Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1. Происхождение и классификация форм томата культурного Lycopersicon esculentum 8
1.1.1. Происхождение и классификация томата 8
1.1.2. Морфологические особенности томата 9
1.1.3. Томат как модельный объект в научных исследованиях.. 14
1.2. Некоторые аспекты биологии развития листа высших растений 17
1.2.1. Особенности строения растения и способы регуляции его развития 17
1.2.2. Строение побега и побеговых апикальных меристем растения 20
1.2.3. Морфология листа высших растений 23
1.2.4. Этапы развития листа 25
1.2.5. Действие фиторегуляторов на формирование и развитие листа у томата 27
1.2.5.1. Ауксины 29
1.2.5.2. Цитокинины 32
1.2.5.3. Гиббереллины 34
1.2.5.4. Абсцизовая кислота 37
1.2.5.5. Этилен 39
1.2.5.6. Брассиностероиды 40
1.2.5.7. Фузикокцин 40
1.3. Влияние отдельных генов на морфогенез листа томата... 40
1.3.1. Методы исследования развития листа 40
1.3.2. KNOX- гены. Их строение и регуляция 41
1.3.3. Влияние мутации clausa на экспрессию гомеобокс-гена LeT6 у томата 43
1.3.4. Различные гены, влияющие на рассеченность листа томата 49
1.3.5. Действие Кп 1 на форму листа томата и взаимодействие его с другими 54
Глава 2. Материалы и методы исследования 58
2.1. Материал 58
2.2. Методы 58
Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение 63
3.1. Взаимодействие генов, контролирующих различные типы листа у томата 63
3.1.1. Наследование типа листа в гибридной комбинации Мо 755 xLA 0715 63
3.1.2. Наследование типа листа в гибридной комбинации Мо755хМо319 65
3.1.3. Наследование типа листа в комбинации скрещивания Мо755хМо556 66
3.1.4. Наследование типа листа в гибридной комбинации Мо 755 xLA 0784 67
3.2. Генетический контроль слаборассеченного типа листа у формы Мо 755 68
3.2.1. Наследование маркерных признаков в комбинации Мо 755 х Moneymaker 68
3.2.2. Генетическое картирование признака «слаборассеченный лист» формы Мо 755 69
3.2.2.1. Генетический анализ сцепленного наследования признаков в картирование признака комбинации Мо Moneymaker 69
3.3. Влияние фиторегуляторов на формирование листа 87
3.3.1. Длиналиста 87
3.3.2. Площадь листа 91
3.3.3. Рассеченность листа - число долей, общее число сегментов листа 95
3.3.4. Морфология листа 99
Выводы 107
Список литературы
- Происхождение и классификация форм томата культурного Lycopersicon esculentum
- Материал
- Взаимодействие генов, контролирующих различные типы листа у томата
Введение к работе
Актуальность работы. Формирование листа – сложный морфофизиологический процесс реализации программы развития. Этот процесс достаточно полно изучен анатомическими исследованиями. Однако, в отличие от других органов растения (например, цветка) недостаточно изучена генетическая программа развития листа. С использованием методов анализа мутаций, изучения экспрессии генов и создания трансгенных растений показан генетический контроль формирования рассеченных листьев (Goliber et al., 1999; Holtan & Hake, 2003; Tsiantis & Hay, 2003).
Одним из наиболее изученных объектов, отличающихся широким разнообразием листа, является культурный томат, у которого известно 307 мутантных линий с различными модификациями формы и размеров листа (Holtan & Hake, 2003). В то же время в литературе имеются немногочисленные сведения о генетических взаимодействиях генов, определяющих различные мутантные фенотипы листа (Куземенский, 2003, Kim, et al., 2003а, Kim, et al., 2003b, Kim, et al., 2003c, Kessler & Sinha, 2004).
Тип листа формируется путем контроля числа и направления клеточных делений, важное значение в определении которых имеют фитогормоны. Анализ мутантов показал, что взрослые листья являются результатом изменений развития примордий на ранних стадиях формирования листа. Считается, что индукторами инициации листа могут выступать цитокинины или комбинация ауксинов и цитокининов (Лутова и др., 2000) В то же время на томате выявлено, что в формировании листа принимают участие гиббереллины и ауксины, влияющие на рассеченность листа (Sekhar & Sawhney 1991; Avasarala et al., 1996).
Цели и задачи исследования. Целью работы было изучение взаимодействия и проявления генов, контролирующих развитие листа у некоторых мутантных форм томата, в норме и при действии регуляторов роста. В процессе работы предстояло решить следующие задачи:
1. Провести генетический анализ взаимодействия генов, контролирующих формирование нерассеченного, слабо рассеченного и сильно рассеченного листьев по проявлению типа листа в первом и втором поколениях.
2. Выявить характер наследования признака слаборассеченный лист у линии Мо 755.
3. Оценить влияние экзогенных обработок регуляторами роста - ауксин, цитокинин и гиббереллин, на проявление типа листа у мутантных линий томата.
Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые проведена комплексная работа по изучению взаимодействия генов, контролирующих нерассеченный, слаборассеченный и сильнорассеченный типы листа, и оценке их проявления при воздействии экзогенных регуляторов роста.
Впервые описан генетический контроль слаборассеченного типа листа у формы томата Мо755. Показано, что тип листа формы Мо 755 контролируется одним геном, который неаллелен другим генам, отвечающим за слаборассеченный тип листа - tp, е. При скрещивании формы Мо 755 с линиями Мо 556, LA 0784 наблюдается взаимодействие доминантных аллелей генов tp, е и гена, контролирующего тип листа Мо 755, по типу комплементарности. Рецессивный аллель, контролирующий тип листа Мо 755, является эпистатичным по отношению к гомозиготе ее, и гипостатичным по отношению к гомозиготе tptp. Показано сцепленное наследование слаборассеченного листа Мо 755 с признаками карликового роста, желтой точки роста, и отсутствия антоциана, что свидетельствует о локализации гена, отвечающего за данный признак, во второй хромосоме.
Показано, что экзогенная обработка регуляторами роста приводит к изменению морфологии листьев. Наиболее выраженные эффекты для всех типов мутаций отмечены при применении гиббереллина (ГКз), которые проявляются в виде удлинения листьев, уменьшения числа сегментов, исчезновения зазубренности и снижения площади листьев. Обработка цитокининами и ауксинами на мутации LA 0715 («мышиные ушки») вызвала увеличение количества долей, которые имели вытянутую форму и были менее закрученными в сравнении с контролем. Выявленный эффект увеличения количества долей при обработке ауксином и цитокинином свидетельствует об их участии в инициации органов листа в примордии.
Происхождение и классификация форм томата культурного Lycopersicon esculentum
Родина томата - тропические районы Центральной и Южной Америки. Большинство исследователей полагают, что родиной культурного томата являются Галапагосские острова и узкая полоса (около 160 км) вдоль тихоокеанского побережья Южной Америки, захватывающая территории Перу, Эквадора, Чили. По вопросу о родоначальной форме культурного томата мнения исследователей расходятся. Одни исследователи считают родоначальной формой культурного томата L. esculentum var. cerasiforme (вишневидный томат), тогда как другие в качестве таковой рассматривают L. pimpinellifolium (смородиновидный томат) [Брежнев, 1964; Жученко, 1973; Прохоров, 1997].
Томат принадлежит к семейству Пасленовые - Solanaceae. Существует несколько ботанических классификаций томата. По предложенной Д.Д. Брежневым [1964] классификации род Lycopersicon включает три вида, различающихся по морфологическим, биологическим и физиологическим признакам и не скрещивающихся между собой в обычных условиях [Жученко, 1973; Орлова, 1991; Прохоров, 1997; Куземенский, 2003] . К ним относятся:
1) томат перуанский (L. peruvianum Brezh.)
2) томат волосистый (L. hirsutum Humb. et Вепр.)
3) томат обыкновенный (L. esculentum Mill.) Внутри вида L. esculentum Mill, выделены три подвида: - subsp. pimpinellifolium Дикий - имеет две разновидности: смородиновидный и кистевидный.
- subsp. subspontaneum Полукультурный - имеет пять разновидностей: сливовидный, грушевидный, вишневидный, удлиненный и многогнездный.
- subsp. cultum Культурный. В пределах этого подвида выделены три разновидности: обыкновенный, штамбовый и крупнолистный
Обыкновенный - var. vulgare - растения слабо- и среднеоблиственные, стебель полегающий различной длины. Листья непарноперисторассеченные, обычного типа строения, с большим количеством долей, долек и долечек. Плоды красные, желтые и, редко, белые. Разновидность объединяет до 75% мирового сортимента сортов.
Штамбовый - var. validum — растения небольшого и среднего размера, сильно облиствленные. Стебли прямостоячие, слабоветвистые, с укороченными междоузлиями. Листья средней величины, с короткими черешками и близко расположенными темно-зелеными гофрированными долями, с небольшим числом долек и долечек. Плоды красные, розовые и желтые.
Крупнолистный - var. grandiflorum — растения средне- и слабооблиствленные. Стебли полегающие, листья крупные, похожи на листья картофеля, состоят из нескольких цельнокрайних долей и долек. Плоды розовые и красные [Жученко, 1973; Орлова, 1991; Куземенский, 2003].
Материал
Семена томата перед проращиванием обеззараживали перманганатом калия. Для проращивания семена выкладывали в чашки Петри на слой фильтровальной бумаги и помещали в термостат. Каждый день чашки Петри проветривали для доступа кислорода к семенам и контроля за прорастанием семян. Через 3-5 дней после посева проросшие семена высаживали в грунт.
Растения выращивали в теплице кафедры генетики МСХА. Растения исходных форм выращивали в вегетационных сосудах объемом 8 л, растения F, и р2 - в стеллажах.
В течение вегетации проводили полив, подкормку, подвязку, прополку растений и борьбу с болезнями и вредителями в соответствии с общепринятыми рекомендациями [Андреев, 2003; Гавриш, 2003].
Гибридизацию осуществляли методом предварительной кастрации бутонов с опылением их через сутки. Для кастрации отбирали бутоны с зелено-желтыми пыльниками (для предотвращения самоопыления), для получения пыльцы - полностью раскрывшиеся цветки. Удаление пыльников и нанесение пыльцы на рыльце пестика осуществляли пинцетом; кастрированные, опыленные и используемые для получения пыльцы цветки изолировали ватным изолятором. В случае необходимости длительного хранения пыльцы собранные пыльники подсушивали при комнатной температуре в пергаментном пакетике в течение 1-3 суток, а затем хранили в холодильнике при температуре +4С. Опыленные цветки маркировали пергаментными этикетками с указанием комбинации, а данные по проведенным скрещиваниям и уходу за растениями заносили в полевой журнал в соответствии с правилами [Прохоров, 1988].
После образования гибридных плодов ватные изоляторы снимали. При покраснении плодов (после их дозревания) семена из них выделяли в стеклянные бюксы и оставляли в них на 1-2 дня для брожения.
Взаимодействие генов, контролирующих различные типы листа у томата
Данная комбинация скрещивания характеризовалась расщеплением по типу листа в поколении Fj на растения с диким типом листа и типом листа «мышиные ушки». Наследование признаков в потомстве разных фенотипов первого поколения анализировали отдельно.
Во втором поколении растений с сильно рассеченным листом были отмечены 3 фенотипических класса - "мышиные ушки", тип листа формы Мо 755 (здесь и далее тип "755") и "дикий тип" (табл. 11).
Анализ соответствия полученных данных теоретически ожидаемым с различными вариантами взаимодействий показал отсутствие такового. Из этого можно сделать заключение о сцепленном наследовании генов, контролирующих типы листа Me и Мо 755. Анализ частоты кроссинговера извлечением квадратного корня из доли двойного рецессива показал частоту rf= 26,9 сМ (табл. 12).
В то же время анализ расщепления второго поколения растений Fj с диким типом листа показал моногенный характер наследования этого признака (табл. 13).
Таблица 13 Наследование типа листа в F2 поколении гибридной комбинации Мо 755 х LA 0715 (Fj - дикий тип листа)
Анализ наследования типа листа в комбинации скрещивания Мо 755 х LA 0715 показал, что исходная форма являлась гетерозиготной, вследствие чего в первом поколении отмечено расщепление 1:1 по типу листа. Появление во втором поколении в потомстве растений Fj с типом листа «мышиные ушки» трех фенотипических классов - растений с типом листа «мышиные ушки», с типом листа формы Мо 755 и с диким типом листа
свидетельствует о взаимодействии генов, контролирующих тип листа «мышиные ушки» и тип листа формы Мо 755 по типу доминантного эпистаза. При этом данные гены наследуются сцеплено. Моногенный характер наследования типа листа в потомстве растений Fi с диким типом листа подтверждает данное заключение.
