Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Состояние проблемы охраны генофондов редких и исчезающих видов растений
1.1 .Генетическая компонента биологического разнообразия 12
1 2. Использование молекулярных маркеров для анализа полиморфизма ДНК растений 16
1.3.Характеристика генофондов редких и исчезающих видов растений на основании анализа полиморфизма молекулярных маркеров 47
1.4 .Проблемы молекулярно-генетической идентификации и паспортизации растений 57
1.5.Популяционно-генетические исследования редких и исчезающих травянистых видов растений Урала 63
1 6.Проблема выявления объектов сохранения генофондов 79
Глава 2. Объекты, регион и методы исследований
2.1. Характеристика региона исследований 85
2.2. Объекты исследований 92
2.3. Методы исследований 94
Глава 3. Биологические особенности редких реликтовых видов растений и характеристика избранных для изучения популяций
3.1.Adonis vernalis L 101
3.2.Adonis sibirica Patrin exLedeb Ill
3.3.Раеопіа anomala L 115
3.4. Adenophora lilifolia (L.)A.DC 120
3.5. Digitalis grandiflora Mill 128
Глава 4. Анализ генофондов редких видов растений на основании оценок полиморфизма фрагментов днк, фланкированных инвертированными микросателлитными повторами (issr-pcr маркеры)
4.1. Анализ генетического разнообразия популяций двух видов рода Adonis 138
4.2. Анализ генетической изменчивости Adenophora lilifolia (L.)A.DC 158
4.3. Анализ полиморфизма ISSR-маркеров Digitalis grandiflora Mill. 163
4.4. Применение ISSR-маркеров для молекулярно-генетического анализа генофондов растений 169
Глава 5. Анализ генетического разнообразия редких видов растений с использованием оценки полиморфизма инвертированных повторов ретротранспозонов (irap-pcr маркеры)
5.1. Использование ДНК-маркеров на основе ретротранспозонов для анализа полиморфизма ДНК редких видов растений 174
5.2. Анализ полиморфизма IRAP-маркеров A. vernalis 181
5.3. Анализ генетической изменчивости A. sibirica 188
Глава 6. Молекулярно-генетическая паспортизация редких и исчезающих видов растений
6.1. Методика молекулярно-генетической паспортизации 197
6.2. Молекулярно-генетическая паспортизация видов рода Digitalis..209 б.З.Молекулярно-генетическая паспортизация видов рода Adenophora 214
Глава 7. Концепция идентификации и оценки состояния генофондов редких и исчезающих видов растений
7.1. Характеристика генофондов на основании анализа полиморфизма ISSR- и IRAP- маркеров 219
7.2. Принципы множественного молекулярно-генетического геномного маркирования 230
7.3. Показатели генетической дифференциации популяций 234
7.4. Оценка состояния генофондов редких видов растений на основании молекулярно-генетического анализа 242
7.5. Отбор объектов для сохранения и меры охраны генофондов редких реликтовых видов растений 254
Выводы 265
Список литературы 268
Приложение
- Использование молекулярных маркеров для анализа полиморфизма ДНК растений
- Анализ генетической изменчивости Adenophora lilifolia (L.)A.DC
- Анализ полиморфизма IRAP-маркеров A. vernalis
- Молекулярно-генетическая паспортизация видов рода Digitalis..209 б.З.Молекулярно-генетическая паспортизация видов рода Adenophora
Введение к работе
Актуальность проблемы
Сохранение биологического разнообразия занимает особое место среди глобальных проблем современности (Вахрамеева, 1988; Конвенция о биологическом разнообразии..., 1992; Алтухов, 1995; Hebert et al., 2003; Динамика популяционных генофондов..., 2004). Основой биологического разнообразия является его генетическая компонента. Сокращение видового и генетического разнообразия представляет реальную угрозу для биосферы, поскольку устойчивость воспроизводства природных экосистем и агроэкосистем непосредственно связана с их генетически обусловленным потенциалом к адаптациям к меняющимся условиям окружающей среды (Мэгарран,1992; Глазко, 1998; Лебедева и др., 1999, Жученко, 2001, Динамика..., 2004). К середине текущего столетия прогнозируется увеличение числа видов растений, находящихся под угрозой исчезновения, с 7 до 60 тысяч (Frankel et al., 1995; Стратегия сохранения..., 2004).
Впервые концепция о необходимости контроля и мобилизации мировых растительных ресурсов была разработана Н.И. Вавиловым, что легло в основу планомерной работы по созданию банков растительных ресурсов в разных странах. К настоящему времени в них собраны миллионы образцов, однако до сих пор нет универсальных принципов их отбора (Жученко, 2001). Необходимость сохранения внутривидовой изменчивости, как на межпопуляционном, так и на внутрипопуляционном уровнях, недостаточно учитывается при изучении редких видов растений (Тихонова, 1985). Популяционный подход остается наименее разработанным в области сохранения биоразнообразия растений, поскольку до сих пор отсутствуют общепринятые методы идентификации не только популяционных, но даже видовых особенностей генофондов. Анализ молекулярно-генетических маркеров полиморфизма белков и различных участков геномной ДНК позволил выявлять внутривидовое генетическое разнообразие, оценить гетерозиготность, реконструировать филогенетические взаимоотношения между видами и пространственные взаимосвязи между популяциями (Алтухов, 1975, 1995а,б; Янбаев и др., 2007; Политов, 2007). В то же время, эффективность использования традиционных молекулярно-генетических
маркеров (структурных генов, мини- и микросателлитных локусов) для исследований генофондов до сих пор остается достаточно низкой из-за ограниченности количества локусов, доступных для одновременного генотипирования особей. Это требует поиска новых подходов одновременного молекулярного маркирования многих геномных участков, которые могли бы позволить создавать «геномный портрет» каждого отдельного индивидуума и таким образом, наиболее объективно оценивать своеобразие генофондов популяций. Особую важность разработка таких методов имеет для решения главной проблемы в поддержании биоразнообразия - отбора наиболее типичных представителей популяций и создания генетически обоснованных программ по их сохранению. К настоящему времени у редких эндемичных видов растений Урала изучен ряд характеристик внутривидовой изменчивости (Кучеров, Щелокова, 1987; Кучеров и др., 1993; Янбаев и др., 2000; Янбаев и др., 2007), но практически не исследована генетическая изменчивость травянистых реликтовых редких видов растений, в том числе и в Пермском крае.
Актуальность диссертационной работы обусловлена:
а) недостаточной теоретической разработанностью молекулярно-
генетических подходов к изучению геномов дикорастущих редких видов
растений, представленных популяциями с низкой численностью;
б) важностью определения молекулярно-генетических основ
генетического разнообразия редких видов растений на популяционном
уровне;
в) отсутствием экспериментальных методов молекулярного
маркирования многих участков геномов редких видов растений, пригодных
для массового анализа;
г) недостатком методов для оптимизации сохранения генофондов
редких и исчезающих видов растений.
Цель и задачи исследования
Цель работы — разработать принципы множественного молекулярно-генетического геномного маркирования и технологию идентификации и паспортизации генофондов редких реликтовых видов растений Пермского
края в качестве модельной системы оптимизации сохранения генофондов редких и исчезающих видов растений.
Для достижения цели были поставлены следующие основные задачи:
Подобрать наиболее полиморфные стабильные ДНК-маркеры и разработать методы оценки мультилокусного полиморфизма /ТНК с целью оптимизации исследования генофондов популяций редких и исчезающих видов растений.
Исследовать генетическое * разнообразие популяций некоторых редких реликтовых видов растений, распространенных на территории Пермского края.
3. Определить общую и эффективную численность популяций, способ
размножения и семенную продуктивность некоторых редких реликтовых
видов растений.
4. Установить популяции с типичными и специфическими
характеристиками генофондов.
5. Разработать методику и провести молекулярно-генетическую
паспортизацию (ключевого звена технологии идентификации генофондов
редких и исчезающих видов растений), на модельных редких реликтовых
видах растений Пермского края.
Положения, выносимые на защиту
Наиболее эффективным для оценки генетического разнообразия популяций редких и исчезающих видов растений является использование ДНК-фингерпринтинга (анализа полилокусных спектров) высоко полиморфных и стабильных ISSR- и IRAP-маркеров.
Оптимизация сохранения генофондов редких и исчезающих видов растений возможна с учетом показателей генетического разнообразия, установленных по результатам молекулярного маркирования множественных геномных участков, а также с обязательным учетом уровней внутри- и межпопуляционного разнообразия.
3. Для сохранения генофондов редких и исчезающих видов растений
рекомендуются отбор в природных условиях популяций и их групп как с
наиболее типичными, так и со специфичными характеристиками генофондов.
4. Для оптимизации сохранения генетического разнообразия на
популяционном уровне необходима молекулярно-генетическая
идентификация и паспортизация генофондов редких и исчезающих видов растений, позволяющая на основании оценок полилокусного сочетания моно-и полиморфных участков ДНК составить молекулярно-генетическую формулу, штрихкод популяций и обобщить данные в виде генетического паспорта.
Научная новизна полученных результатов
Впервые разработана концепция идентификации генофондов редких и нуждающихся в охране видов растений с использованием оценок геномного распределения повторов, таких как микросателлиты и ретротранспозоны. Впервые получены и систематизированы данные о генетическом разнообразии популяций ряда редких травянистых реликтовых видов растений, произрастающих на территории Пермского края: адониса весеннего Adonis vernalis L., адониса сибирского Adonis sibirica Patrin ex Ledeb., бубенчика лилиелистного Adenophora lilifolia (L.) A.DC, пиона уклоняющегося Paeonia anomala L., наперстянки крупноцветковой Digitalis grandiflora Mill. Впервые оценена эффективность в исследованиях генофондов редких видов растений IRAP-метода, который основан на использовании в полимеразной цепной реакции (ПЦР) в качестве праймеров терминальных последовательностей ретротранспозонов. С целью анализа геномов редких реликтовых видов растений были клонированы и секвенированы последовательности ДНК пяти редких видов растений Пермского края. Нуклеотидные последовательности LTR-ретротранспозонов некоторых редких видов растений были включены в мировую базу генетических данных GenBank NCBI под номерами: EF191000-EF191012 ().
С целью изучения взаимосвязи генетического разнообразия с показателями численности выявлены общая и эффективная численность популяций и изучены биологические особенности модельных реликтовых редких видов растений, такие как преимущественный способ опыления, способ и эффективность размножения. Даны характеристики изученных популяций с определением степени антропогенного воздействия в
соответствии с рекомендациями, разработанными автором диссертационной работы. С целью оптимизации сохранения генофондов редких и нуждающихся в охране видов растений разработана методика молекулярно-генетической паспортизации на популяционном уровне, которая включает в себя анализ полиморфизма стабильных ISSR- и IRAP-маркеров, выявление идентификационных мономорфных (родовых и видовых) и полиморфных фрагментов ДНК, составление молекулярно-генетической формулы, штрихкода и генетического паспорта. Анализ генетического разнообразия редких видов растений на основании оценки полиморфизма ISSR- IRAP-маркеров предложен в качестве критерия оценки состояния их генофондов. На основании полученных данных рекомендованы научно обоснованные меры сохранения генофондов изученных редких реликтовых видов растений и разработаны подходы оптимизации сохранения генофондов редких и нуждающихся в охране видов растений.
Практическая значимость и реализация результатов исследований Использование ретротранспозонов для анализа геномов открывает новые возможности изучения организации и функционирования геномов редких и исчезающих видов растений, являющихся наиболее уязвимым звеном в растительных сообществах, выявления механизмов их устойчивости. Поддержание исторически сложившегося уровня генетического разнообразия популяций как основы сохранения их адаптационного потенциала в естественно колеблющейся и антропогенно трансформированной среде является необходимым условием их существования и развития. Изучение генетической изменчивости природных популяций, оценка их состояния позволяют рекомендовать научно обоснованные меры сохранения популяций редких видов растений.
Разработанная технология идентификации генофондов и ее ключевое звено (методика молекулярно-генетической паспортизации) позволяют оптимизировать сохранение генофондов растений, включая редкие и исчезающие виды растений. Научные выводы работы и рекомендации непосредственно используются при проведении мониторинга популяционного разнообразия редких и нуждающихся в охране видов растений Пермского края, так как автор диссертационной работы является
куратором пяти редких реликтовых видов растений от Управления по охране окружающей среды Пермского края. На основе динамики показателей численности и генетического разнообразия бубенчик лилиелистный {Adenophora lilifolia (L.)A.DC.) внесен в Красную книгу Пермского края (2008). Результаты и выводы исследований могут быть использованы для сохранения генофондов редких и нуждающихся в охране видов растений и оптимизации сохранения генетического разнообразия на популяционном уровне и в других регионах страны.
Теоретические и практические результаты исследований используются при преподавании учебных дисциплин и специальных курсов студентам Новосибирского, Уральского, Челябинского и Пермского государственных университетов, а также Калининградского технического университета, что подтверждено справкой и актами внедрения результатов исследований в учебный процесс.
Связь работы с научными программами
Диссертационная работа выполнялась в ходе подготовки и реализации ПГУ приоритетного инновационного национального проекта «Образование» в части «Молекулярная генетика». Популяционно-генетические исследования частично связаны с последовательным циклом программ Управления по охране окружающей среды Пермской области (2006 г): гос. контракты № 6/2006 от 03.04.2006, № 90203 от 10.04.2006, № 90202 от 01.06.2006, № 90211 от 01.06.2006; а также с программами Министерства градостроительства и развития инфраструктуры Пермского края: гос. контракты № 65-0 от 20.06.2007, № 56/1-0 от 13.06.2007, № 11-0 от 18.02.2008, № 43-0 от 17.03.2008.
Часть исследований проводились в связи с тематикой гранта РФФИр_урал_а № 07-04-96032 «Динамика генетического разнообразия и структуры популяционных систем ресурсных растений Пермского края при антропогенных воздействиях» (2006-2009 гг.), гранта РФФИр_урал_а №07-04-96016 «Влияние нефтяных загрязнений почв на популяции микроорганизмов и растений Пермского края» (2006-2009 гг.), гранта РФФИ АНФ_з №08-04-92673 «Участие в российско-австрийском семинаре «Молекулярно-генетические маркеры, филогеография и популяционная
генетика для устойчивого лесного хозяйства: Евроазиатская перспектива»
(2008-2009 гг.). V \ . ;
Лйчныйшкладгавтора*
Разработка подходов, и программы молекулярно-генетических. . исследований; выбор* типов молекулярных маркеров? и объектов исследований; планирование, организация? и проведение полевых; и ', лабораторных исследований; обработка; обобщение- и- интерпретация^ представленныхв диссертационной работе результатов^, их сопоставление с литературными сведениями, разработка теоретических положений;. подготовка практических рекомендаций и- публикаций, написание и: оформление текста^ диссертации^ проведены, лично автором* работы.. Идея создания*- концепции идентификации генофондов; разработка методики молекулярно-генетической- паспортизации, выявление мономорфных и полиморфныхидентификационныхфрагментов ДНК, а; также составление молекулярно-генетической формулы, и молекулярно-генетического паспорта единолично принадлежат автору диссертационной' работы; Для гетерогенных природных популяцию; растений1 диссертантом . предложена: запись молекулярно-генетической- формулы в виде: штрихкода; Автор диссертационной работы, является; инициатором' и одним из соавторов* обоснования внесения Adenophora lilifolia (Е.)^ A.DC. в Красную книгу Пермского края- (2008); с категорией угрожаемого состояния 3 (R)- редкий вид. Результаты, части исследований, проведенныхсовместное соискателями и аспирантами диссертанта,: опубликованы; ссылки на них приведены, в соответствующих разделах работы.
Благодарности?
Автор выражает искреннюю признательность за помощь при обучении, повышении квалификации, освоении современных методов молекулярно-генетического анализа,, подготовке, диссертационной работы и консультации с.н.с. лаборатории гетерозиса растений ИЦиГ GO РАН В;И. Коваленко и зав. лабораторией академику РАН В:К. Шумному, академику РАЕН, РАСХН (иностранный член) В;И1 Глазко и проф. Т.Т. Глазко;.проф. каф. ботаники и генетики растений ПГУ В;А. Верещагиной, Н.В: Москвиной, зав. кафедрой ботаники и генетики растений ПГУ проф. С.А. Овеснову; сотрудникам
\ ' ' .
Г 10
V . ~
( ' . .
t » .
группы проф. С.А. Гостимского (особенно с.н.с. З.Г. Кокаевой) и всей кафедре генетики Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова; зав. лабораторией растительной геномики Института биотехнологии университета Хельсинки (Финляндия) проф. А.Х. Шульману и доц. Р.Н. Календарю; зав. лабораторией популяционной генетики ИОГен имени Н.И. Вавилова РАН д.б.н. Д.В. Политову. Выражается искренняя благодарность соавторам по публикациям, а также всем, кто поддерживал и поддерживает развитие молекулярно-генетических исследований в ПТУ. Особая благодарность родным и близким.
Использование молекулярных маркеров для анализа полиморфизма ДНК растений
В современном генетическом анализе центральным инструментом является генетический полиморфизм, выявляемый с помощью молекулярных маркеров. Создатель концепции генетического полиморфизма английский генетик Е. Форд (Ford, 1940) определил это явление как «наличие в одном и том же местообитании двух или более дискретно отличающихся внутривидовых форм в таких количественных соотношениях, что самая редкая из них не может поддерживаться лишь давлением повторяющихся мутаций». Таким образом, индивидуальные различия между организмами контролируются аллельными генами и, следовательно, можно дать несколько иное определение полиморфизма, подразумевая под ним «наличие в популяции двух или более аллелей одного локуса, встречающихся с ощутимой частотой» (Cavalli-Sforza, Bodmer, 1971). Обычно на практике полиморфной считается популяция с частотой гетерозигот по некоторому локусу 1% (Алтухов, 1995а; Динамика..., 2004).
Генетический полиморфизм можно рассматривать как необходимое условие жизнеспособности вида в обстановке меняющейся среды и мозаичности фитоценозов и как проявление микроэволюционного процесса. Генетическая изменчивость в популяциях вызывается как результатами скрещиваний, так и возникновением мутаций с разными фенотипами (Злобин, 1989).
Анализ генетического разнообразия включает ряд методов: методы анализа белков, ДНК-фингерпринтинга и секвенирование ДНК. Изменчивость белков отражает лишь часть всех различий в нуклеотидных последовательностях ДНК. Не весь геном, а лишь его треть или даже меньше, кодирует и экспрессирует какие-либо белки. А изменения в некодирующей части генома или регуляторных районах генов выпадают из поля зрения исследователей. С появлением методики, позволяющей оперировать с ДНК, внимание исследователей в значительной степени переключилось на нуклеиновые кислоты как источник информативного полиморфизма.
В последние десятилетия были разработаны молекулярные методы исследования организмов с использованием ДНК маркеров. Совокупность этих методов, получивших название ДНК-фингерпринтинг, довольно широко используется для решения разнообразных задач в различных областяхбиологии (Чесноков и др., 2005). В ДНК фингерпринтинге предусматриваются две основные стратегии: 1 - «классический» фингерпринтинг, основанный на ДНК гибридизации; 2 - ГЩР анализ, заключающийся в амплификации специфичных ДНК последовательностей in vitro с помощью специфичных или неспецифичных олигонуклеотидов (праймеров) и термостабильной ДНК-полимеразы с последующим электрофоретическим разделением амплифицированных фрагментов и определением молекулярного полиморфизма посредством различных методов- окрашивания полученных ДНК фрагментов (Чесноков, 2005)/ Одним из подходов к изучению сложных геномов растений, является использование молекулярных маркеров, представляющих собой полиморфные последовательности ДНК, которые могут быть обнаружены с помощью методов, основанных на ГЩР. Полиморфизм нуклеотидных последовательностей между отдельными образцами ДНК выявляется по присутствию или отсутствию конкретных полос в спектре фрагментов ДНК при электрофорезе. Отсутствие полосы может быть следствием точечных мутаций, вставок, делеций или инверсий в последовательности ДНК матрицы (Гостимский и др., 2005). С введением молекулярных маркеров в практику биологических исследований появились новые возможности изучения генетического разнообразия, определения родства на внутри- и межвидовом уровне. Использование молекулярных ДНК маркеров открыло большие перспективы для детального картирования хромосом, идентификации генов, их клонирования, конструирования новых сортов растений и паспортизации сортов (Гостимский и др., 2005; Соболев и др., 2006).
Анализ генетической изменчивости Adenophora lilifolia (L.)A.DC
Идентификация видов и сортов растений проводится на основании ряда морфологических признаков, с помощью которых оценивается генофонд популяции, уровень изменчивости, генетическое разнообразие (Драгавцев, Дьяков, 1982; Кочегина, Драгавцев, 2008; Рамазанова, 2008). Этот подход сохранил свою актуальность и в настоящее время, но имеет ряд ограничений. Например, некоторые диагностические признаки проявляются только на конкретной стадии развития растения (цветение или созревание плода), к тому же по морфологическим признакам трудно различить растения близкородственного происхождения (Малышев и др., 2006).
Установлено, что генетические различия между отдельными организмами наиболее полно представлены на уровне ДНК. С помощью современных молекулярных методов эти различия можно обнаружить и использовать для идентификации отдельных линий, сортов и видов растений. Молекулярные методы основаны на применении ДНК-маркеров и являются дальнейшим развитием существующих в настоящее время методов, основанных на применении морфологических или биохимических (белковых) маркеров. Методы, основанные на использовании ДНК-маркеров, позволяют в значительно большей степени выявить объективные различия между исследуемыми образцами и, следовательно, существенно повысить разрешающую силу анализа. Молекулярные методы можно применять на любых стадиях развития растений, начиная с семян. Исследованию можно подвергать разные части растения, например, клубни, листья, стебли, а также ткани растений. ДНК-методы незаменимы в спорных случаях, когда применение традиционных подходов не позволяет достоверно различить исследуемые образцы (Малышев и др., 2006). Молекулярные методы, основанные на применении ДНК-маркеров, в меньшей степени подвержены генотипической изменчивости (Рамазанова, 2008).
Проблемы генетической идентификации, инвентаризации, паспортизации организмов и оценки генетического разнообразия решаются параллельно развитию методов изучения полиморфизма, использующих ДНК-маркеры различных типов для анализа генетического разнообразия растений (Чесноков, 2005; Гостимский и др., 2005; Глазко, Глазко, 2006; Кудрявцев, 2007; Политов, 2008). Проведена идентификация генотипов растений с помощью ПЦР-анализа рассеянных повторяющихся последовательностей R173 (Зайцев, Хавкин, 2001); идентификация и паспортизация сортов сельскохозяйственных культур на основе ДНК-маркеров (Малышев и др., 2006), включая сою (Брик, Сиволап, 2001; Рамазанова, 2008). Разработаны основы паспортизации зерновых культур (Цветков и др., 2006) и методика паспортизации ягодных культур (Соболев и др., 2006). Работы по молекулярно-генетической идентификации сортового материала растений проводятся в основном на важнейших продовольственных культурах (Оганисян и др., 1996; Бирюкова и др., 2003; Хавкин, 2003). С возможностью молекулярно-генетической идентификации сортовой и видовой принадлежности растений тесно связана проблема охраны прав собственности на селекционные достижения (Соболев и др., 2006).
В 2000 году полностью секвенирован геном первого растения, представителя класса двудольных Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. В 2001 г. предварительно секвенирован геном представителя класса однодольных — Oriza saliva L. Однако прямое секвенирование геномов растений требует крупных финансовых вложений и в настоящее время вряд ли возможно (Зеленин, 2003). Для генетической паспортизации редких и исчезающих видов растений необходимо использовать более рациональные подходы, основанные на молекулярном маркировании геномов. Применяемые для геномной регистрации человека SNP (Single Nucleotide Polymorphism)-маркеры не могут быть использованы для генетической паспортизации растений из-за их дороговизны. В настоящее время для генетического типирования используются различные типы молекулярных маркеров, каждый из которых имеет свои достоинства и недостатки (Гостимский и др., 2005; Чесноков, 2005; Хлесткина, Салина, 2006).
Для молекулярно-генетической паспортизации растений маркеры должны соответствовать ряду требований, сформулированных для сортов культурных растений (Малышев и др., 2006). В первую очередь молекулярные маркеры должны быть полиморфны, что позволяет отличить один образец от другого. Они должны стабильно наследоваться в поколениях, охватывать разные области генома, быть представлены в количестве, достаточном для идентификации как уже имеющихся, так и вновь создаваемых сортов или иных совокупностей. В настоящее время для генетического типирования используются различные типы молекулярных маркеров (RELF, RAPD, AFLP, ISSR, SSR и т.п.). При мониторинге состояния гетерогенных природных популяций редких и исчезающих видов растений для рекомендаций мер их охраны, при идентификации растительного сырья лекарственных растений важен выбор полиморфных и стабильных ДНК-маркеров.
Одним из способов молекулярной идентификации видов и изучения биоразнообразия является ДНК-штрихкодирование (Herbert et al., 2003а, б; Шнеер, 2007, 2009). В 2003 году канадский ученый П. Хеберт (Hebert et al., 2003 а) предложил использовать для видовой идентификации живых организмов короткие стандартные последовательности ДНК. ДНК-штрихкодом (ДНК-ШК - barcode) называется небольшой по размеру (до 600-800 нуклеотидов), участок генома, эволюционирующий таким образом, что его последовательность будет одинакова у особей одного вида и разной у разных видов. Процесс идентификации видов на основании стандартныной последовательности ДНК называется ДНК-штрихкодированием (DNA barcoding). В качестве стандартного участка для большинства многоклеточных организмов был принят фрагмент сох! (митохондриальный белоккодирующий ген СОЇ субъединицы 1 цитохром-с-оксидазы), соответствующий участку гена митохондриальной ДНК мыши, позиции от 58 до 705, длиной 648 пар оснований. Этот ген присутствует во всех исследованных митохондриальных геномах и содержит около 1540 нуклеотидов (Hebert et al., 2003а). Его более вариабельная 5 -половина имеет длину около 650 нуклеотидов, расположена между двумя консервативными последовательностями, к которым сконструированы стандартные праймеры, позволяющие легко амплиицировать соответствующий фрагмент ДНК большинства многоклеточных организмов (Folmer et al., 1994).
Анализ полиморфизма IRAP-маркеров A. vernalis
В данной работе для амплификации последовательностей ретротранспозонов из геномной ДНК A. vernalis использован оригинальный метод универсальных праймеров ретротранспозонов (рис. 26). В шести популяциях A. vernalis, изученных с использованием IRAP-метода анализа полиморфизма ДНК, выявлено 127 амплифицированных фрагментов, из которых 118 были полиморфными (Боронникова, 2008а). Число амплифицированных фрагментов ДНК в суммарной выборке растений варьировало в зависимости от праймера от 19 (2202) до 31 (2197). В среднем при IRAP-анализе один праймер инициировал у A.vernalis синтез 25 фрагментов ДНК. 1500 Рис. 26. IRAP-спектры A. vernalis популяции Av5 с универсальным праймером 2079 (5 -AGGTGGGCGCCA-3 ), полученный в результате использования метода универсальных праймеров ретротранспозонов; цифрами обозначены номера проб, М - маркер молекулярного веса; стрелками указаны некоторые полиморфные фрагменты ДНК; представлена часть спектра Число полиморфных фрагментов в суммарной выборке растений A. vernalis варьировало от 17 до 30, а их размеры - от 190 до 2500 пн (рис. 27). Рис. 27. IRAP-спектр популяции Л. vernalis (Av5) с праймером 2197: цифрами обозначены номера проб, М - маркер молекулярного веса, стрелками указаны некоторые полиморфные фрагменты ДНК Доля полиморфных локусов в зависимости от IRAP-праймера колебалась от 86.70% до 96.80% и суммарную выборку составила (при Р95) 92.91% (табл. 28). Уровень полиморфизма амплифицированных фрагментов ДНК A. vernalis, полученных в результате ПЦР со всеми IRAP-праймерами, колебался от 54.33% в Av4 до 77.17% в Av5 и Av6. Выявленные у A. vernalis IRAP-маркеры высокополиморфны и позволяют дифференцировать изученные популяции по данному показателю. Они стабильны, так как четко воспроизводятся при повторных амплификациях. Ожидаемая гетерозиготность по локусам в общей выборке A. vernalis составила 0.291. Эти показатели наиболее высоки в Av5, а минимальны - в Avl (рис. 28). Количество редких фрагментов ДНК варьировало по популяциям от 2 (Av2) до 13 (Av4), в среднем на выборку их число составило 13 (10.20%). Отмечены уникальные фрагменты ДНК, например, в Av2 - Avu1500IR75.
Молекулярно-генетическая паспортизация видов рода Digitalis..209 б.З.Молекулярно-генетическая паспортизация видов рода Adenophora
Для молекулярно-генетической паспортизации особей двух видов рода Adenohpora {Ad. lilifolia, Ad. triphylla) были выделены четко воспроизводимые 11 мономорфных и 11 полиморфных фрагментов ДНК. Для паспортизации рода Adenohpora мы в соответствии с разработанной нами методикой отобрали по 4 фрагмента ДНК, общих и специфических для двух видов этого рода (табл. 41). Запись фрагмента ДНК в соответствии с предложенной нами методикой молекулярно-генетической паспортизации (Боронникова, 2008а) проводилась с указанием типа фрагмента (родовой, видовой, полиморфный), длины фрагмента и указания нижним индексом праймера.
Выявленные фрагменты ДНК, общие для особей двух видов рода Adenohpora, назвались «родовыми» и обозначались первыми буквами названия рода Ad с указателем «г» от «rod» нижним индексом. Полиморфные фрагменты ДНК обозначены индексом «р» от «polimorph». Помимо буквенно-цифровой записи молекулярно-генетического паспорта популяций использовалась графическая запись в виде штрихкода (рис. 39).
Как указывалось нами ранее (Боронникова, 2008а) общие для двух видов рода Adenohpora фрагменты ДНК являются надвидовыми, среди них могут быть как присущие роду, так и более высоким таксонам, но мы предлагаем оставить название «родовые», имея в виду, что эти фрагменты четко воспроизводятся у особей изучаемого рода.
В соответствии с методикой молекулярно-генетической паспортизации для штрихкода использовалось от 10 до 12 штрихов, из которых четыре характерны для рода, четыре - для вида, а от одного до четырех популяции (табл. 41).
Пример генетического паспорта и штрихкода популяции Ad. lilifolia приведен в приложении 3.
Итак, основным результатом заключительных этапов методики генетической паспортизации является механизм обобщения данных молекулярно-генетического анализа посредством выявления идентификационных маркеров. Результаты кластеризации представляются в обобщенном виде молекулярно-генетической формулы и штрихкода, вносятся наряду с общепринятыми показателями состояния популяции и характеристикой ее генофонда в генетический паспорт. Генофонд популяции документируется в виде формул и штрихкода, отражающих состав аллелей в отдельных локусах генома. Новый принцип составления и записи молекулярно-генетической формулы основан на выявлении идентификационных маркеров ДНК с использованием ISSR- и IRAP-методов анализа полиморфизма ДНК, охватывающих большую часть геномов растений и пригодных для генетической паспортизации мало генетически изученных видов растений. Новый способ записи содержит полную информацию об идентификационном молекулярном маркере, включая вид растения, тип молекулярного маркера, его размер и характеристику исследуемой части генома посредством указания метода анализа полиморфизма ДНК и номера или последовательности праймера. Методика генетической паспортизации на основе ISSR- и IRAP- маркеров имеет высокую разрешающую способность, дает стабильно воспроизводимые результаты, характеризуется высоким уровнем стандартизации, как набора маркеров, так и техники выполнения анализа. Именно использование IRAP-вместе с ISSR-маркерами позволило нам провести паспортизацию гетерогенных природных популяций редких реликтовых видов растений. Данная методика может найти применение как при разработке мер охраны и восстановления природных популяций, так и при идентификации растительного сырья лекарственных растений, является относительно недорогой и при наличии эффективных IRAP-праймеров пригодна для массового анализа. С использованием разработанной методики молекулярно-генетической паспортизации составлены молекулярно-генетические формулы и штрихкоды 22 популяций 12 видов растений.
В процессе реализации глобального международного проекта «Штрихкод жизни» (www.barcoding.si.edu), большое значение, на наш взгляд, имеет разработка метода мультилокусного ДНК-фингерпринтинга на основе ретротранспозонов, который имеет перспективу стать одним из методов для штрихкодирования сложнейших геномов растений. Ретротранспозоны соотвествуют большинству предъявляемых к штрихкоду требований, но поиск самой последовательности ДНК «одинаковой у одного вида, но разной у разных видов» (Hebert et al., 2003а) для растений еще впереди.
Таким образом, на данном этапе развития молекулярно-генетических исследований редких и исчезающих видов растений, своевременна и приемлема предложенная нами методика молекулярно-генетической идентификации и паспортизации редких видов растений, которая позволяет установить уровень и состав генетического разнообразия на популяционном уровне, выявить идентификационные молекулярные маркеры, составить молекулярно-генетическую формулу, штрихкод и генетический паспорт популяции, то есть оптимизировать процедуру сохранения генофондов редких и нуждающихся в охране видов растений.
