R388 , поскольку другие R плазмиды, используемые в работе, а именно: RP4 HR68.45 ИЗ группы Inc PI f R6K ИЗ группы Inc X, а также R7K из группы inc w не обладают способностью подавлять опс+ фенотип штаммов A.tumefaciens. Установлено, что эффект плазмид pSa и R388 не связан с вытеснением из трансконъюгантов плазмиды рТі и подавлением ее соматических функций, включая катаболизм опинов. * Исходя из предположения о том, что ИУК может являться тем патогенетическим фактором, который приводит к развитию опухоли, выявлена взаимосвязь между онкогенностью и уровнем продукции
ИУК у ЦеЛОГО ряда ШТаММОВ A.tumefaciens И A.radiobacter Впервые показано, что антионкогенное действие плазмид pSa или R388 сочетается с их способностью снижать уровень продукции ИУК траНСКОНЪЮГантамИ ДО УРОВНЯ неоНКОГеННЫХ ШТаММОВ A.tumefaciens и A.radiobactert причем обработка инфицируемых растений экзогенной ИУК обеспечивает химическую комплементацию ошГ фенотипа трансконъюгантов, содержащих плазмиду pSa или R388 , выражающуюся в восстановлении их онкогенности. Элиминация плазмид pSa или R388 из трансконъюгантов ведет к восстановлению онко-
ГЄННОЙ И фИТОГОрМОНаЛЬНОЙ функции Ті ПЛаЗМИДЫ штамма A.tumefaciens АТСС 15955, Полученные результаты указывают на важную роль ИУК бактериального происхождения в индукции корончатых галлов на растениях и на возможную природу антионкогенной активности R ПЛаЗМИД ИЗ ГРУППЫ Inc W ( pSa И R388 ).
Установлено, что плазмида pSa повреждает и/или существенно модифици'рует клеточный липополисахарид в трансконъюгантах, несущих pTi 15955, в результате чего нарушается прикрепление последних к клеточной стенке растения. Однако этот эффект является строго специфичным, поскольку наблюдается только в одном штамме A.tumefaciens АТСС 15955 и отсутствует в штамме С58.
ПлаЗМИДа R388 НЄ Оказывает анаЛОГИЧНОГО Эффекта В штаммах A.tumefaciens АТСС 15955 и С58.
Подавление Опс+ фенотипа Ті плазмид вирулентных штаммов A.tumefaciens ПЛаЗМИДамИ pSa И R388 ИЗ Группы Іпс її преДСТав- ляет большой интерес в практическом отношении. Мы предполагаем, что такое взаимодействие R плазмид с pTi , приводящее к подавлению ОНКОГЄННОЙ аКТИВНОСТИ ШТаММОВ A.tumefaciens , МОЖЄТ быть использовано в качестве одного из биологических методов за- щиты растений от корончатых галлов и борьбы с возбудителем этой болезни. - II -
Общая Характеристика Agrobacterium tumefaciens
Впервые около ста лет назад cavara (1897) выделил из опухоли винограда бактерию, впоследствии названную smith с соавторами (I9II) Bacterium tumefaciens ( ОТ ЛаТИНСКОГО tumor опухоль, г ас і о - делаю). В настоящее время бактерию, вирулентные штаммы которой индуцируют неопластическое заболевание растений - корончатые Галлы, ПРИНЯТО Называть Agrobacterium принадлежащие совместно с клубеньковыми бактериями рода Rhizo bium к семейству Rhizobeaceae Согласно РУКОВОДСТВУ Bergey ( 1974) это аэроб, широко распространенный в природе, представляющий собой короткие подвижные палочки tumefaciens.A. tumefaciens - грамотрицателыше почвенные бактерии, с полярными жгутиками , размером 0,4-0,8 х 1,0-3,0 мкм, способный иногда к.образованию цепочек ( Калинин с соавт.,1980). Спор не образует. При культивировании на питательном агаре образует маленькие, круглые, несколько приподнятые влажно-блестящие белые просвечивающиеся колонии, на скошенном агаре - слизистый блестящий налет. В мя-сопептонном бульоне растут медленно, причем можно наблюдать образование большого количества инволюционных форм в виде у -образных фигур, похожих на бактероиды у клубеньковых бактерий. Рост бактерий отмечается в широком интервале температур от 0С до 37С, оптимум - 25С - 30С, термальная точка гибели бактерий - 51С. Оптимальная для роста агробактерий реакция среды -нейтральная.
Источником азота для A.tumefaciens могут служить не только органические, но и неорганические соединения азота, различные аммиачные соли, а также селитра, однако при этом необходим источник энергии в виде углеводов, без которых роста бактерий НЄ Наблюдается» A.tumefaciens принадлежит К ОЛИГОНИТрофИЛЬНЫМ бактериям и довольствуется, по-видимому, минимальным количеством азота в среде. A.tumefaciens характеризуется хемооргано-трофией. Для некоторых штаммов достаточно присутствия в среде простых углеводов: глюкозы, сахарозы, лактозы, галактозы и т.д. Однако другие штаммы растут лишь при наличии в среде витаминных добавок ( Kersters et ai .,1973; Калинин с соавт., 1980).
Важной особенностью A.tumefaciens ЯВЛЯЄТСЯ ЄГО СПОСОбНОСТЬ сбраживать лактозу с образованием 3-кетолактозы, поэтому этот бИОХИМИЧесКИЙ ТЄСТ ШИРОКО ИСПОЛЬЗуеТСЯ ДЛЯ Идентификации A.tumefaciens (Bernaerts, De Ley ,1963).
A.tumefaciens продуцирует in vitro ЦЄЛНЙ РЯД ВЄЩЄСТВ, прямо или косвенно влияющих на рост растений. Бактерии могут синтезировать большое количество биотина, рибофлавина, немного пантотеновой кислоты ( stapp ,1958). В фильтратах культу-ральной жидкости, экстрактах из бактериальной массы можно обнаружить ЦИТОКИНИН ( Upper et al .,1970; Morris, Chapman, 1975), ГИббереЛЛИНОПОДОбНЫе вещества ( Galsky, Lippincott, 1967). Вирулентные И авируленТНЫе формы A.tumefaciens превращают ТрИПТОфаН В ИНДОЛИЛуКСуСНуТО КИСЛОТУ ( Kaper, Veldstra, 1958; Sukanya, Vaidyanathan ,1964).
A.tumefaciens не способны длительное время сохраняться в почве, свободной от растительных остатков. Жизнеспособность и вирулентность бактерий в сильной степени зависят от наличия почвенных антагонистов, а также от химических и физических свойств почвы, в частности, ее влажности и кислотности ( Израильский С СОавт., 1979). У A.tumefaciens , как И у ДРУГИХ бактерий, например Pseudomonas syringae » Ps. citriputea Ps. cerasi существуют штаммы, которые в неодинаковой степени заражают разные растения и имеют относительную специфичность внутри одного и того же бактериального вида.
Выполненные в начале 40-х годов работы Braun с соавторами показали, что для индукции опухоли достаточно лишь кратковременного контакта бактерий с растениями, а само ее развитие может происходить и в отсутствие бактерий ( Braun, white , 1943). На основании этого было постулировано, что бактерии продуцируют какой-то внеклеточный фактор, ответственный лишь за индукцию опухоли, но не за ее последующее развитие ( Braun , White ,1943; Braun ,1947; Braun, Mandle ,1948). Природа этого фактора оставалась неизвестной, однако свойство трансформированных клеток растения сохранять опухолевый фенотип в культуре ткани в течение многих лет пассирования указывало на стойкое изменение генотипа (Braun, Mandle j 1948) . -В клетках корончатых гадлов, растущих in vitro в отсутствие жизнеспособных бактерий, стремились выявить чужеродный генетический материал бактериального происхождения.
Наряду с формулированием представлений о существовании внеклеточного "тумор-индуцирующего агента" бактериального происхождения было установлено еще три фундаментальных факта, касающихся свойств онкогенных ( Опс+ ) штаммов A.tumefaciens и инду-цируемых ими опухолей .
Агроцины - как один из биологических методов борьбы с корончатогалловой болезнью
Недавние исследования показали, что онкогенностъ штаммов A.tumefaciens октопинового и нопалинового типов можно подавить введением в них плазмиды лекарственной устойчивости psa » характеризующейся ШИРОКИМ СПеКТрОМ ХОЗЯев ( Gorai et al .,1979). Указанный эффект плазмиды psa не связан с какими-либо стойкими повреждениями плазмид ті либо с их вытеснением из транс КОНЪЮГаНТОВ ( Farrand et al .,1981).
Плазмида psa принадлежит к группе inc w » которая включа-ет помимо.плазмиды psa, плазмиды R388 и R7K . Это относительно небольшие, конъюгативные плазмиды размером 30-35 кв, в которых общая гомологичная область около 20 кв содержит гены, вовлекаемые в функции репликации и переноса ( Gorai et ai.fI979; Ward, Grinsted ,1982). Дополнительно к генам, связанным с репликацией и переносом, плазмиды из группы inc w несут гены резистентности к различным антибиотикам (табл.3) ( watanabe et al .,1968; Datta, Hedges ,1971; Goetzee et al.,1972; Loper, Kado ,1979). w - плазмиды имеют большее число копий на клетку ( от 3 до 5 ), чем большинство других конъюгативных плазмид ( Paikow ,1975) и содержат рестрикционные сайты, удобные для клонирования ( Leemans et al ,,1982 6),
Получены данные о том, что ген(ы) плазмиды pSa , обусловли-ваюшдй ее способность подавлять онкогенность агробактерий, расположен в тга области плазмидной ДНК, ответственной за мобилизацию и перенос R фактора ( Tait et al ,,1982), однако природа антионкогенной активности pSa остается неясной,
Молекулярные и генетические исследования микроорганизмов, проведенные в два последних десятилетия, выявили, что помимо хромосомной ДНК, многие бактерии содержат автономно реплицирующиеся в цитоплазме кольцевые, двухцепочечные молекулы экстрахромосомной, или плазмидной ДНК. Генетическая информация, заключенная в ДНК плазмид, кодирует самые разнообразные свойства бактерий, в том числе их способность к обмену генетическим материалом и к синтезу различных бактериоцинов, гемолизинов, поверхностных антигенов, токсинов, устойчивость к антибиотикам и солям тяжелых металлов ( Nowick 1969; Clowes , 1972; Ильина, 1974; Чернин,1978).
Многие из плазмидо-специфических функций реализуются в результате тесного взаимодействия продуктов, кодируемых плазмид-ными и хромосомными генами. Эти взаимодействия обеспечивают участие плазмид в ряде жизненно важных процессов, включая метаболизм бактериальной ДНК и РНК, биодеградацию некоторых органических соединений, рост и деление бактериальных клеток ( Чернин, 1978; Воронин, 1979; Ohnishi ,1975; Fennewald et al ,,1978). С расширением сведений о плазмидах у представителей различных се мейств, родов и видов бактерий стало очевидным, что плазмидно-хро-мосомные взаимодействия могут осуществляться не только внутри бактериальных клеток, но и на более высоком уровне организации геномов и что в природе имеются механизмы, благодаря которым генетическая информация бактериальных плазмид может проникнуть в эука-риотические клетки и выразиться в них. Именно такого рода взаимодействие имеет Место В случае Заражения растений A.tumefaciens и образования корончатых галлов. В последние годы выяснилось, что данный инфекционный процесс - природная форма генетической инженерии, а Ті ПЛаЗМИДа, ответственная За ОНКОГеННОСТЬ A.tumefaciens , пока единственный эффективный вектор для введения чужеродных генов в высшие растения. Она стала важным инструментом фундаментальных исследований, поскольку работы по конструированию плазмидных векторов для растений создают базу для практического использования генетической инженерии, открывают большие перспективы в плане улуч-шения культурных растений. Смысл исследований, по генетической инженерии СВОДИТСЯ К ВВедеНИЮ СООТВеТСТВуЮЩИХ ГеНОВ in vivo ИЛИ in vitro в плазмидную ДНК, в ее Т-район, который переносится от бактерии к растению. В настоящее время конструирование векторной системы идет через создание промежуточных векторов, поскольку большие размеры pii , а также наличие в их ДНК большого числа сайтов рестрикции затрудняет применение современных методов генетической инженерии ( Leemans et al ., 1981; Llatzke, Chilton ,1981; АндриаНОВ с соавт., 1982; Пирузян с соавт.,1984). Особый интерес представляют рабОТЫ ПО Изучению ЭКСПресСИИ ГеНОВ Т-ДНК В A.tumefaciens И В растительной клетке, выявившие транскрипцию генов этого района РТІ В A.tumefaciens ( Schroder et al »»1983 і Schroder et al »»1984 » Yanssens et al .,1984) и в клетках октопиновых и нопалиновых корон ЧаТЫХ ГаЛЛОВ ( Мс Pherson et al .,1980; Schroder,Schroder ,1982; Gelvin et al.,I982; Bevan, Chilton ,1982; Joos et al.,I983; Will-mi tzer et al. ,1983). Путь к решению проблемы экспрессии чужеродных генов в растении состоит в создании "химерных генов", содержащих кодирующую область избранного чужеродного гена и регуляторные сигналы одного из эффективно экспрессируемых генов Т-ДНК. Уже получены такие гибридные гены, при переносе которых в опухолевые клетки осуществляется их нормальная экспрессия ( Van Haute et al .,1983; Herrera-Estreiia et al ,,1983a; 19836). Таким образом, работы над созданием вектора для растений ведутся успешно, на хорошем методическом уровне. В последние годы обсуждается вопрос об использовании в качестве вектора плазмиды Ri A.rhizogenes , вызывающих болезнь "борОДаТЫЙ КОреНЬ" у ДВУДОЛЬНЫХ раСТеНИЙ ( Ыооге et al ., 1979; White, Hester ,1980a; 19806).
Бактериальные штаммы и плазмиды
Культуры Agrobacterium turaefaciens хранились При +4С На СКОШенНОМ ПОЛНОЦеННОМ агаре, Escherichia coli На МЯСОПЄПТОННОМ агаре. Бактерии пересевались через месяц. б) Получение культур в логарифмической фазе роста. Бактерии A.tumefaciens засевались в 5 мл жидкой полноценной среды 523 и выращивались в течение 48 ч при 29С. Бактерии Е.соїі засевались в 2 мл МПБ и выращивались при 37С в течение 18 ч. Затем культура разводилась в МПБ в 10 раз и подращивалась при той же температуре 2 ч на щутеле. ДЛЯ переноса ПЛаЗМИД ОТ Е.СОІІ в A.tumefacienB ИСПОЛЬ зовали капельный метод ( siBtrom ,1977).
Культуры донора и реципиента в логарифмической фазе роста смешивали в отношении 1:1 и по 10 капель объемом по 0,02 мл наносили на поверхность агаризованной полноценной среды 523. После инкубации в течение 24 ч при 29С бактерии смывали с поверхности среды в 4 мл фосфатного буфера ( рН 7,1 ) и высевали на минимальную селективную среду для отбора трансконъюгантов. Производился также высев донора и реципиента для определения их жизнеспособности, ставился контроль донора и реципиента на селективной среде. Учет результатов производился на третьи сутки. Частоту переноса плазмид определяли как отношение числа трансконъюгантов к числу клеток донора, взятых в скрещивание.
Полученные колонии трансконъюгантов расчищали с помощью пересевов на среду, используемую для селекции.
Уровни лекарственной резистентности у трансконъюгантов определяли следующим образом: изолированные колонии переносили на минимальную солевую среду, подращивали в течение суток и реплицировали на среды, содержащие различные концентрации антибиотиков. Уровень лекарственной резистентности изучаемых трансконъюгантов выражали максимальной концентрацией лекарственного препарата, при котором возможен рост культуры.
Для подтверждения принадлежности исходных штаммов и транс - 55 конъюгантов к виду A.tumefaciens использовали тест на способность к сбраживанию лактозы с образованием 3-кетолактозы,
Культура исследуемой бактерии, выращенная в течение 1-2 дней при 29С на полноценном агаре, наносилась на поверхность чашки Петри с лактозным агаром каплями по I см в диаметре. Чашки инкубировались 24-28 ч при 29С, после чего поверхность агара заливалась небольшим слоем реактива Бенедикта. Чашки выдерживались при комнатной температуре в течение 35-40 мин. В случае положительной реакции, вокруг зоны роста бактерий образовывалось интенсивное желтое кольцо до 2-3 см в диаметре, которое сильно контрастировало с голубым цветом реактива Бенедикта.
2.3.5 Аналитическое выделение плазмид.
Идентификацию плазмид проводили путем электрофореза в 0,7$-ном агарозном геле экстрактов клеток по методу, описанному Ellis et ai .,1979.
После выращивания бактерий в 25 мл среды РА в течение 12 ч, клетки осаждались и промывались 5 мл ТЕ 8 буфера, после чего ресуспендировались в 4 мл ТЕ 8 буфера. Далее проводили лизиро-вание клеток, добавляя в каждую пробу по 0,5 мл раствора прона-зы (5 мг/мл в ТЕ 8 буфере) и по 0,5 мл раствора SDS (100 мг/мл в ТЕ 8 буфере) при 37С в течение 30-40 мин. Хромосомную ДНК денатурировали добавлением 0,18 мл 2 н раствора NaOH с последующим встряхиванием в течение 10-15 мин. Затем добавляли 0,35 мл З М трис-HCI (рН 7,0) и размешивали до исчезновения вязкости. Далее добавляли 0,6 мл 5 М Naci , перемешивали и приливали 6,1 мл фенола, насыщенного 3$-ым раствором Naci (1:1 v /v ). Предварительно проводили очистку фенола в аппарате для перегонки фенола с добавлением следующих компонентов в расчете на 800мл фенола: 20 мл дистиллированной воды, 100 мг алюминиевой фольги, 50 мг NaHG03 . После десятиминутного перемешивания с фенолом пробы центрифугировали и отбирали по 4 мл верхней водной фазы, к которой добавляли по 0,75 мл 3 М CHgCOONa 31 0 и 1,5 мл 5 М Naci и 12,5 мл этанола, после чего пробы оставляли в морозильнике на ночь. Далее проводили центрифугирование при 5 тыс. об/ мин в течение 10 мин. К подсушенному преципитату добавляли по 0,12 мл TEs 8 буфера и 0,04 мл красителя для электрофореза. Приготовленные образцы плазмидной ДЖ в количестве 0,02-0,04 мл подвергали электрофорезу в агарозном геле (0,7/-ом) в течение 3-4 ч при 100v . ДНК окрашивали раствором бромида этидия ( 0,5 иг/мл) в течение 30-40 мин. Гель фотографировали, используя оранжевый светофильтр.
Связь между продукцией ИУК и Опс+ фенотипом A.tumefaciens
Природа антионкогеняой активности плазмид pSa и из88 остается навыясненнои. Исходя из представлений о том, что онкоген-ность плазмид ТІ В значительной мере определяется их способностью контролировать уровень продукции фитогормонов в штамме-хозяине ( lessens and Clayes ,1978; Liu and Kado ,1979) И ЧТО эти гормоны вовлекаются в индукцию и развитие опухолей растений ( Schilperoort et al,,I980; Nester and Kosuge ,1981), МЫ Предположили, что R плазмиды pSa и R388 из группы inc w в результате какого-то специфического функционального взаимодействия с РТІ 15955 нарушают эту функцию рті. Для проверки данного Предположения ИССЛеДОВаласЬ ПРОДУКЦИЯ ИУК ШТаММОМ A.tumefa- і ciens АТСС 15955, неонкогенными трансконъюгантами с плазмида- і ми pSa или R388, онкогенными трансконъюгантами, содержащими RP4 , R68.45 , R7K , R6K . В качестве контроля были взяты неон- ! КОГенНЫе ШТаММЫ A.tumefaciens IDI 498 И A.radiobacter 2054 И I 2055 (таблица 8).
Полученные результаты показали, что опс+ штамм A.tumefa- : ciens АТСС 15955 и его опс+ дериваты с плазмидами R7KH3
Группы Inc Wt RP4H R68.45H3 Группы Inc PI, R6K ИЗ ГРУППЫ inc x, выращенные в среде, содержащей экзогенный триптофан, продуцируют примерно в 2-3 раза больше ИУК, выявляемой в куль ТуралЬНОЙ ЖИДКОСТИ, ЧЄМ НеОНКОГенНЫе ШТаММЫ A.tumefaciens IDI 498и A.radiobacter 2054, 2055, а также трансконъюганты LP6 - LP9 , содержащие плазмиду psa Еще более резкое снижение содержания ИУК в культуральной жидкости отмечено в случае трансконъюгантов LPIO-LPIз , несущих плазмиду R388 (табл.8). Результаты денситометрии хроматограмм культуральных жидкостей, полученных При выращивании Штамма A.tumefaciens АТСС
15955 и трансконъюгантов LP8 и LPIO показали, что во всех случаях 90-95$ материала, окрашивающегося реактивом Салъковского, образует пятно, соответствующее по Rf чистой ИУК. Это указывает на то, что ИУК является основным компонентом, окрашивающимся реактивом Салъковского и регистрируемым при измерении поглощения при длине волны 525 нм.
Наблюдаемое снижение количества ИУК в культуральной жидкости трансконъюгантов A.tumefaciens АТСС 15955, несущих плазмиды pSa или R388 , могло быть связано с тем, что данные R плазмиды из группы inc w каким-то образом препятствуют выходу синтезированной ИУК из клетки в кулътуральную жидкость. Для выяснения этого вопроса нами были получены в результате разрушения ульт раЗВуКОМ ЭКСТраКТЫ КЛетОК ИЗ ШТаММОВ A.tumefaciens АТСС 15955 и
A.radiob acter 2054 и трансконъюгантов LP8 и LPIO . Исследование содержания ИУК в этих экстрактах выявило такое же 3-4-кратное снижение концентрации ИУК у трансконъюгантов по сравнению С ИСХОДНЫМ ШТаММОМ A.tumefaciens АТСС 15955, ЧТО И В случае определения ИУК в культуральной жидкости (табл.9). В совокупности эти данные указывают на то, что онкогенные и неонкогенные штаммы агробактерий заметно различаются по уровню продукции ИУК, несмотря на то, что в штаммах LP8 и LPIO содержится плаз-мида pii 15955, ответственная как за онкогенность исходного штамма-хозяина 15955, так и за его способность продуцировать ИУК на высоком уровне.
