Введение к работе
Изучение геномов микроорганизмов, в частности псевдомонад, касается не только хромосомной ДНК наиболее типичных видовых представителей, но также и разностороннего исследования мобильных генетических элементов, встречающихся у данных бактерий. Плазмиды - наиболее типичные представители мобильных генетических элементов, поскольку они реплицируются отдельно от хромосомы хозяина и встречаются у довольно широкого круга микроорганизмов, занимающих различные экологические ниши (Turner et al., 2002). Многие плазмиды несут важные для клеток-хозяев детерминанты, такие как способность утилизировать устойчивые органические соединения, резистентность к антибиотикам или иным токсичным веществам, факторы патогенное и т.д. (Top et al., 2000). Но при этом некоторые гены, обнаруженные на хромосомах бактерий, могут также находиться и в составе плазмид, следовательно, генетические характеристики плазмид не являются неизменными и исключительными. Кроме того, генетические характеристики плазмид обычно не связаны с нормальными условиями окружающей среды, но чаще -с теми изменениями в окружающей среде, с которыми микроорганизмы могут столкнуться. Катаболические гены, ассоциированные с плазмидами, обычно существуют в самодостаточном виде, например, в виде единого оперона, или в составе транспозона, что дает им возможность экспрессироваться в широком круге бактериальных хозяев.
Плазмиды, по определению - автономные структуры, содержащие собственные системы репликации и стабильного поддержания, делающие их в известной степени независимыми от бактериального хозяина. Для каждой плазмиды характерен свой круг хозяев, в котором выполняются эти условия. Однако бывают ситуации, когда круг хозяев, в который возможен перенос плазмиды, и ее реальный круг хозяев, в котором функционируют системы репликации и поддержания плазмиды, не совпадают. Тогда плазмида, попадая в бактериальную клетку, в которой невозможна ее автономная репликация, способна сохранить свое существование, только интегрировавшись в хозяйскую хромосому, действуя, таким образом, как природный суицидный вектор. Анализ имеющихся на сегодняшний день бактериальных хромосомных последовательностей ДНК показывает, что интеграция и эксцизия плазмид из бактериальной хромосомы - довольно частое событие (Chiu and Thomas, 2004).
Детальный генетический анализ как вновь выделенных, так и уже описанных плазмид предоставит ценные сведения о роли плазмид в адаптации бактерий, о микроэволюции плазмид и их мозаичном строении, о значении рекомбинации,
коинтеграции и инсерции мобильных элементов (интегроны, транспозоны и IS-элементы) в генетическом разнообразии плазмид и их хозяев.
Цель и задачи работы
Целью настоящей работы являлось изучение организации плазмидных рештиконов групп несовместимости Р-7 и Р-9 на примере плазмид биодеградации ПАУ и R-плазмид бактерий рода Pseudomonas.
В соответствии с целью, в работе были поставлены следующие задачи:
Сконструировать минирепликоны плазмид Р-7 и Р-9 групп несовместимости и изучить их структурную организацию;
Провести филогенетические исследования структурных элементов базовых репликонов плазмид Р-7 и Р-9 групп несовместимости (priV, rep- и par-генов);
Исследовать влияние плазмидных транспозонов и IS-элементов на стабильность плазмид и функционирование генов деградации ПАУ;
Изучить встречаемость и распространение IncP-7 и 1псР-9 плазмид в загрязненной и незагрязненной ксенобиотиками почве.
Научная новизна
В ходе работы впервые получены минимальные репликоны плазмид групп несовместимости Р-7 и Р-95, проведен филогенетический анализ структурных элементов базовых репликонов плазмид Р-7 и Р-9 групп несовместимости (priV, rep- и par-генов), показана необходимость участия par-генов в процессах репликации и поддержания 1псР-95 плазмид в клетках Е. coli. Получена информация о «структурном скелете» плазмид биодеградации группы несовместимости Р-9, определены вариабельные участки у плазмид различных подгрупп 1псР-9.
На примере плазмиды NPL-1 и ее производных продемонстрировано влияние совместной экспрессии катаболических и транспозонных генов на структурную стабильность плазмид. Показано, что инверсия 4.2 т.п.н. фрагмента у плазмиды NPL-1 приводит к изменению характера экспрессии катаболических генов с индуцибельного на конститутивный.
Впервые в ходе экзогенной изоляции плазмид при двухродительском скрещивании из образцов почв, загрязненных устойчивыми органическими соединениями, наряду с плазмидами биодеградации были выделены и плазмиды устойчивости к антибиотикам, получившие распространение в почве благодаря неспецифическому загрязнению.
Практическая значимость работы
Полученные данные по структурно-функциональной организации плазмид групп несовместимости Р-7 и Р-9, их распространения, круга хозяев, а также роли в адаптации микроорганизмов к изменяющимся условиям внешней среды могут быть использованы в работах по созданию плазмидных векторов и штаммов микроорганизмов с заранее заданными свойствами, а также для разработки систем мониторинга бактериальных штаммов-деструкторов в ходе процесса биоремедиации загрязненных территорий.
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях: EERO Workshop "Enzymatic and Genetic Aspects of Environmental Biotechnology", Пушино, 1995; II Открытая городская научная конференция молодых ученых города Пущино, 1997; International Symposium on Plasmid Biology, Merida, Mexico, 1998; Pseudomonas Congress, Brussels, Belgium, 2001; 3d symposium on "Mobile genetic elements' contribution to bacterial adaptability and diversity" (MECBAD), Berlin, Germany, 2001; 12th International Biodeterioration&Biodegradation Symposium Prague, Czech Republic, 2002; III Путинская школа-семинар по экологии «Экология 2004: Эстафета поколений», Пущино; "Plasmid Biology 2004" Conference, Corfu, Greece; 13 International Biodegradation&Biodeterioration Symposium, Madrid, Spain, 2005; International Conference on Environmental Biotechnology ISEB ESEB JSEB 2006, Leipzig, Germany; 4 European Bioremediation Conference, Crete, Greece, 2008.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 40 работ, из них 9 статей и 31 материал конференции.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 119 страницах машинописного текста, включает 6 таблиц и 29 рисунков. Библиография включает 185 наименований, из них 15 отечественных и 170 зарубежных работ.
