Введение к работе
Актуальность проблемы. Холера продолжает оставаться одной из наиболее социально значимых инфекций. Ежегодно во Всемирную организацию здравоохранения поступают сведения о более, чем 100.000 больных холерой. Заболеваемость регистрируется во многих странах мира, расположенных на территориях практически всех континентов, в том числе и в России [Онищенко Г.Г., 2002; 2004; Weekly epidemiological record, 2002; 2003].
До недавнего времени все эпидемии холеры вызывались вирулентными вибрионами серогруппы 01, в то время как вибрионы других серогрупп были причиной лишь локальных вспышек холероподобных инфекций. В 1992 г. в Южной Индии впервые были зарегистрированы эпидемии холеры, обусловленные холерным вибрионом ранее неизвестной 0139 серогруппы. Они продолжались в 1992-1993 гг., в течение которых V.cholerae 0139 (синоним Бенгал) распространился на территорию Бангладеш и других азиатских стран таких, как Пакистан, Непал, Китай, Таиланд, Афганистан, Малазия, а также был вынесен на территорию других континентов [Albert М. J., etal, 1993; Nair G. В. etal, 1995, Faruque S.M. et al, 1998]. Завозные случаи были зарегистрированы в России и в других странах СНГ, а также в США. В настоящее время по данным ВОЗ V.cholerae 0139 является причиной 17% случаев холеры, регистрируемых в мире [Москвитина ЭА с соавт., 2003; Sinha S. etal, 2003].
Появление нового возбудителя холеры, его высокая вирулентность (высокий процент летальности среди заболевших), мощный эпидемический потенциал, обусловивший вынос инфекции на территорию различных континентов, а также значительная вариабельность структуры генома V.cholerae 0139 привлекли к нему внимание исследователей во всем мире, поскольку все эти свойства могли свидетельствовать о происходящем в природе процессе образования нового патогенного клона V.cholerae, способного вызвать новую пандемию холеры.
Однако, несмотря на всеобщий интерес к V.cholerae 0139 и уже более чем десятилетний опыт его изучения, до сих пор остается неясным, обладает ли V.cholerae 0139 «пандемическими» свойствами и представляет ли он реальную угрозу для человечества как этиологический агент будущей восьмой пандемии холеры. Происхождение «нового» возбудителя холеры до сих пор не установлено. Не выяснены мо-
*ОС НАЦИОНАЛ І.НЛЧ.
НАЦИОНАЛІ.НЛЧ
ІИМИОТЕКЛ f
лекулярно-генетические механизмы, которые привели к появлению V. cholerae 0139. Предполагается, что это событие произошло благодаря переносу генетической информации от неизвестного донора в штамм биовара эльтор серогруппы 01, который, вероятно, был осуществлен с помощью бактериофага или конъюгативной плазмиды [Johnson J.A. et al, 1994; Mooi R.K.. Bic E.M.. 1997; Faruque S.M. et al, 2003]. Структурно-функциональные особенности генома возбудителя холеры серогруппы 0139 исследованы далеко недостаточно. Не установлены причины высокой вариабельности различных областей хромосомы V.cholerae 0139, связанных с вирулентностью. Не изучена структура хромосомной области, содержащей гены биосинтеза нового поверхностного антигена — полисахаридной капсулы, который отсутствует у возбудителя 01 серогруппы.
Остается невыясненным участие в изменчивости вирулентных и антигенных свойств патогенных вибрионов 0139 серогруппы мобильных генетических элементов, в том числе и умеренного холерного бактериофага, впервые обнаруженного в штаммах V.cholerae 0139. Исследование изменений, происходящих в геноме возбудителя холеры 0139 серогруппы, может пролить свет на пути образования новых патогенных штаммов V.cholerae с измененными свойствами.
Практически не изучены молекулярно-генетические особенности штаммов 0139 серогруппы, выделенных на территории России и стран СНГ, так же как не описаны свойства других вирулентных штаммов 0139 серогруппы, выделенных при локальных вспышках, зарегистрированных за пределами эндемичных очагов холеры.
Большую проблему для эпидемиологов представляют атоксигенные вибрионы 0139 серогруппы, которые выделяются из воды поверхностных водоемов на территории Российской Федерации. В 1996-2002 гг. такие штаммы были выделены в Новосибирской, Московской, Ростовской областях и в Калмыкии [Ганин В. С. с соавт., 1997; Ломов Ю. М., с соавт., 2000; Кюрегян А. А. с соавт., 2002; Безсмертный В.Е. с соавт., 2003]. Практически не изучены их фенотипические свойства и структура генома, отсутствуют сведения об их происхождении, генетической связи с вирулентными штаммами и эпидемической значимостью. Для установления эволюционной связи между вирулентными и «водными» вибрионами необходимо провести молекулярное типирование штаммов 0139 серогруппы, полученных из различных ис-
5 точников. Вместе с тем отсутствуют эффективные системы молекулярного типиро-вания, представленные комплексом методов, использование которых позволит не только провести дифференциацию штаммов Vcholerae 0139, но и повысить эффективность проводимого эпидемиологического мониторинга штаммов холерных вибрионов, вьщеляемых из объектов окружающей среды. Не разработана стандартная систематическая номенклатура молекулярных подтипов, в соответствие с которой могут быть классифицированы вновь выделяемые изоляты. Отсутствуют базы данных с генетическими характеристиками ранее выделенных на территории Российской Федерации штаммов V.cholerae 0139.
Появление V.cholerae 0139 потребовало создания специфических профилактических средств против нового возбудителя холеры, а также средств его диагностики. В настоящее время отсутствуют эффективные вакцины против V.cholerae 0139, а также штаммы-продуценты с высоким уровнем биосинтеза ключевых фак-, торов вирулентности и иммуногенности, которые могут послужить основой для создания живых вакцин против возбудителя холеры 0139 серогруппы и найти применение в производстве химических холерных вакцин и диагностических тест-систем.
Все это диктует необходимость проведения разносторонних и глубоких исследований структуры и функции генома вирулентных и «водных» штаммов холерных вибрионов 0139 серогруппы, генетического контроля регуляции экспрессии генов вирулентности, создания эффективной системы молекулярного типирования вибрионов и разработки средств профилактики и диагностики V.cholerae 0139.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ Молекулярно — генетический и фенотипический анализ штаммов V.cholerae 0139, имеющих различную эпидемическую значимость, и выявление новых механизмов образования штаммов возбудителя холеры с измененной экспрессией генов вирулентности.
1. Провести сравнительный анализ продукции факторов вирулентности и иммуногенности, а также устойчивости к антибиотикам у штаммов V.cholerae 0139, выделенных от больных и из водных экосистем на территории Российской Федерации и стран СНГ.
Получить новые данные о генетической организации штаммов V.cholerae 0139 различного происхождения и установить связь выявленных свойств с их вирулентностью.
Провести генетическое картирование гена cap, контролирующего биосинтез нового поверхностного антигена — полисахаридной капсулы, определить его локализацию относительно других генов вирулентности и выяснить значение этого локуса для реализации патогенности возбудителя холеры 0139 серогруппы.
Определить роль профага 139 в изменчивости вирулентных и антигенных свойств возбудителя холеры 0139 и 01 серогруппы.
Изучить возможность обмена генетической информацией между V.cholerae 01 и 0139 серогрупп и образования патогенных штаммов с новыми свойствами.
На основе ПЦР - и риботипирования установить происхождение и эпидемическую значимость V.cholerae 0139, циркулирующих в открытых водоемах Российской Федерации.
Получены приоритетные данные об особенностях структуры генома штаммов V.cholerae 0139, выделенных от больных и из объектов окружающей среды на территории Российской Федерации и стран СНГ. Впервые на основе комплексного методического подхода с использованием анализа полиморфизма длин рестрикцион-ных фрагментов и ПЦР - анализа различных ключевых генов вирулентности и жизнеобеспечения установлены принципиальные отличия в структурно-функциональной организации геномов возбудителя холеры 0139 серогруппы и холерных вибрионов, выделенных из водных экосистем на территории России и стран СНГ. Показано, что вирулентность возбудителя холеры 0139 серогруппы связана с присутствием в его геноме мобильных генетических элементов, содержащих гены патогенности, - двух профагов СТХ (ctx A, zot, асе) и RSI (rstC), острова патогенности VPI (tcpA, toxT), а также сайта для внедрения фагов в хромосому - нуклеотид-ной последовательности attRS.
Впервые установлено, что в геноме вибрионов 0139 серогруппы, выделенных из воды, отсутствуют гены не только холерного токсина ctxAB, но и гены дополнительных холерных токсинов zot и асе, локализованные на фаге СТХф, а также последовательность другого фага RS1 ф, гены tcpA, toxT, входящие в состав острова па-
7 тогенности VPI, и последовательность attRS. Из этого следует, что авирулентность «водных» вибрионов 0139 серогруппы связана с отсутствием основных генов вирулентности, расположенных на мигрирующих генетических элементах (МГЭ). Впервые выявлено, что в составе хромосомы авирулентных штаммов присутствует ген порообразующего токсина rtxA, гены toxR и hap А, которые также обнаружены и у вирулентных штаммов, что указывает на их участие в процессах жизнедеятельности клетки.
Впервые показано, что гены токсинообразования ctxAB могут быть переданы в авирулентные холерные вибрионы 0139 серогруппы в составе рекомбинантных плазмид и эффективно экспрессироваться в них с образованием секретируемого и биологически активного холерного токсина, но эти вибрионы остаются авирулент-ными из-за отсутствия у них других ключевых генов вирулентности.
Впервые обнаружено, что штаммы возбудителя холеры 0139 серогруппы, выделенные в России, характеризуются вариабельностью участка ДНК, связанного с продукцией холерного токсина. Изменчивость этого района подтверждается присутствием в нем различного количества копий профагов вирулентности СТХ и RS1, прилегающих к хромосомным участкам с различной организацией.
Впервые изучена структура участка хромосомы, ответственного за биосинтез нового поверхностного антигена возбудителя холеры V.cholerae 0139. Установлено, что вблизи гена cap, кодирующего биосинтез полисахаридной капсулы, располагается геном профага 139, а также гены mot и msh, определяющие подвижность и продукцию маннозочувствительных гемагглютинирующих пилей адгезии, что указывает на большое значение этой области в вирулентности и персистенции вибрионов 0139 серогруппы. Выявлено, что профаг 139 индуцирует хромосомные перестройки в близлежащих к нему генах вирулентности и, таким образом, играет важную роль в изменении признаков вирулентности и антигенности у возбудителя холеры V.cholerae0l39.
Впервые установлено, что фаг 139 оказывает влияние на продукцию основного фактора вирулентности - холерного токсина у штаммов возбудителя холеры Ol серогруппы классического и эльтор биоваров. Его интеграция в геном V.cholerae Ol приводит к изменению активности глобального регуляторного гена toxR и структурной организации участка хромосомы, содержащего гены токсинообразования. Вы-
явленный новый механизм регуляции генной активности у возбудителя холеры 01 серогруппы использован для создания принципиально нового способа получения штаммов возбудителя холеры с измененной продукцией холерного токсина.
Впервые на основе разработанной системы молекулярного типирования проведено комплексное генотипирование штаммов 0139 серогруппы, полученных от больных и из воды поверхностных водоемов. С помощью метода риботипирования показано, что вирулентные штаммы, выделенные в 1993 г. в Ростовской области относятся к новому риботипу, отсутствующему в международной классификации и обозначенному как R-I. На основе ПЦР — и риботипирования показано отсутствие близких эволюционных связей между клиническими и «водными» вибрионами, выделяемыми из воды в различных областях Российской Федерации.
Создана эффективная система молекулярного типирования штаммов V. cholerae 0139 и 01, основанная на сочетании модифицированного метода риботипирования и ПЦР-типирования со случайными праймерами, использование которой позволит повысить эффективность проводимого эпидемиологического мониторинга штаммов холерных вибрионов, выделяемых из объектов окружающей среды. В результате ее применения установлено, что штаммы 0139 серогруппы, циркулирующие в настоящее время в открытых водоемах на территории различных областей Российской Федерации, эпидемически безопасны, и в случае их выделения не требуется проведения комплекса защитных мер, применяемых при обнаружении вирулентных штаммов V.cholerae.
На основании разработанных приемов составлены и утверждены Ученым Советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол Ученого Совета РосНИПЧИ «Микроб» №9 от 18.12.2003 г) методические рекомендации «Риботипирование штаммов Vibrio cholerae» и «Получение штаммов Vibrio cholerae с измененной продукцией холерного токсина с помощью умеренного бактериофага 139».
Материалы исследований вошли в методические указания «Основные требования к вакцинным штаммам холерного вибриона» по федеральному уровню внедрения, которые одобрены Ученым советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол Ученого Совета РосНИПЧИ «Микроб» № 4 от 13.04.2004 г.) и Ученым Советом Ростов-
ского научно-исследовательского противочумного института (протокол №2 оті8. 02. 2004 г.).
В Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб" (Саратов) депонирована коллекция из 18 генетически модифицированных штаммов V.cholerae 01 и 0139 с измененным биосинтезом факторов вирулентности, иммуногенности и жизнеобеспечения, которая является основой для проведения микробиологического, биохимического и генетического изучения роли этих факторов в патогенезе и иммуногенезе холеры. Входящие в состав этой коллекции штаммы 01 и 0139 серогрупп с высоким уровнем продукции таких протективных антигенов, как В-субъединица XT, 0139 антиген и капсула, белки внешней мембраны рекомендуются для производства живых и химических холерных вакцин, а также средств диагностики холеры.
Получен патент на изобретение штамма бактерий КМ 195 — продуцента холерного токсина II типа и способ получения штаммов (патент на изобретение №2172776 выдан 27 августа 2001 г. Приоритет от 17.07.2000 г.). Штамм V.cholerae КМ 195 с гиперпродукцией XT, характерного для холерных вибрионов биовара эльтор, предназначен для использования его при производстве холерных химических вакцин. Получено положительное решение о выдаче патента на изобретение штамма бактерий V.cholerae КМ 168 — основы для конструирования живых вакцин против диарей-ных заболеваний, вызываемых патогенными штаммами V.cholerae 0139 по заявке № 2003 131 557/13, дата приоритета 27.10. 2003 .
