Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. МОБИЛЬНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ ПРОКАРИОТ 5
I.I. is - элементы 6
І.І1. Транспозоны 9
1.11.1. Транспозон ВД 9
1.11.2. Транспозоны, фланкированные целыми jg - МОДУЛЯМИ 16
I.III. Преобразования генома, индуцированные подвижными элементами 20
І.ІУ. Модели механизма транспозиции 26
ГЛАВА II. МОДЕЛИ С ШИРОКІМ СПЕКТРОМ ХОЗЯЕВ Р ГРУППЫ НЕСОВМЕСТИМОСТИ 29
II.I. Генетическая и физическая организация плазмиды RP4 29
II.II. Генетическая и физическая организация других Шс Р плазмид 46
ГЛАВА III. МЕТОДЫ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ ПРИ ИССЛЕДОВАНИИ
НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ 50
111.1. Методика электронномикроскогшческого анализа нуклеиновых кислот с использованием белковых пленок 50
111.2. Адсорбционная методика электронномикроскопи-ческого анализа нуклеиновых кислот 52
111.3. Измерение контурной длины молекул 53
111.4. Карты частичной денатурации 53
111.5. Гетеродуплексный анализ 54
111.6. Картирование в - петель 55
111.7. Картирование R - петель 56
111.8. Визуализация транскрипции 56
111.9. Белок-нуклеиновые взаимодействия 57
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 59
ГЛАВА ІV. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКИ 59
ІV.І. Бактериальные штаммы и плазмиды, использованные в работе 59
ІV.2. Среды, буферы 59
ІV.3. Конъюгационное скрещивание 59
ІV.4. Тестирование иммуности к колицину EI 60
ІV. 5. Транспозиция тп1 60
ІV.6. Выделение плазмидной ДНК 60
ІV.7. Электрофорез в агарозном геле 61
ІV.8. Обработка плазмидной ДНК рестрикционными эндонуклеазами 61
ІV.9. Fick - трансляция 62
ІV. 10. Перенос ДНК из агарозного геля на фильтры 62
ІV.11. Гибридизация ДНК-ДНК 63
1V.12. Определение молекулярного веса исследуемых плазмид 63
ІV.13. Получение гетеродуплексов 64
ГЛАВА V. ПРИРОДА ДЕЛЕЦИЙ, ВОЗНИКШЦИХ В ГЕНОМЕ ДВУРЕПЛРІКОН-
НОГО ГИБРИДА. PAS8 66
V.1. Гетеродуплексный анализ делеционных мутантов плазмиды RP4 66
V.2. Обсуждение 81
ГЛАВА УІ. ГОМОЛОГИЯ ПЛАЗМИД Р ГРУПШ НЕСОВМЕСТИМОСТИ 90
V.І.1. Доказательство идентичности плазмид RP4 и RK2 90
V.1.2 Сравнительный анализ структурной организации плазмид RP4 , R751 и R906 92
Гибридизационный анализ плазмиды R751 92
Гибридизационный анализ плазмиды RP4 95
Гетеродуплексный анализ плазмид R751HR906 97
Гетеродуплексный анализ плазмид R751HRP4 101
Гетеродуплексный анализ плазмид R906H RR4 103
V.1.З. Локализация районов специфической гомологии между Іис Р плазмидами на картах RP4 , R751 ,и R906 105
ЗАКЛЮЧЕНИЕ. ЗАКОНОМЕРНОСТИ ОРГАНИЗАЦИИ TSO р ПЛАЗМИД С
ШИР0КИГЛ СПЕКТРОМ ХОЗЯЕВ 116
ВЫВОДЫ 121
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 122
- is - элементы
- Генетическая и физическая организация плазмиды RP4
- Методика электронномикроскогшческого анализа нуклеиновых кислот с использованием белковых пленок
- Бактериальные штаммы и плазмиды, использованные в работе
- Гетеродуплексный анализ делеционных мутантов плазмиды RP4
is - элементы
Структурная организация, is -элементы были ОТКРЫТЫ В Е.СОІІ в результате анализа полярных мутаций, вызванных ими. Эти элементы содержат от одного до нескольких, иногда перекрывающихся структурных генов, кодирующих белки транспозиции и ее регуляции. Длина известных IS -элементов колеблется от 700 до 1500 п.о.
Наиболее детально изучена генетическая организация IS5 -элемента, последовательность которого содержит три структурных гена. Элемент IS5 присутствует в клетках Е.ООІІ в количестве 10-12 копий, генетическая структура его представлена на рис.1. Функции всех трех генов элемента одинаково необходимы для транспозиции, но промоторы р5В и р5С имеют разную активность, что может быть следствием различных механизмов, контролирующих экспрессию соответствующих генов. В области между генами ins50 и ins5B находится эффективный терминатор транскрипции. В то же время последовательность ДНК в этой области показывает некоторую симметрию второго порядка, которая тоже может играть роль в тер-минации транскрипции и/или ингибирования трансляции.
Генетическая и физическая организация плазмиды RP4
Кояыогационяый перенос плазмидной ДНК из одной бактериальной клетки в другую детерминирован плазмидными генами, является сложным процессом и специфичен для каждой из групп несовместимости, В механизм конъюгации вовлечены белки "поверхностного исключения", запрещающие клетке выступать в роли реципиента, если донором является плазмида из той же группы несовместимости, и клеточные отростки - пили, являющиеся также рецепторами для адсорбции бактериофагов (Stanisich and Ortiz ,1976; Jacoby ,1977),
Одновременная утрата устойчивости к канамицину (ген kan ), признака поверхностного исключения (ген sex ) и потеря коньюга-тивности свидетельствует о сцепленности или близком расположении этих детерминант (Hedgee et al. ,1976; Shipley and Olsen ,1975). О тесном сцеплении вех - и tra - генов свидетельствуют и данные о генетической организации плазмиды SP1 ( Stanisich and Bennett,-30-1976).
На основании сравнительного анализа инсерционных мутантов HP4 , индуцированных транспозоном Тп7 (Barth ana Gunter ,1977; Barth et al. ,1978), и делеционных мутантов рекомбинантной плаз-миды pAS8 (Степанов и др.,1976; Саканян и др.,1977) была построена генетическая карта НР4 (рис.5) с локализацией tra -генов по обе стороны от гена kan : район tral с координатами 43-48 т.п.о. и район tra2 с координатами 23-27 т.п.о. Третий район, детерминирующий конъюгационные свойства плазмиды ЕР4 - tra3 , был локализован в районе 18,5 т.п.о. (Barth ,1979). Этим же автором показано, что гены поверхностного исключения также разобщены и находятся в районах с координатами 18 т.п.о., 23 т.п.о. и 24 т.п.о.
Конъюгационный перенос ДНК - однонаправленный процесс и начинается он с фиксированной точки origin , обозначаемой для R плазмид ori а? , или г їх . Для Р фактора показано, что в локусе ori т происходит однонитевой разрыв нити ДНК, движущейся в клетку-реципиент в направлении 5 , и что никирующая активность кодируется плазмидными tra -генами.
При изучении структурной и функциональной взаимосвязи огіт и огіу различных плазмид incP группы было предложено подразделить эти плазмиды на Incp - и іпср/з -подгруппы. Разделение было предложено на основании величины гомологии между последовательностями вышеуказанных областей. Авторами доказано также существование в Р плазмидах никирующих релаксационных комплексов ДНК-белок, НеобХОДИМЫХ ДЛЯ КОНЪШГаЦИИ ПЛаЗМИД (УакоЪзоп and Guiney ,1983).
class3 МЕТОДЫ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ ПРИ ИССЛЕДОВАНИИ
НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ class3
Методика электронномикроскогшческого анализа нуклеиновых кислот с использованием белковых пленок
В конце 50-х годов была предложена достаточно простая методика приготовления белковых пленок с растянутыми в них молекулами ДНК (Kleinschmidt and Zahn, ,1959). Несмотря на множество модификаций, появившихся к сегодняшнему дню, принципы метода остались без изменения и основаны они на смешивании нуклеиновых кислот со слабым основным белком. Наилучшие результаты дает использование цитохрома С. Во время опрвдинга (нанесения белка на гипофазу) происходит денатурация цитохрома С и образуется монослой денатурированного белка. Поскольку денатурированный белок неспецифически и кооперативно связывается с нуклеиновыми кислотами, то это приводит к расправлению молекул ДНК в монослое этого белка. Гипо-фазой (поверхностью, на которую наносится смесь белка с нуклеиновыми кислотами) может быть либо дистиллированная вода, либо раствор ацетата аммония, либо же буферный раствор формамида ( Davis et al. ,1971; Kleinschmidt, 1968).
Описанная авторами методика ( Kleinschmidt and Zahn ,1959) нанесения образцов ДНК из раствора ацетата аммония, содержащего цитохром С получила название "водной". Однако наибольшее распространение получил ее модифицированный вариант - "формамидный" ( Westmoreland et al.,I969): гипофазой служит вода, а гиперфаза содержит такие концентрации формамида и солей, при которых дву-спиральные молекулы ДНК остаются стабильными, а случайные взаимодействия между основаниями однонитевых молекул разрушаются. Фор-мамид, кроме того, усиливает контраст однонитевых молекул. Некоторые исследователи (но редко) используют формальдегид ( Bujard , 1970). Наилучший вариант формамидного метода был предложен авторами ( Davis et al.,I97I). Обычно наносимый раствор содержит 40-50$ формамида и должен быть хорошо забуферен (0,1 М Trie HOI ; 0,01 М Na EDEA. , рН 8,5), т.к. формамамид в растворе имеет тенденцию окисляться.
Бактериальные штаммы и плазмиды, использованные в работе
Использовали полноценную питательную среду: ь - бульон, содержащий Bacto -триптон " Difco "-Юг, дрожжевой экстракт " Difco " - 5 г, NaOl - 10 г, НрО - до I л; рН 7,0. Твердую среду готовили добавлением 15 г ангара " Difco ".
Использовали минимальную среду М-9: Na2EP04 - 7 г, КН О -3 г, NaCl - 0,5 г, 1ТН.С1 - I г, MgS04.7H20 - 250 мг (стерилизовали отдельно); н20 - до I л. Глюкозу добавляли до конечной концентрации 0,2%, тиамина - до 0,2 мкг/мл, L -аминокислоты - до 20 мкг/мл. При необходимости на основе этой среды готовили твердые среды добавлением 15 г агара " Difco ".
Использовали TEN -буфер следующего состава: 0,05 М трис- неї 0,005 М ЭДТА їїа2 , 0,03 М ЖаС1; рН 8,0. Буфер для электрофореза содержал 0,04 М трис- НС1, 0,02 М СН3СО(Ша , 0,002 М ЭДТА На2 ; рН 7,7.
class5 ПРИРОДА ДЕЛЕЦИЙ, ВОЗНИКШЦИХ В ГЕНОМЕ ДВУРЕПЛРІКОН-
НОГО ГИБРИДА. PAS8 class5
Гетеродуплексный анализ делеционных мутантов плазмиды RP4
При рассмотрении "горячих" участков на геноме НР4 (рис.14) обращает на себя внимание сайт-специфический характер дєлеций у плазмид pASH , PAS112 , pASl22 и pAS123 , а именно, совпадение начала дєлеций с границей дистального конца транспозона тп1 (отклонение в 100-300 п.о, лежит в пределах ошибки измерения). Сохранение транспозирующей способности этого элемента у мутантов находится в соответствии с литературными данными (Feinstock et al, 1979; етівеп et al. ,1977). Это позволяет со всей определенностью заключить, что делеции индуцированы транспозоном Тп1 , произошли вне его структуры и с сохранением функциональной активности транспозона.
При культивировании бактериальных клеток, несущих плазмиды с резистентностью к антибиотикам, в среде с высокими концентрациями антибиотиков, к которым они устойчивы, часто увеличивается число копий генов резистентности. Увеличение может быть результатом увеличения числа копий плазмид или селективной амплификации только специфических областей, несущих детерминанты резистентности (Peterson and Eownd ,1983). В используемой нами плазмиде RP4 устойчивость к ампициллину определяется последовательностью транспозона Тп1 , Селективное давление способствует увеличению частоты внутримолекулярных транспозиций ЇПІ # Внутримолекулярная транспозиция перемещающегося элемента генерирует копию либо в прямом, либо в инвертированном направлении (Arthur and Sherratt ,1979), Сайт-специфическая рекомбинация, катализируемая резольвазой на гее сайтах прямо повторенных транспозонов приводит к делеции расположенной между ними последовательности ДЕК ( Altentiuchner and Schmitt ,1983). Видно, что этот процесс отличается от дезинтеграции коинтегратов только нежизнеспособностью делетируемой части генома. Рекомбинации эти не зависят от гесА системы клетки-хозяина, поскольку не вовлекают гомологичные последовательности ДНК (Fisen et al. ,1977).
Описанный молекулярный механизм рекомбинационных событии, приводящий к таким геномным перестройкам, не доказан, но к сегодняшнему дню это мнение широко распространено.
Рассматривая карту генома ЕР4 с "горячими" точками, подверженными делециям, мы отметили единичный сайт делеции, приведший к появлению ранее исследованной (Sakanyan et al. ,1978) деле-ционной производной pASIO . Вероятно, что здесь произошло редкое рекомбинационное событие - делеция последовательности ДНК, индуцированная транспозоном с захватом самого транспозона: начальная точка делеции (4,8 т.п.о.) совпадает с проксимальной границей тш.
При исследовании плазмиды РНР761 (EP4::Tn76 ) Barth с соавт. сообщили о спонтанной производной этой плазмиды рНР761-6 и высказали аналогичное предположение, что делеция индуцирована транспозоном и захватила при этом сам транспозон (Barth et al. , 1984).
