Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1 Происхождение и классификация томата 8
1.2 Томат как модельный объект в научных исследованиях 11
1.3 Некоторые особенности онтогенеза и органогенеза растений 16
1.3.1 Эмбриональное развитие растений (эмбриогенез) 16
1.3.2 Деятельность побеговых апикальных меристем и развитие листа 18
1.3.3 Общие сведения о морфологии листьев 22
1.3.4 Особенности органогенеза томата 24
1.3.5 Методы изучения программ развития растений 26
1.3.6 Механизмы контроля развития листа 27
1.4 Генетический контроль развития листа на разных этапах его формирования 31
1.4.1 Генетический контроль инициации листа 31
1.4.2 Генетический контроль развития листа. Определение размера и рассеченности 35
1.4.3 Генетический контроль стадии формирования тканей листа 37
1.4.4 Общие сведения о программах развития сложных листьев 38
1.4.4.1 Особенности развития листьев томата 42
1.5. Роль фитогормонов в онтогенезе растений 46
1.5.1 Ауксины 47
1.5.2. Гиббереллипы 48
1.5.3. Цитокинины 49
1.5.4. Этилен 50
1.5.5. Абсцизовая кислота 50
1.6 Механизмы регуляции экспрессии генов развития 51
Глава 2. Материалы и методы исследования 57
2.1 Материал 57
2.2 Методы 57
2.2.1 Выращивание и анализ проявления и наследования формы листа 57
2.2.2 Анализ формирования зародыша 59
2.2.3.Определение эндогенного содержания гормонов 59
2.2.4 Выделение ДНК 60
2.2.5 Подбор и синтез праймеров 61
2.2.6 ПЦР-анализ 61
2.2.7 Секвенирование продукта ПЦР 62
2.2.8 Статистический анализ полученных результатов 62
2.2.9 Документация изображений 62
Глава 3. Результаты исследования и обсуждение 63
3.1 Особенности проявления мутации Lanceolata 63
3.2 Секвенирование фрагмента гена Lanceolata 70
3.3 Взаимодействие гена Lanceolata с генами entire, potato leaf я Mouse ears, влияющими на степень рассеченности листа 72
3.3.1. Наследование типа листа в комбинации Мо 319 (мутация La) х LA 0784 (мутация е) 72
3.3.2. Наследование типа листа в комбинации скрещивания образец Мо 319 (мутация La) х LA 1786 (мутация с) 74
3.3.3. Наследование типа листа в комбинации скрещивания Мо 319 (мутация La) х LA 0715 (мутация Me) 76
3.4 Изучение эндогенного содержания гормонов в листьях томата различного типа рассеченности 82
Выводы 89
Список публикаций по теме диссертации 90
Список использованной литературы 91
Приложения 106
- Деятельность побеговых апикальных меристем и развитие листа
- Механизмы регуляции экспрессии генов развития
- Наследование типа листа в комбинации скрещивания Мо 319 (мутация La) х LA 0715 (мутация Me)
- Изучение эндогенного содержания гормонов в листьях томата различного типа рассеченности
Введение к работе
Актуальность исследования. Формирование листа у растений - один из важных процессов, является основополагающим в жизнедеятельности растения и определении его продуктивности. Понимание генетического контроля формирования листа имеет большое значение для программированного создания растений с заданными признаками.
Томат обладает широкой изменчивостью листа, представленного множеством вариантов размера и степени рассеченности. Это делает его уникальным модельным объектом для изучения морфогенеза листа, и прежде всего для исследования проблемы формирования листьев разной степени рассеченности.
Одним из основных генов, участвующих в морфогенезе листа, является ген Lanceolata. В гетерозиготном состоянии он отвечает за формирование простого нерассеченного листа. Несмотря на известные структуру и функции исследуемого гена, остается неясным как этот ген взаимодействует с другими генами, определяющими разную степень рассеченности листа.
Другим важным аспектом формирования листа является его гормональная регуляция. Изучение взаимосвязи между гормональным статусом растения и степенью рассеченности листа дает более полное представление о механизмах формирования листа. Исследование проявления и взаимодействия гена Lanceolata с другими генами имеет важное фундаментальное значение, связанное с пониманием генетических механизмов формирования признаков и их проявления в онтогенезе. Цель и задачи исследования. Целью данного исследования являлось изучение роли гена Lanceolata в формировании листа томата путем выявления особенностей его взаимодействия с генами, определяющими рассеченный и нерассеченный лист, и выявления связи гормонального статуса растений с разной степенью рассеченности листа.
В задачи исследования входило:
-
Морфологический анализ мутантных по гену Lanceolata растений;
-
Выявление взаимосвязи молекулярной организации аллелей гена Lanceolata с морфологическим проявлением признака;
-
Генетический анализ наследования признака ланцетный лист;
-
Изучение взаимодействия гена Lanceolata с генами, детерминирующими формирование слаборассеченного листа;
-
Изучение взаимодействия гена Lanceolata с геном Mouse ears, определяющим сильную рассеченность листа;
6. Анализ связи между содержанием эндогенных гормонов (ИУК, АБК,
цитокининов, гиббереллинов) и степенью рассеченности листа у растений
томата.
Научная новизна. Установлено, что изучаемый ген Lanceolata, определяющий формирование на растении нерассеченного цельнокрайнего листа, в гомозиготном состоянии имеет плейотропный эффект, влияя в эмбриогенезе на закладку побеговых апикальных меристем. Это проявляется в морфологических аномалиях, вызванных гомозиготным состоянием изучаемого гена, и проявляемых в отсутствии семядолей и побеговой апикальной меристемы; срастании семядолей и/или изменении структуры листа и побега. Гомозиготное состояние подтверждено молекулярно-генетическим анализом изучаемого локуса. Установлены типы взаимодействий гена Lanceolata с другими генами, контролирующими разную степень рассеченности листа. Впервые установлено, что ген Lanceolata обладает эпистатическим действием по отношению к генам entire и potato leaf, отвечающим за слабую рассеченность листа. Впервые показано, что у гибридов Fj в комбинации скрещивания растений с ланцетным (ген Lanceolata) и сильнорассеченным (ген Mouse ears) типами листа формирование листовой пластинки обусловлено влиянием обоих генов, эффекты которых проявляются в различной степени у листьев разных периодов онтогенеза. Установлено, что слабая рассеченность листа обусловлена и особым фитогормональным статусом. Впервые показаны достоверные отличия по содержанию эндогенных гормонов у растений томата со слабой и сильной степенью рассеченности листа на разных этапах формирования листовой пластинки, что тесно связано с этапами образования сегментов листа в процессе морфогенеза.
Апробация результатов работы. Основные положения диссертации были представлены на I (IX) Международной конференции молодых ботаников (Санкт-Петербург, 2006 г.); на Всероссийской выставке научно-технического творчества молодежи (Москва, 2006 г.); Международной конференции «Научное наследие Н.И. Вавилова - фундамент развития отечественного и мирового сельского хозяйства» (Москва, 2007 г.); Международной научной конференции «Регуляция роста и развития растений» (Республика Беларусь, Минск, 2007 г.); Международной научно-практической конференции «Экспериментальный мутагенез в биологии и селекции растений» (Киров, 2008 г.); на XVI съезде EUCARPIA Meeting Working Group Tomato (Wageningen, The Netherlands, 2008 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 1 - в журнале, рекомендованном ВАК.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на страницах,
состоит из введения, обзора литературы, глав «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», выводов и списка литературы, включающего
источников, в том числе из них на иностранном языке. Работа содержит
рисунков, и таблиц.
Деятельность побеговых апикальных меристем и развитие листа
Побеговые апикальные меристемы закладываются в позднем эмбриогенезе и сохраняются в постэмбриональном развитии. Заложение, формирование ПАМ и морфогенез отдельных органов может контролироваться по-разному, то есть за каждый из этих этапов отвечают конкретные гены, либо определенные группы генов контролируют все эти этапы [Лутова Л.А. и др., 2000].
ПАМ - это группа недифференцированных клеток, способных делиться с высокой скоростью. ПАМ инициирует примордии листа в течение всей жизни растения вследствие изменений в активности и направлении деления клеток в этой зоне. Некоторые исследователи обращают внимание также на то, что при закладке листа изменяются состав и свойства клеточных стенок [Лутова Л.А. и др., 2000; Чуб В.В., 2003; Para А., 2004]
Побеговая апикальная меристема имеет общий диаметр около 100 мкм и состоит из 800-1200 клеток. Меристема включает три зоны (центральную, периферическую и подстилающую), каждая из которых имеет свои цитологические характеристики. Центральная зона, расположенная на дистальном конце состоит из клеток с выпуклыми ядрами. Эти клетки делятся с невысокой скоростью. Периферическая зона окружает центральную зону, формируя наружную трубку. Здесь скорость делений клеток очень высокая и именно из нее формируются вегетативные органы растения. Она также отвечает за движение стебля вверх. Третья — подстилающая или РИБ-зона находится на границе дифференцированных и недифференцированных клеток. В ней также отмечается высокая скорость деления. Из этой зоны формируется стебель растения, и она также принимает участие в росте стебля вверх [Telfer A. et al., 1994; Kerstetter R., Hake S., 1997; Sinha N., 1999; Tardieu R, 2000; Frank M. et al, 2002].
Каждая зона состоит из трех слоев клеток. В Лі-слое происходит антиклинальное деление клеток (т.е. деление направлено параллельно поверхности), что обеспечивает рост тканей в длину. В Л2-слое также происходит антиклинальное деление. Слои Лі и Л2 формируют тунику, которая в дальнейшем ста новится основой для образования эпидермиса и мезофилла. Клетки в Л3-слое делятся как антиклинально, так и периклинально. Слой Лз дает начало основным и проводящим тканям листа. Периклинальные деления обеспечивают рост тканей в ширину. Показано, что оба направления деления клеток контролируются независимо друг от друга [Лутова Л.А. и др., 2000, Para А., 2004].
Абсолютно логично, что количество клеток образованных в разных направлениях и определяет в дальнейшем размер и форму органа. Хотя, как будет показано далее, у листьев существуют и другие механизмы управления размером и формой, не связанные с клеточным делением.
Вторичные меристемы образуются в пазухе после инициации каждого листа. Из них могут образовываться боковые побеги. Кроме того, вторичными являются также флоральные или цветочные апикальные меристемы, из которых образуется соцветие.
К дополнительным меристемам относятся пазушные, вставочные и краевые. Они играют определенную роль в органогенезе, но затем переходят в состояние покоя. Но они сохраняют свою способность к делению, и могут стать апикальными (активироваться), если это необходимо при регенерации или в процессе вегетативного размножения [Гилберт С, 1994; Goliber Т. et. al., 1998; Андреева И.И., Родман Л.С., 1999].
Некоторые обычные клетки в особых условиях могут стать меристема-тическими. Эти меристемы становятся новыми очагами деления и роста. С этой точки зрения, клетки растения являются тотипотентными, т.е. способными сформировать весь организм.
Далее рассмотрим порядок развития листа. Самыми первыми листовыми органами являются семядоли, которые закладываются еще в эмбриогенезе. Все прочие органы образуются из листовых примордиев. Заложение листьев происходит через определенные промежутки времени, называемых пластохронами. Листья образуются в периферической зоне апикальной меристемы стебля в виде небольших бугорков. Далее начинается активное деление клеток примордия. При этом клетки вначале делятся равномерно во всех направлениях, но затем деление на верхушке происходит несколько интенсивнее. В результате примор-дий постепенно вытягивается, образуя жилку и черешок [Рейвн П. и др., 1990; Freeling М., 1992; Гилберт С, 1994; Лутова Л.А. и др., 2000].
По достижении определенной длины зачатка (обычно около 1 мм, но может варьировать) клетки верхушки перестают делиться. Дальнейшее развитие листа происходит за счет вставочных или краевых (еще называемых маргинальными) меристем. Маргинальная меристема образуется вдоль основной жилки листа. Именно из нее формируется основная часть листовой пластинки, а также все жилки листа, кроме главной [Лутова Л.А. и др., 2000].
У сложных листьев вдоль центральной оси, которая в дальнейшем станет рахисом, образуются бугорки за счет прекращения деления в разное время клеток маргинальной меристемы. Из этих бугорков будут образовываться дольки и долечки листа [Рейвн П. и др., 1990; Гилберт С, 1994; Sinha N., 1999; Лутова Л.А. и др., 2000; Билич Г.Л., Крыжановский В. А., 2002].
Размер листьев может в тысячу раз превышать размер зачатка, однако у большинства растений его размер ограничен изначально, т.е. неограниченный рост отсутствует. Исключение составляют отдельные папоротники (вельвичия, вайя), у которых даже во взрослом состоянии листьев наблюдается верхушечный рост. Кроме того, неограниченным ростом обладают листья специфических мутантов, у которых повреждена система регуляции активности меристем [Bohmert К. et al., 1998; Билич Г.Л., Крыжановский В. А., 2002].
На расположение листьев оказывает влияние не только состояние ПАМ (и, следовательно, все регуляторные системы апикальных меристем), но и биохимические ограничения на каждой из стадий развития листа [Deschamp Р., Cooke Т., 1983, 1985; Fleming A. et al., 1997, 1999].
С точки зрения регуляции удобно выделить три основные стадии развития листа: органогенез (на этой стадии происходит инициация листа, и на боковой ПАМ уже можно увидеть будущее месторасположение листа), проявление морфологических особенностей листа и дифференциация тканей листа (гисто-генезис) [Eames А., 1961; Holtan Н., Hake S., 2003]. Показано также [Чуб В.В., 2003], что клетки разных слоев способны обмениваться высокомолекулярными соединениями (белками транскрипционных факторов и их РНК). Транспорт этих молекул может быть еще одной возможностью для регуляции ростовых процессов.
Билич Г.Л. и Крыжановский В.А. [2002] предложили три онтогенетических типа листа. Ювенильные листья появляются сразу после прорастания. Они обычно простые, и невелики по размеру, однако крупнее семядолей. Они содержат трихомы. По сравнению со взрослыми листьями у них изменено жилкование, а в клетках не встречаются запасные белки. Переходные листья образуются после ювенильных. Они очень похожи на взрослые, однако меньше их по размеру и зачастую имеют меньшую степень рассеченности. Взрослые листья, наблюдаемые у взрослых растений, характеризуются максимальным размером и наибольшей степенью рассеченности. В них также наибольшее количество жилок и трихом. Очень важно, что переход между указанными стадиями листьев генетически обусловлен.
Отдельно следует уточнить некоторые особенности развития листа культурного томата. У этого растения от инициации листа до приобретения типичных формы и размера проходит несколько недель. Фаза инициации включает заложение примордия (Р1 на рисунке 1.4) в периферической зоне ПАМ (ПЗ) и активное деление его клеток. Первые доли начинают закладываться только в пластохроне 3 (РЗ), то есть фаза инициации продолжается около 6 дней. Следующая фаза начинается, когда лист инициирует все доли и долечки и формирует рассеченность, присущую взрослому листу. У культурного томата процесс образования новых структур обычно длится около 10 дней. У других представителей секции Lycopersicon длительность всех фаз развития листа может быть иной.
Механизмы регуляции экспрессии генов развития
Экспрессия тех или иных генов организма может меняться в ходе его развития. Степень экспрессии одного и того же гена может быть различной в разных тканях, органах, в разные фазы развития и т.д. Регуляция осуществляется на всех уровнях - от транскрипционного (например, гетерохроматинизация) до посттрансляционного (посттрансляционные преобразования белка) [Патрушев Л.И., 2000; Лутова Л.А., 2000; Жученко А.А. и др., 2004].
Один из механизмов контроля экспрессии генов растений на уровне трансляции — с помощью микроРНК (миРНК). МиРНК - это примерно 22-нуклеотидные некодирующие РНК, способные влиять на экспрессию генов пу тем ингибирования их трансляции. На сегодняшний день в растениях обнаружено больше, чем 1280 различных миРНК, но только небольшая часть из них точно идентифицирована [Mallory A. et al., 2004, 2008; Zhou Z.S. et al., 2008]. Сначала механизм регуляции генов с помощью миРНК был выявлен у животных, позже путем функциональных исследований миРНК были найдены у растений, причем первые исследования связаны именно с их участием в процессе развития растений. Разные миРНК принимают участие в эмбриональном, вегетативном и флоральном развитии. Большинство миРНК имеют высокую степень комплементарности соответствующим РНК, именно мРНК является объектом воздействия миРНК. Наиболее подробно это взаимодействие изучено на примере генов арабидопсиса Phabidosa {Phb) и Phavolnta (Phv). Эти гены отвечают за формирование абаксиально-адаксиальной полярности листа внутри листового примордия. Доминантные мутации генов вызывают изменение полярности, что приводит к развитию органов с радиальной симметрией. Найдена соответствующая миРНК, имеющая комплементарные сайты генам Phb и Phv. В исследованиях in vitro показано, что увеличение количества миРНК приводит к снижению уровня экспрессии данных генов и, соответственно, к снижению содержания их мРНК. Для гена ARGONA UTE, участвующего у арабидопсиса в развитии стрессовой адаптации, также найдены свои регулирующие миРНК [Mallory A. et al., 2004, 2008; Barbarotto Е., Calin G.A., 2008; Tang G. et al., 2008]. У кукурузы в метаболическую, физиологическую, морфологическую адаптацию корней к неблагоприятным биотическим и абиотическим факторам вовлечены целые семейства миРНК [Zhang Z. et al., 2008].
Этот же механизм регуляции экспрессии характерен и для гена томата Lanceolate.
Доминантная мутация томата Lanceolate, как указывалось ранее, считается доминантной негативной мутацией, поскольку гомозиготные по данному гену растения не способны образовывать семядоли и, следовательно, нормально развиваться. Только жизнеспособные гетерозиготы формируют маленькие листья с цельным краем [Бочарникова Н.И., Козлова В.М., 1992; Kerstetter R., Hake S., 1997].
В исследованиях ОгІ N. с соавторами [2007] отмечено фенотипическое сходство между гомозиготами LaLa и проростками арабидопсиса, экспресси-рующими гены семейства TCP (транскрипционные факторы, участвующие у растений в определении формы отдельных органов), устойчивые к миРНК, связанные с регуляцией клеточного цикла и роста. Выделен один полный гомолог TCP томата. Дальнейшие исследования позволили установить, что на фенотип растения большее влияние оказывает активность миРНК, чем сам белок La. Повышение чувствительности к миРНК приводит к пространственному и/или временному изменению в экспрессии La в большей степени, чем изменение количества тотальной мРНК. У мутантов содержание транскрипта гена La выше по отношению к дикому типу в зоне примордиев Р0 и Р1, то есть на самых ранних стадиях закладки примордия. Оба этих региона имеют перекрывающуюся экспрессию миРНК. У фенотипически нормальных гетерозигот Lata в развивающихся листьях содержание мРНК гена Lanceolate сходно с таковым у растений дикого типа. Таким образом, модель взаимодействия между Lanceolate и миРНК определяет морфологию листа, предполагая изменение активности того или иного компонента внутри конкретного региона ПАМ.
Усиление проявления гена Lanceolate в фенотипе показывает, что ген способствует прекращению роста листа и ранней дифференциации тканей. Это легко проследить с помощью сканирующей электронной микроскопии апексов побегов. У растений дикого типа дифференциация долей в зоне активности краевых меристем происходит не сразу после закладки листа, трихомы начинают появляться только в примордии РЗ. У мутантов по гену La образование трихом активно идет уже в Р2, указывая на начавшуюся дифференциацию тканей [Ori N. et al., 2007].
Moxon S. с соавторами [2008] выявили тканеспецифичную экспрессию некоторых миРНК и их участие в регуляции созревания плодов томата. Для гена арабидопсиса shoot meristemless {strri) установлен несколько иной механизм регуляции экспрессии. Как было описано ранее, shoot meristemless относится к классу генов KNOXI, то есть принимает участие в определении и поддержании судьбы меристемы. Первый этап действия гена stm - начальная нисходящая экспрессия в инициирующемся примордии. Второй этап — это или снижение степени экспрессии в развивающемся простом листе или восстановление экспрессии в рассеченных листьях на более поздних этапах. Uchida N. С с соавторами [2007] в своих исследованиях идентифицировали две консервативные некодирующие последовательности и доказали, что одна из них, названная k-боксом, играет существенную роль в регуляции экспрессии stm гена. К-бокс -консервативная последовательность, встречается у растений и с простыми и сложными листьями. Это доказывает, что регуляция экспрессии через к-бокс может происходить при формировании листьев обоих типов. Возможно, именно k-бокс является точкой воздействия для других факторов, внешне изменяющих экспрессию генов. Следует также обратить внимание на следующий факт. Различия в экспрессии ортологов гена shoot meristemless у арабидопсиса (простой лист) и кардамона (рассеченный лист) объясняются различиями в промоторах гена у этих растений. Важно, что последовательность k-бокса консервативна у обоих этих видов. Таким образом, в развивающихся листьях растений действует k-боксзависимый механизм регуляции экспрессии гена shoot meristemless у арабидопсиса, и эту модель можно применять при изучении экспрессии других генов класса KNOX [Uchida N. et al., 2007]. Регуляторную роль определенных некодирующих регионов в составе гена также выяснили Wu N. с соавторами [1999] в исследованиях на рисе и сорго. Увеличивать или снижать уровень экспрессии генов могут интроны. Это характерно для растений и многих других эукариот. Некоторые интроны содержат энхансер или альтернативный промотор гена, то есть, являясь некодирующими областями, участвуют в формировании того или иного признака растений [Sakamoto Т. et al., 2001; Rose А.В., 2008]. Lashbrook С. с соавторами [1998] в своих исследованиях установили механизм регуляции через рецептор этилена для гена томата NEVER RIPE. Для данного гена были найдены 5 рецепторов семейства ETR, имеющих высокий процент гомологии с рецепторами этилена у арабидопсиса. До конца механизм действия данных рецепторов не выяснен, но установлено, что при отсутствии связывания гормона с рецептором происходит реакция фосфорилирования и запускается каскад реакций физиологического ответа.
Метилирование - одна из важнейших эпигенетических модификаций с функцией активации или репрессии генной экспрессии. Sun Q. и Zhou D. [2008] в своей работе по исследованию гена JMJ706 риса, изменяющего морфологию цветка, доказали, что именно метилирование играет важную роль в изменении экспрессии данного гена на разных этапах развития цветка. Kraft Е. с соавторами [2008] исследовали гены класса ORTHRUS (ORTH), белки которых, как было показано, являются специфическими лигазами. Именно они выступают посредниками в процессе метилирования ДНК генов, контролирующих у арабидопсиса процесс перехода к цветению. В случае сверхэкспрессии ORTH-генов растения начинают раньше цвести.
Важную роль в проявлении того или иного гена играют посттрансляционные преобразования их продуктов. Эти изменения в структуре белков могут быть вызваны внешними или внутренними условиями в клетке. Так, в работе Zhang D., Wang Y. [2002] показано, что фруктоза и глюкоза вызывают посттрансляционные преобразования инвертазы в развивающихся плодах яблони, снижая ее активность. К внешним условиям, способным изменить экспрессию гена, можно отнести трансмембранные потенциалы [Nieves-Cordones М. et al., 2008] и фитогормоны [Argyros R.D., et al., 2008; Liu J. et al., 2008].
Исследования Ando S. с соавторами [2008] показали возможность альтернативной транскрипции генов как одного из механизмов регуляции экспрессии гена. Они установили альтернативную транскрипцию для участка гена нит-рилазы капусты. Альтернативная транскрипция в данном случае оказывает влияние на биосинтез ауксина в растении. Стоит отметить, что сходная последовательность, найденная у арабидопсиса, обладает промоторной активностью. Альтернативный сплайсинг РНК - один из способов регуляции таких процессов в растении как переход к цветению в разных температурных условиях и в зависимости от длины дня. Сейчас это одно из новых направлений исследования в биологии развития [Terzi L.C., Simpson G.G., 2008].
Наследование типа листа в комбинации скрещивания Мо 319 (мутация La) х LA 0715 (мутация Me)
В первом поколении от скрещивания наблюдаются четыре стенотипических класса:
1) растения с листом дикого типа;
2) растения с ланцетным листом;
3) растения с листом типа мышиные уши;
4) растения промежуточного фенотипа, лист которого изначально развивается как ланцетный, а позже у него формируются булавовидные доли.
Полученные результаты говорят о том, что в скрещивания были взяты гетерозиготы как по гену La, так и по гену Me.
Р: Lalameme (ланцетный лист) х/а/я Мете (мышиные уши)
Fi:
MemeLala - растения промежуточного фенотипа;
memeLala - растения без нарушений в развитии с ланцетным листом;
Memelala - растения с листом мышиные уши;
memelala - растения с листом дикого типа.
Новый фенотип, полученный в Fi, указывает на то, что при развитии листа гены Lanceolata и Mouse ears действуют поочередно. Возможно, что сначала Lanceolata (влияет на закладку меристем и семядолей еще на стадии зародыша) начинает формировать крупную центральную долю, а ген Mouse ears включается позднее, образуя булавовидные сегменты листа гибрида Fi (1-2 пары) (рисунок ЗЛО).
Фенотип гибридов Fj предполагает характер взаимодействия генов Lan-ceolata и Mouse ears по типу комплементарности. Следовательно, в F2 следует ожидать проявление одного из расщеплений по фенотипу 9:3:3:1, 9:3:4, 9:6:1.
Описание фенотипических классов, полученных в F2 комбинации Мо 319 xLA 0715:
растения, имеющие различные нарушения развития, описанные в разделе 3.2.1.
растения с типичным ланцетным листом без нарушений в развитии;
растения, имеющие лист как у гибрида F];
листовая пластинка сильнорассеченная типа мышиные уши (различие в проявлении гомо- и гетерозиготы по гену Mouse ears приводит к появлению сильнорассеченной листовой пластинки двух типов);
лист дикого типа.
Соотношение данных фенотипов представлено в таблице 3.8.
Следует отметить, что формирование листа гибридного типа у растений происходило по-разному. Так боковые доли и искривление центральной жилки (признаки действия гена Mouse ears) могли формироваться на более поздних (признаки действия гена Mouse ears) могли формироваться на более поздних стадиях развития растения, а на момент анализа расщепления (стадия 7-8 настоящих листьев) листовая пластинка была представлена одной центральной долей, но более широкой и крупной, чем у типичного ланцетного листа. Фенотип растений F2 представлен в приложении 5.
Таким образом, гены Lanceolata и Mouse ears, определяющие разные типы листа, взаимодействуют по типу комплементарности, осуществляя равный вклад в формирование листовой пластинки гибридного листа. Особенность этого взаимодействия состоит в том, что оба гена могут начинать действовать на разных этапах формирования листа. Этим и объясняется различие гибридных растений по степени искривления центральной жилки, количеству и времени появления дополнительных долей, размеру долей.
Причем, очевидно, что эффект гена La в гомозиготном состоянии значительно снижается в присутствии в генотипе доминантного аллеля Me. Генотипы LaLaMe-, не имеют значительных нарушений в формировании меристем и семядолей, хотя, возможно, их развитие происходит медленнее. О подобном явлении, при котором одни гены способны восстанавливать нормальное развитие мутантных по другому гену растений, упоминается в исследованиях Куземен-ского А.В. [2002].
Для дальнейшей проверки гипотезы о дигенном наследовании формы листа гибрида La/Me было проведено самоопыление растений F2 с типичным ланцетным, гибридным и сильнорассеченным листом. Результаты самоопыления отдельно по каждому типу листа приведены в таблице 3.10.
Все отобранные для самоопыления растения с гибридным типом листа давали расщепление на пять фенотипических классов, поэтому в таблице представлена объединенная выборка по всем растениям.
Анализируя генотипы, представленные на рисунке 3.11, получаем, что пять фенотипических классов при самоопылении мог дать только один генотип из четырех, представленных в таблице, - дигетерозигота LalaMeme, то есть растения генотипов LaLaMeMe, LaLaMeme, LalaMeMe для самоопыления не были отобраны из популяции F2. Потеря генотипов LaLaMeMe, LaLaMeme, возможно, объясняется тем, что отрицательный эффект гена Lanceolata в гомозиготном состоянии снижается при наличии в генотипе доминантного Mouse ears не в полной мере, растения указанных генотипов могли иметь замедленное разви тие, что обусловило отсутствие их в выборке F2 для самоопыления. Генотип LalaMeMe, по-видимому, не участвовал в самоопылении в силу малого объема выборки из популяции F2.
Растения с ланцетным листом, полученные в F2, согласно рисунку 3.11, имеют генотип Lalameme. При самоопылении возможны следующие генотипы F3
Изучение эндогенного содержания гормонов в листьях томата различного типа рассеченности
В результате исследования было выяснено, что содержание в листьях ауксинов и абсцизовой кислоты ниже порога чувствительности прибора. Низкое содержание АБК может быть объяснено тем фактом, что на растении для исследования отбирали молодые и функционально активные листья. Содержание ауксина не удалось определить, возможно, из-за малого объема имеющегося растительного материала. Содержанием в листьях сухого вещества достаточно мало, поэтому необходимо иметь большее количество растений для отбора проб.
Результаты определения гиббереллинов и цитокининов приведены в таблице 3.13.
Листья, отобранные для анализа, представлены в приложении 6, 7, 8. По результатам определения был проведен дисперсионный анализ, результаты которого приведены в таблицах 3. 14 и 3.15.
Результаты дисперсионного анализа (таблицы 3.13 - 3.15) свидетельствуют о наличии достоверных различий по содержания цитокининов и гиббе-реллинов между формами с разными типами листьев и между листьями разных ярусов у одной формы.
Различия содержания эндогенных ГА и ЦК представлены на рисунках 3.12и3.13.
Рисунки 3.12 и 3.13 свидетельствуют, что и растения как с менее рассеченным, так и с более рассеченным по отношению к дикому типу листом имеют отличную от контроля динамику изменения эндогенного содержания цитокининов и гиббереллинов. Это указывает на то, что в мутантных растениях реализуется несколько иная программа формирования листовой пластинки.
Проанализируем содержание гиббереллинов. Сравнение мутаций La — с нерассеченным листом, и Me — с сильнорассеченным листом свидетельствует о разном гормональном статусе этих генотипов. Для мутации Mouse ears характерно высокое содержание гиббереллинов, для мутации Lanceolata наоборот — пониженное. В среднем и верхнем ярусах у растений с нерассеченным листом содержание гиббереллинов значительно возрастает, что вполне закономерно, т.к. продолжается равномерный рост клеток и формирование характерной ланцетной формы листа. У сильнорассеченного листа в среднем ярусе происходит некоторое снижение уровня гиббереллинов, поскольку идет формирование сегментов, а возрастание содержание гормона на более поздних этапах развития можно объяснить продолжающимся активным ростом зрелого листа. Динамика содержания гиббереллинов в листьях гибридных растений в целом отлична от таковой у форм La и Me. Возрастание содержание этого гормона в среднем ярусе может быть связано с образованием центральной крупной доли листа и образованием сегментов на более поздних этапах.
Начальное содержание цитокининов в Za-листе выше, чем у гибридного и сильнорассеченного листа, но снижение их содержания происходит в большей степени, чем у гибридного, что опять же связано с неразвитием боковых долей. Тогда как у гибридного листа в среднем ярусе содержание цитокининов остается на достаточно высоком уровне, что предполагает возможность образования сегментов. Для сильнорассеченных листьев характерно некоторое повышение уровня цитокининов в нижней части растения. В данном случае образование сегментов листа происходит с самых ранних этапов органогенеза и до конца развития. Таким образом, связь гормонального статуса листа и степени его рассе-ченности очевидна.
Соответственно, можно изменять форму листа, а именно, форму и число сегментов, путем экзогенных обработок.
Проведенные ранее исследования Ахмед М. [2002] показали возможность воздействия на форму листа путем экзогенных обработок. Так при обработке гиббереллином растений с сильнорассеченным листом типа мышиные уши, число сегментов листа увеличивалось, и изменялась форма каждого из них. Обработка цитокининами также увеличивала количество долей у сильно-рассеченных листьев. На слаборассеченных листьях изменения, вызванные экзогенной обработкой, менее выражены.
