Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 7
1.1.Использование культуры клеток и тканей растений 7
1.2. Генетические изменения, возникающие в культуре клеток и тканей растений 10
1.2.1. Изменение плоидности и числа хромосом 11
1.2.2. Хромосомные мутации 15
1.2.3. Генные мутации . 18
1.2.4. В нехромосомные изменения 19
1.3. Факторы, вызывающие генетическую нестабильность культивируемых клеток 20
1.3.1. Гетерогенность исходного материала 21
І.З.З.Условия культивирования 22
1.3.4. Влияние типа экспланта растения 24
1.3.5. Типы морфогенеза 26
1.3.6. Продолжительность культивирования 26
1.4. Механизмы сомаклональной изменчивости 28
1.5. Способы выявления сомаклональной изменчивости 34
1.5.1. Фенотипический (морфологический) уровень 35
1.5.2. Цитогенетическое изучение 37
1.5.3. Выявление полиморфизма на молекулярном уровне 40
1.5.3.1. Белковые маркеры 40
1.5.3.2.Методы анализа полиморфизма ДНК 44
1.5.3.2.1. Молекулярные маркеры на основе ПДРФ 44
1.5.3.2.2. Анализ полиморфизма генома методом полимеразной цепной реакции 45
-RAPD анализ 46
-ISSR маркеры 50
STS маркеры 51
AFLP маркеры 53
Комплексный анализ сомаклональной изменчивости 55
Гла ва 2. Материалы и методы 58
2.1. Исходный материал 58
2.2.Введение клеток в культуру in vitro и получение растений- регенерантов 60
2.3. Анализ пыльцы у растений - регенерантов. 61
2. 4. Выделение ДНК гороха для ПНР-анализа 61
2.5.Метод ПЦР-анализа с использованием RAPD- и ISSR- праймеров 63
2.6. Проведение электрофореза в агарозном геле 64
2.7. Клонирование фрагмента 65
2.7.1. Выделение фрагментов из геля 65
2.7.2.Лигирование фрагментов ДНК с pGEM-T вектором 65
2.7.3.Трансформация Е. coll (штамма JM 109) плазмидной ДНК 65
2.8.Выделение плазмидной ДНК из E.coli JM 66
2.9.Анализ плазмидной ДНК на наличие вставки 67
2.10.Секвенирование 68
2.11. Полное секвенирование длинных фрагментов 68
2.12. Математические методы обработки данных 69
2.12.1. Статистические методы 69
2.12.2. Качественная и количественная оценка полиморфизма 69
2.13. Анализ нуклеотидных последовательностей 70
Глава 3. Результаты и обсуждение 71
3.1. Получение исходного материала 71
3.2 Анализ физиологических, морфологических и количественных признаков у регенерантов гороха в потомстве Rj - R2 80
3.3. Молекулярно-генетический анализ растений - регенерантов (R0) и сомаклонов гороха 92
3.3.1. Молекулярно-генетический анализ растений - регенерантов первой группы, полученных после восьми месяцев культивирования каллусов в условиях in vitro 94
3.3.2. Молекулярно-генетический анализ растений - регенерантов второй группы, полученных после десяти лет культивирования каллусов в условиях in vitro 98
3.3.3. Количественная оценка полиморфизма ДНК у регенерантов гороха Ro с помощью молекулярных RAPD- и ISSR- маркеров 103
3.3.4. Молекулярно-генетический анализ сомаклонов гороха 107
3.4. Анализ наследования полиморфных фрагментов 113
3.5. Сиквенс полиморфных нуклеотидных последовательностей, выявляемых RAPD-и IS SR-методами 120
3.5.1. Фрагмент В340#1600 120
3.5.2.ФрагментОД5#1500 122
3.5.3. Фрагмент V#480 123
3.5.4. Фрагмент С5#550 124
3.5.5. Фрагмент ВЗШ370 125
3.5.6. Фрагмент В474Я450 126
Заключение 130
Выводы 133
Список литературы 134
Приложение 163
- Факторы, вызывающие генетическую нестабильность культивируемых клеток
- Анализ полиморфизма генома методом полимеразной цепной реакции
- Анализ физиологических, морфологических и количественных признаков у регенерантов гороха в потомстве Rj - R2
- Количественная оценка полиморфизма ДНК у регенерантов гороха Ro с помощью молекулярных RAPD- и ISSR- маркеров
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Культура клеток и тканей растений представляет большой интерес для физиологов, генетиков и селекционеров, а также специалистов в области клеточной и молекулярной биологии. Её широко используют для изучения фундаментальных проблем биологии - особенностей организации и эволюции генома, а также для микроклонального размножения и клеточной селекции, связанной с получением новых форм растений.
Как известно, условия выращивания клеток (тканей) в системе in vitro и процесс каллусообразования являются стрессовыми факторами, которые приводят к появлению так называемой сомаклональной изменчивости в каллусных клетках, а также у растений - регенератов (Larkin and Scowcroft 1981; McClintoc, 1984). Такие изменения могут иметь как наследственную -генетическую, так и модификационную природу.
До недавнего времени большинство работ, посвященных изучению сомаклональной вариабельности, было связано только с описанием морфологических и цитогенетических изменений у растений - регенерантов, однако часто анализ таких признаков затруднен, а генетическая природа таких изменений остается неясной. Так, например, фенотипические изменения могут иметь как генетическую, так и эпигенетическую природу (Kaeppler et. al., 2000), а с помощью цитогенетических подходов можно обнаружить только крупные хромосомные перестройки или изменение уровня плоидности. Молекулярные маркеры позволяют устранить эти недостатки.
В последнее время для исследования сомаклональной изменчивости широко используются молекулярные маркеры, основанные на ПЦР, в частности RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) и ISSR (Inter Simple Sequence Repeats) маркеры, которые могут выявить изменения в нуклеотидной последовательности ДНК.
Одна из основных причин нестабильности генома в культуре клеток растений - это длительное пассирование тканевых культур, которое приводит к накоплению в них генетических изменений. Молекулярные методы дают возможность проследить генетическую изменчивость на разных этапах культивирования клеток и сделать предположения о времени и природе возникновения мутаций.
Цель исследования заключалась в изучении сомаклональной изменчивости среди растений-регенерантов трех генотипов гороха (Виола, W-1, R-9), которые были получены из каллусов разной продолжительности культивирования.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
-
Ввести в культуру клеток и тканей разные генотипы гороха (Виола, W-1, R-9).
-
Получить растения-регенеранты из культуры in vitro разной продолжительности культивирования: 8 муушпго каллуса и из длительно культивируемого каллуса (более 10 лет).
»*y^2t
МС НАЦИОНАЛЬНАЯ ВНБЛПОТЕКА СИ 9»
-
Провести анализ морфологических и количественных признаков у регенерантов Ro и потомства сомаклонов (R) и R2).
-
Выявить полиморфные RAPD и ISSR маркеры, отличающие регенеранты (Ro) от исходной линии и проследить их наследуемость в следующих поколениях Ri и R2.
-
На основании полученных данных выяснить влияние исходного генотипа и продолжительности культивирования на накопление генетических изменений на молекулярном уровне в культуре клеток и тканей гороха.
-
Клонировать и секвенировать полиморфные фрагменты. Полученные нуклеотидные последовательности сравнить с имеющейся базой данных GeneBank, используя алгоритм blastn. На основании полученных данных сделать предположение о природе сомаклональной изменчивости.
Научная новизна. В данной работе представлена технология длительно-культивированного каллуса гороха, благодаря которой были получены две группы растений-регенерантов гороха из каллусов разной продолжительности культивирования: 8 месячного каллуса и из длительно культивируемого каллуса (более 10 лет). Установлено, что при увеличении продолжительности культивирования каллусов с 8 месяцев до 10 лет резко снижается регенерационная способность побегов из культуры тканей, а у регенерантов гороха уменьшается жизнеспособность и продуктивность.
Впервые был проведен молекулярный анализ регенерантов гороха, полученных из длительно культивируемого каллуса с помощью RAPD- и ISSR методов. При этом было установлено, что на способность накопления мутационных изменений в культуре клеток in vitro больше оказывает влияние генотип, чем продолжительность культивирования каллуса. Однако при сравнении уровня изменчивости двух групп регенерантов было показано, что регенеранты, полученные после десяти лет культивирования, имели более высокий уровень полиморфизма по сравнению с регенерантами, полученными из более молодой культуры клеток и тканей.
Анализ сиквенса полиморфных фрагментов показал, что в большинстве случаев изменения в процессе культивирования in vitro возникают в некодирующих районах ДНК и не затрагивают функциональных генов. Последовательности секвенированных фрагментов ДНК гороха записаны в базе данных GeneBank.
Практическое значение работы: Получены новые формы растений-регенерантов с измененными количественными и качественными признаками, которые могут быть использованы в учебном процессе для демонстрации генетических изменений, возникающих в культуре клеток in vitro.
Показано, что с помощью молекулярных RAPD- и ISSR- методов можно проследить генетическую изменчивость у растений-регенерантов, полученных из каллусов на разных этапах культивирования клеток и сделать предположения о времени и природе возникновения мутаций.
Результаты работы вошли в разработку практикума "Молекулярное маркирование генома растений " для студентов биологического факультета МГУ.
Апробация работы. Результаты исследований были представлены на конференции, посвященной 100-летию со дня рождения А.Р. Жербака и 70-летию образования кафедр генетики в Московской с.х. академии имени К.А. Тимирязева (Москва, 26, 27 февраля 2002); VIII International Conference «The Biology of Plant Cells In Vitro and Biotechnology» (Saratov, September 9-13 2003); на 2-й конференции московского общества генетиков и селекционеров им. Н. И. Вавилова. 2003; на международной научно-практической конференции «Биотехнология овощных, цветочных и малораспространенных культур» (Москва, 22-24 марта 2004); на 3-ем съезде ВОГИС (Москва, 6-12 июня 2004); на международной научной конференции «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология» (Минск, 24-26 ноября 2004); на 3-ем международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 14-18 марта 2005); на ХП международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2005» (Москва, 12-15 апреля 2005 г).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из разделов: Введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список литературы, приложение. Работа изложена на /& страницах машинописного текста, включает Лі рисунок, S/ таблицы. Список литературы включает /# наименований.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант 04-04-48080 и 04-04-48956) и программы поддержки ведущих научных школ (НШ-173 2005)
Факторы, вызывающие генетическую нестабильность культивируемых клеток
Начиная с первых работ по изучению культуры клеток и тканей, исследователей интересовал вопрос о том, какие клеточные изменения могут происходить в клетках на искусственных питательных средах, и какие факторы вызывают такие изменения. Некоторые факторы, ведущие к сомаклональной изменчивости, можно устранить, например, если в качестве исходного экспланта брать генетически стабильные меристемы. Снять действие других факторов невозможно. Можно выделить две основные группы факторов, вызывающие нестабильность генома в культуре клеток растения:
1. Генетическая гетерогенность исходного материала. 2. Культивирование клеток в условиях in vitro, куда относится: 2.1) Влияние условий культивирования, в частности, мутагенное действие гормонов и метаболитов. 2.2) Генотип донорного растения и тип исходного экспланта. 2.3) Тип морфогенеза (соматический эмбриогенез или органогенез). 2.4) Длительное пассирование тканевых культур, В результате этого чаще всего мы имеем дело с генетически гетерогенной культурой клеток, где встречается высокая степень анеуплоидии, полиплоидии, структурные перестройки хромосом, различные аномалии митоза. Соматические клетки исходного экспланта могут иметь разный уровень плоидности, находиться на разных стадиях дифференцировки, содержать соматические мутации (Сидоров, 1990; Долгих, Шамина, 1991; Кунах, 1999), иметь остаточную гетерозиготность (Скаукрофт, 1990).
Обычно соматические клетки растений имеют двойной набор хромосом, однако некоторые растения, такие как пшеница, овёс, картофель, томат, сахарный тростник наряду с диплоидными содержат анеуплоидные и полиплоидные клетки. Структура и поведение клеток исходной ткани в целом растении более однородны, чем у тех же клеток в культуре. Клетки исходного экспланта могут находиться на разных стадиях дифференцировки, причем, чем ниже уровень дифференцировки, тем больше вероятность того, что сомаклоны будут отличаться от исходных родительских форм.
Экспериментально было показано, что в меристемных тканях растений в процессе дифференцировки в соматических клетках может происходить эндоредупликация хромосом и формирование тканей разного уровня плоидности, что приводит к изменчивости у регенерантов. Например, у пшеницы число анеуплоидных сомаклонов может достигать 29% (Кагр, Maddock, 1984). У эксплантов сердцевинной паренхимы табака, имеющих разный уровень плоидности, в условиях in vitro вначале делятся диплоидные и тетраплоидные клетки. В клетках, имеющих более высокий уровень плоидности, вначале редуцируется число хромосом путём фрагментации ядер, и лишь затем они приступают к делению (Brassard, 1974).
Физиологическая гетерогенность в популяции клеток in vitro характеризуется тем, что в одно и то же время клетки могут делиться, расти, находиться в стационарной фазе, стареть и умирать (Бутенко, 1975).
Условия культивирования.
На уровень и спектр хромосомной изменчивости существенно влияют конкретные условия индукции и культивирования каллусов: температура, освещенность, состав питательной среды и др. (Orton, 1984; Cullis, Cleary, 1986; Шамина, 1988).
Условия культивирования, в частности нарушение гормонального баланса - одна из причин возникновения генетического разнообразия культивируемых клеток. Фитогормонам принадлежит ведущая роль в возникновении геномной изменчивости. Различное соотношение гормонов в питательной среде способствует нарушению гормонального баланса самой клетки, что ведёт к разнокачественной морфологической и цитогенетической структуре клеточных популяций (Кунах, 1999). Так, 2,4-Д и НУК вызывают мутации, амитозы, эндополиплоидию, а БАП и кинетин вызывают мутации и дополнительную репликацию ДНК (Jha, Sen, 1990). При изучении влияния ауксинов на уровень плоидности каллусов, полученных из сегментов гипокотиля Nigella sativay было показано, что при использовании НУК, ИМК и ИУК происходило постепенное снижение уровня плоидности, а обработка 2,4-Д вызывала более быстрое снижение уровня плоидности. Однако если к ауксинам добавить кинетин или кокосовое молоко, то это вызывало полиплоидизацию ткани (Ghosh and Gadgil, 1979).
В то же время, были получены данные о том, что повышение концентрации кинетина (с 0,02 мг/л до 1 мл/л) существенно не влияет на уровень хромосомных аберраций и на число хромосом в клетках первичного каллуса у Haplopappus gracilis. Подобные данные о незначительном влиянии гормонального состава на кариотип клеток получены и другими исследователями (Bennici, Caffaro, 1985).
Бейлисс обнаружил, что очень высокие концентрации 2,4-Д и кинетина (50 мг/л) в питательной среде вызывали хромосомные аберрации, в то время как при более низких концентрациях хромосомных аберраций не наблюдалось. Он отметил, что 2,4-Д оказывает мутагенное действие, путем неорганизованного роста клеток (Bayliss, 1980).
Подводя заключение литературным данным о влиянии гормонов, можно сделать вывод, что главная роль при превращении любой клетки в каллусную принадлежит воздействию на неё фитогормонов в таких концентрациях и комбинациях, которые на клетку в организме in vivo не действовали. Здесь следует отметить универсальность превращения в каллусный тип разных видов клеток, изолированных из растения и подвергнутых действию фитогормонов.
Необходимо отметить, что кроме фитогормонов на появление изменчивости влияют и другие компоненты среды: минеральные вещества, сахароза, витамины, дрожжевой экстракт (Reisch, 1983; Kishor, Reddy, 1987; Кунах, 1999). При удалении витаминов из питательной среды у штамма DM-8 диоскореи дельтовидной увеличивалось число гаплоидных клеток, а у штамма DM-0,5 того же растения - число полиплоидных клеток (Попов, Волкова, 1994).
Анализ полиморфизма генома методом полимеразной цепной реакции
Метод полимеразнои цепной реакции (ПЦР) в последнее время широко применяется в молекулярной биологии, генетике, экологии, медицине для решения самых разнообразных задач. Этот метод используется для обнаружения полиморфизма ДНК в локусах, для получения и клонирования фрагментов ДНК и РНК с известной нуклеотидной последовательностью, для составления генетических карт (Nilson et al., 1997; Ben Chaim et al., 2001; Кочиева, 1999; Гостимский и др., 1999).
Существует два основных варианта полимеразнои цепной реакции: 1. ПЦР с произвольными праймерами например, RAPD (Random Amplified Polimorphic DNA), AP-PCR (Arbitrarily Primed PCR) или DAF (DNA Amplification Fingerprinting) маркеры, (Williams et.al., 1990; Welsh, McClelland, 1991; Caetano-Anolles et al., 1991; Сиволап, Календарь, 1995; Bassam et al., 1994).
2. ПЦР с использованием специфических праймеров (длиной в 20-27 нуклеотидов), сконструированных на основе известной нуклеотидной последовательности: STS (Sequence Tagged Sites) маркеры (Шагинян, Гинцбург, 1995).
Одним из методов полимеразной цепной реакции со случайными праймерами является RAPD (Random Amplified Polimorphic DNA) метод. Суть этого метода заключается в том, что каждый ПЦР - продукт амплифицируется из участка геномной ДНК, который содержит две короткие последовательности, гомологичные десятичленному олигонуклеотидному праймеру. Эти последовательности должны находиться на достаточно близком расстоянии и располагаться на противоположных цепях ДНК. Использование коротких праймеров и низкой температуры отжига обеспечивает амплификацию нескольких фрагментов, случайно расположенных по всему геному. Полиморфизм ДНК между образцами может возникнуть из-за различий в одном или обоих сайтах отжига праймера вследствие точковой мутации или инсерции/делеции. RAPD - маркеры в основном наследуются как доминантные маркеры, кодоминантное наследование встречается редко. Обычно RAPD - локусы определяются двумя аллелями в виде присутствия или отсутствия полосы.
RAPD, AP-PCR и DAF методы сходны между собой, но различаются только длиной праймеров и методами выявления продуктов реакции. Так в AP-PCR (или ПЦР с произвольным праймером) используют один праймер произвольной последовательности длиной от 15 до 25 нуклеотидов (Welsh, McClelland, 1990), в RAPD - от 8 до 12 (Williams et al.f 1990), в DAF - от 5 до 8 нуклеотидов (Caetano-Anolles et a 1., 1991),
При проведении AP-PCR полученные продукты разделяют с помощью электрофореза как в полиакриламидном, так и в агарозном гелях (Welsh and McClelland, 1990), Особенностью этого метода является проведение отжига праймера в нескольких первых циклах при более низкой, чем оптимальная, температуре (так называемый "мягкий" отжиг), что повышает эффективность праймирования. Затем следует серия циклов жесткой амплификации (Hadrys et al, 1992; Малышев, Картель, 1997; Дорохов, Клоке, 1997).
В DAF (или ДНК амплификационный фингерпринтинг) используют один или более праймеров, длиной обычно от 5 до 8 нуклеотидов. Для выявления продуктов амплификации используют ПААГ и высоко чувствительное окрашивание нитратом серебра (Caetano-Anolles et al., 1991; Qui et al., 1995). Предварительное расщепление матричной ДНК одной или несколькими рестриктазами позволило выявить полиморфизм даже у близкоизогенных линий сои (Малышев, Картель, 1997).
Широкое распространение для изучения сомаклональной изменчивости получил RAPD-метод. С помощью RAPD анализа обнаружены различия на молекулярном уровне между сомаклонами персика (Hashmi et al., 1997), робинии (Kanwar, Bindiya 2003) гороха (Кокаева и др., 1997), риса (Godwin et al., 1997; Yang et al., 1999), сои (Gesteira et al., 2002), томатов (Soniya et al., 2001; Bogani et al., 1996) кукурузы (Осипова и др., 2001), ириса (Козыренко и др., 2004) и других растений.
На основе молекулярных RAPD - маркеров можно провести количественную оценку изменчивости в геноме сомаклонов, полученных из культуры клеток. Результаты, характеризующие степень полиморфизма ДНК среди сомаклонов различных видов с помощью RAPD-метода весьма разнообразны. Так, например, для каллусных клонов томата описана высокая степень полиморфизма ДНК: до 60% и выше (Bogani et al., 1996), а у регенерантов томата степень генетических различий варьировала от 1% до 10% (Soniya et al., 2001). В клеточных линиях женьшеня в работе Козыренко был выявлен небольшой полиморфизм ДНК - до 10,6 % (Козыренко и др., 2001), с другой стороны, в другой аналогичной работе на женьшене по результатам RAPD анализа все регенеранты оказались однородными (Shoyama et al., 1997).
Высокая разрешающая способность RAPD метода позволяет обнаруживать изменения в геноме клеток на разных этапах их культивирования, даже если они не проявляются фенотипически. Так, на примере каллусов сахарного тростника, пассируемых в течение двух лет, было показано, что RAPD спектры у таких регенерантов значительно более полиморфны, чем спектры регенерантов, полученных из более молодых эмбриональных культур (Taylor etal., 1995). Подобные же результаты по накоплению генетических изменений в культуре клеток были получены на сомаклонах кукурузы, выделенных из каллусов разной продолжительности культивирования (Осипова и др., 2003).
Анализ физиологических, морфологических и количественных признаков у регенерантов гороха в потомстве Rj - R2
Семена, полученные от регенерантов RQ (В количестве от 3 до 26 шт.) высаживали в полевых условиях на Звенигородской опытной станции. Среди потомства растений-регенерантов R] и R2, полученных после десяти лет культивирования каллусов гороха, в отличие от регенерантов, полученных из 8-месячного каллуса, следует отметить сильное отставание в росте и развитии, пониженную всхожесть семян (около 70%), высокий процент стерильной пыльцы (25 - 30%). В тоже время у контроля процент стерильной пыльцы не превышал 10%.
Сильных морфологических изменений в потомстве регенерантов Ri первой группы обнаружено не было. Однако, среди изученных растений — регенерантов Ri - R3 второй группы были обнаружены такие морфологические изменения, как: - уменьшение воскового налета, - увеличенное образование боковых побегов (от 2 до 4), - изменение цвета листовой пластинки (от светло-зеленой до темно-зеленой), - изменение формы листовой пластинки с овальной на удлиненную, (рис. 3.3), - появление асимметрии в развитии как листа, так и прилистников, - развитие листовой пластинки вместо цветоноса, - удлинение периода вегетации.
Около 30% исследуемых растений R] второй группы имели усиленное ветвление, 10% растений, полученных из линии W-1, и 15%, полученных из линии R-9, имели ассиметричное развитие листовой пластинки. Развитие листа вместо цветоноса обнаружено от 7% у потомства регенерантов R-9 до 11% у потомства регенерантов W-1. Изменение окраски листа обнаружено у 2% растений линий R-9 и W-1. Все эти признаки не наследовались в следующих поколениях.
Анализ 31 линии сомаклонов R-9 в поколении Ri показал, что в одной линии R-9 (№ 37-2) наблюдалось уменьшение или потеря воскового налета. Эта мутация наследовалась в R2 и Rj. В другой семье (№43-4) изменения в Ri не были обнаружены, однако в следующем поколении R2, состоящем из 5 растений, одно из которых погибло в начале своего развития, оставшиеся 4 имели также в той или иной степени ослабленный восковой налет. По-видимому, это связано с тем, что растения в Ri гетерозиготны и рецессивная мутация может реализоваться в следующем поколении R2. Таким образом полученная мутация, затрагивающая уменьшение воскового налёта, вероятно, имеет моногенное рецессивное наследование, что согласуется с ранее полученными данными (Багрова и ДР., 1991).
В другой семье R (у линии R-9 № 33-2) обнаружена ещё одна мутация - одно из пяти исследованных в Ri растений имело габитус, отличный от исходного генотипа. Растение имело мелкие удлиненные листья, тонкий стебель и небольшую высоту стебля. В R2 и R3 все потомство от этого растения имело такие же признаки, как у растения в Ri, и расщепления не наблюдалось. Полученные данные говорят о том, что в Ro эта рецессивная мутация находилась в гетерозиготе и фенотипически проявилась только в следующем поколении Ri в рецессивной гомозиготе, следовательно, в R2 расщепления не наблюдалось. Анализ таких линий регенерантов до поколения R3 включительно показал генетическую природу возникших изменений.
Ранее фенотипическое изучение 80 линий регенерантов гороха Pisum sativum L. позволило выявить одну хлорофильную мутацию (chlorotica) и две мутации, связанные с потерей воскового налета (waxy).
Анализ потомства показал, что более 70% линий регенерантов имеют изменения по физиологическим и количественным признакам, связанными с изменением узела закладки первого цветка, габитуса растения, формы и цвета листочков и др. (Ежова, и др. 1989).
Таким образом, можно сделать вывод, что условия культивирования in vitro вызывают дестабилизацию генома, которая сохраняется на протяжении нескольких поколений и может реализоваться как в виде мутаций, так и в изменении экспрессии генов. Тот факт, что большинство морфологических изменений не наследуются в следующих поколениях, говорит о том, что такие изменения, обнаруженные на фенотипическом уровне, являются морфозами, связанными с эпигенетическими изменениями.
Помимо исследования морфологических изменений мы провели анализ количественных признаков. Сомаклональные вариации, связанные с изменением количественных признаков, фиксировали в поколениях регенерантов гороха R и R2, Учитывали следующие показатели: высоту растения, число междоузлий, число междоузлий до первого цветка, количество бобов и семян на одно растение, вес 100 семян.
Анализировали потомство (Ri) от 16 регенерантов R-9 и 19 регенерантов линии W-1, возникших после 8 месяцев культивирования каллусов, а также потомство 22 регенерантов линии R-9 и 7 линии W-1, полученных после 10 лет культивирования каллусов. От индивидуальных растений Ri второй группы было получено и исследовано семенное потомство R2 в количестве 22 семей линии R-9 и 13 семей линии W-1.
По большинству признаков разнообразие среди сомаклонов R( превышало пределы изменчивости по сравнению с контрольными (исходными) растениями, из которых они были получены (табл. 3.4). Так, на рисунке 3.4. представлены средние значения показателей продуктивности сомаклонов обеих групп и исходных генотипов, из которых они были получены (R-9 и W-1). В большинстве случаев это происходит за счет снижения исследуемых показателей, однако не исключено появление форм с положительными свойствами, например, для регенеранта W-1 № 19 наблюдалось повышение средних значений по высоте, количеству бобов и семян на одно растение, весу семян (Приложение 1.1. табл. 2.).
Количественная оценка полиморфизма ДНК у регенерантов гороха Ro с помощью молекулярных RAPD- и ISSR- маркеров
Так как культура клеток является высоко мутабильной системой, использование молекулярных методов может способствовать более тщательному изучению природы сомаклональной изменчивости. Использование RAPD- и ISSR- праймеров позволяет получить более полную картину изменений генома в культуре клеток и тканей in vitro, так как они амплифицируют случайные последовательности, разбросанные по всему геному. Это могут быть как уникальные фрагменты (Легкобит, 2003), так и повторы, например, микросателлитные повторы характерны для некодирующих участков генома (Bogany et ah, 1996). Молекулярные различия (исчезновение или появление продукта амплификации) у регенерантов гороха могут быть либо вследствие наличия мутаций ДНК в сайте посадки праймера, либо из-за делеции или инсерции между сайтами праймирования. Тот факт, что среди обеих групп регенерантов можно выделить одинаковые полиморфные фрагменты (например, QR5#1500, Р340#1600), говорит о неслучайном происхождении мутаций в геноме гороха. Некоторые исследователи называют такие последовательности гипервариабельными (или hot spot - "горячие точки") районами ДНК. Они могут находиться как в уникальных генах, так и в повторяющихся последовательностях ДНК (Linacero et al., 2000).
Высокая разрешающая способность RAPD- и ISSR- методов позволяет обнаружить изменения в молекуле ДНК у регенерантов на разных этапах культивирования каллусов гороха. В нашем случае при совместном анализе регенерантов первой и второй группы наблюдается увеличение уровня изменчивости в зависимости от продолжительности культивирования. Особенно это характерно для регенерантов Виолы, у которых уровень изменчивости варьирует от 0-5% (у первой группы регенерантов) до 10% (у второй группы регенерантов). Подобные результаты по RAPD спектрам были получены на регенерантах сахарного тростника (Taylor et al., 1995), кукурузы. Так, например, у сомаклонов кукурузы, полученных из каллусов после двух месяцев культивирования, уровень дивергенции составил от 6,5 до 9,6%, а после восьми месяцев -уровень дивергенции был от 15,7 до 23% (Осипова и др., 2003).
В нашем случае следует отметить, что исходный генотип растения также оказывает большое влияние на накопление мутационных изменений в условиях in vitro. Даже у регенерантов близкородственных линий (R-9 и W-1 рис.3.16.) степень генетических различий сильно варьировала вне зависимости от продолжительности культивирования каллусов гороха, из которых позже были получены регенеранты (табл. 3.7.). При сравнении уровня изменчивости у регенерантов, полученных после десяти лет культивирования каллусов, было показано, что он в большинстве случаев не превышал изменчивости у сомаклонов гороха, полученных из более молодой культуры (после 2 лет культивирования in vitro).
RAPD- метод эффективно применялся для определения уровня геномного полиморфизма сомаклонов, полученных из культуры клеток и тканей: персика (Hashmi et al,, 1997), томата (Soniya et al., 2001; Bogani et al., 1996), сои (Gesteira et al., 2002) и других сельскохозяйственных культур. Такие исследования проводились в том числе на лекарственных растениях, например, на регенерантах женьшеня (Козыренко и др., 2001) и солодки голой (Чибиряев, 2002). ISSR - метод также использовали для обнаружения полиморфизма среди каллусной культуры цветной капусты (Leroy et al,, 1998). Следует учесть, что в разных исследованиях при сравнении степени генетических различий могут быть расхождения, которые связаны с разными методами обсчета данных молекулярного анализа. Однако на сомаклонах кукурузы было показано, что хотя при изменении подхода в расчете исходных данных меняется степень генетических различий, характер изменчивости между группами сомаклонов остается практически неизменным (Осипова, 2003).
Доказательством генетической природы сомаклональных изменений на молекулярном уровне служит воспроизводимость результатов и наследование выявленных фрагментов в следующем поколении. Для этого был проведен молекулярно-генетический анализ Rj и R2.
