Содержание к диссертации
Введение
1. Материал и методика исследований 8-17
2. Биологические особенности семян дикорастущих видов флоры Приморского края 18-41
2.1. Структурные особенности семян 20
2.1.1. Внешнее строение 20-25
2.1.2. Внутреннее строение 25-27
2.2. Особенности прорастания семян 27-35
2.3. Влажность семян 36-37
2.4. Всхожесть семян 38-41
3. Хранение семян дикорастущих видов флоры Приморского края 42-54
3.1. Хранение в лабораторных условиях 45
3.1.1. Хранение семян ортодоксального типа 45-49
3.1.2. Хранение семян рекальцитрантного типа 49-51
3.2. Хранение при низкой положительной температуре 52-54
4. Влияние глубокого замораживания на всхожесть семян дикорастущих видов флоры Приморского края 55-90
4.1. Хранение семян в жидком азоте в течение 24 часов 58
4.1.1. Реакция семян различных видов классов однодрльных и двудольных 58-72
4.1.2. Реакция семян видов сем. Fabaceae 72-83
4.2. Хранение семян в жидком азоте в течение 30 дней 84-86
4.3. Хранение семян в жидком азоте в течение 3 лет 87-90
5. Морфолого-биологические особенности растений, выращенных из семян после их замораживания и хранения в жидком азоте 91-122
5.1. Лианы 92-99
5.2. Кустарники 99-111
5.3. Травянистые растения 112-122
Выводы 123-124
- Особенности прорастания семян
- Хранение при низкой положительной температуре
- Хранение семян в жидком азоте в течение 30 дней
- Кустарники
Введение к работе
В настоящее время проблема сохранения биологического разнообразия приобрела большое значение и признана одной из ключевых. Биологические ресурсы являются основой для поддержания экологических условий существования и экономического развития человеческого общества. Согласно международной Конвенции о биологическом разнообразии (1995), принятой и подписанной 5 июня 1992 г. на Конференции ООН по окружающей среде и развитию в Рио-де-Жанейро, фиторесурсы государств, присоединившихся к конвенции, объявлены национальной собственностью. В связи с интенсивными темпами деградации флоры под влиянием антропогенных факторов и техногенных катастроф объектами пристального внимания становятся редкие и исчезающие виды, эндемики, полезные дикорастущие растения (например, лекарственные, декоративные), численность которых резко уменьшается.
Одна из главных задач ботанических садов - это сохранение генетического разнообразия растительного мира своих регионов (Стратегия ботанических садов ..., 1994). Согласно Конвенции о биологическом разнообразии (1995), охрана растений может осуществляться как в форме in situ, т.е. в местах обитания видов в пределах экосистем или естественной среде, так и в форме ex situ, т.е. путем создания и поддержания условий, необходимых для сохранения компонентов биоразнообразия за пределами экосистем и популяций видов. Деятельность ботанических садов должна быть направлена на сохранение живых образцов (коллекции растений), семян, пыльцы, вегетативных частей побегов, культуры тканей и клеток (Международная программа ..., 2000). Хранение генетического материала природной флоры в виде семян является одним из самых распространенных, практичных и эффективных способов охраны ex situ (Hawkes, 1990). За
последние 30 лет организации и институты, занимающиеся изучением растительных ресурсов, накопили огромный опыт в этой области. Семена являются удобным средством рационального хранения разнообразия растений, и создание генных банков имеет свои преимущества: образцы семян занимают незначительный объем, требуют небольшого ухода и остаются жизнеспособными в течение долгого времени. Во многих ботанических садах мира созданы банки семян местных видов растений. По последним подсчетам BGCI (Международный совет ботанических садов по охране растений) более чем в 200 садах налажено долговременное хранение семян (Международная программа ..., 2000). Международным институтом генетических ресурсов растений (IPGRI) рекомендованы режимы хранения -4°С и -18°С, влажность ортодоксальных семян 7-8 % (Laliberte, 1997). Международным советом ботанических садов по охране растений для хранения семян предлагаются низкие положительные температуры +5°С и неглубокое замораживание - до -20°С (Botanic gardens ..., 1987). Температурные режимы, рекомендованные международными организациями для банков семян, замедляя процессы метаболизма, продлевают жизнь семян, но не обеспечивают их длительного хранения, со временем может происходить снижение жизнеспособности, приводя к потере ценного генетического материала. В настоящее время наиболее долговременное сохранение геномов возможно в криобанках, где в замороженном состоянии при температуре жидкого азота (-196°С) в виде семян или других органов хранится информация о структурном и функциональном разнообразии растений. Изучение возможности криоконсервации семян дикорастущих видов началось сравнительно недавно - в начале 80-х годов XX века, но уже очевидно, что это перспективный способ сохранения генетических ресурсов растительного мира (Stanwood, 1985; Тихонова, 1999 а).
Во флоре Приморского края насчитывается 149 редких и исчезающих растений (Харкевич, Качура, 1981), из них 78 внесено в Красную книгу РСФСР (1988). Многие местные виды обладают полезными свойствами (лекарственные, декоративные, пищевые, медоносные, кормовые и др.).
Массовые заготовки и систематический сбор таких растений в их естественных местообитаниях наносят значительный ущерб природным популяциям, и виды, которые кажутся благополучными, могут перейти в категорию редких. По данным С.С. Харкевича (1997), в 6 заповедниках Приморского края сосредоточено более 1800 видов флоры, однако почти 800 еще не обеспечены этой формой охраны. Таким образом, традиционные способы охраны in situ не могут обеспечить сохранение биоразнообразия дикорастущих растений. В данной ситуации вполне реальным представляется долговременное хранение семян в банках, при создании которых необходимо учитывать все характерные особенности семян, обращая внимание на качество консервируемого материала. Изучение биологии прорастания и применение определенных методов проращивания семян позволит получить растения, которые, пройдя полный цикл развития, дадут полноценное потомство. До настоящего времени метод криоконсервации семян видов флоры Приморского края не применялся, и не изучалась толерантность семян к замораживанию в жидком азоте, что и определило выбор темы диссертационной работы.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - изучить биологические особенности и толерантность семян к замораживанию при температуре жидкого азота (-196°С) и оценить возможность применения криоконсервации как метода долговременного хранения.
В соответствие с поставленной целью нам предстояло решить следующие задачи:
1. Изучить биологические особенности семян.
2. Изучить влияние положительных температур хранения на жизнеспособность семян.
3. Изучить реакцию семян на замораживание при температуре жидкого азота и проанализировать влияние различных режимов охлаждения на всхожесть семян.
4. Изучить и проанализировать влияние глубокого замораживания семян на рост и развитие растений, на их репродуктивную способность и всхожесть семян в первом поколении.
5. Разработать научно обоснованные рекомендации по хранению семян. Научная новизна. Разработаны методы преодоления покоя семян 4 видов.
Для 11 видов лесных травянистых многолетников впервые установлены стадия развития зародыша в зрелом семени и период его полной дифференциации, тип покоя семян и температурные условия прорастания. Для семян ортодоксального и рекальцитрантного типа определены сроки хранения в лабораторных условиях. Впервые оценка возможности криоконсервации семян осуществлена на основе комплексного подхода, который включает замораживание семян с разной скоростью, изучение всхожести деконсервированного материала, выращивание растений из размороженных семян и получение семенного потомства в первом поколении. Впервые проведены сравнительные исследования роста и развития растений, выращенных из семян после хранения в жидком азоте, и разработаны методические основы оценки влияния глубокого замораживания на сохранение генетической стабильности семян дикорастущих кустарников.
Практическая ценность. Материалы изучения биологических особенностей семян, сроков хранения в лаборатории и условий продления их жизнеспособности в полном объеме были учтены при подготовке коллективной монографии «Размножение редких видов растений Приморского края» (Воронкова, Нестерова, Журавлев, 2000). Информация о типах покоя семян и особенностях их прорастания может быть использована при решении вопросов интродукции и реинтродукции редких и полезных видов. Полученные данные об изменении всхожести при хранении могут быть рекомендованы для подбора оптимальных способов и условий хранения семян. Результаты изучения влияния криообработки на всхожесть деконсервированных семян, рост и развитие растений могут служить основой создания криобанка зародышевой плазмы, в первую очередь редких и исчезающих дальневосточных растений.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на всесоюзных совещаниях «Консервация генетических ресурсов» (г. Пущино, 1991, 1994, 1998, 2002), расширенном заседании Ученого совета Ботанического сада-института ДВО РАН (1995, 1998, 2001, 2003), 49-х Комаровских чтениях (г. Владивосток, 1996), Международной конференции «Леса и лесообразовательный процесс на Дальнем Востоке» (г. Владивосток, 1999), на заседании «Круглого стола» IV Дальневосточной конференции по заповедному делу (г. Владивосток, 1999), II международной научной конференции «Растения в муссонном климате» (г. Владивосток, 2000).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 27 работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 5 глав, выводов, приложения, списка литературы, содержащего 244 наименования, в том числе 73 источника на иностранных языках. Работа изложена на 150 страницах машинописного текста, включает 25 таблиц и 27 рисунков.
Благодарности. За помощь в проведении экспериментов по замораживанию семян в жидком азоте автор выражает благодарность сотрудникам лаборатории криоконсервации генетических ресурсов Института биофизики клетки РАН (г. Пущино), особенно ст.н.с. Светлане Георгиевне Яшиной.
Особенности прорастания семян
При оптимальных температурных условиях, хорошей аэрации, достаточной влажности прорастание семян большинства дикорастущих растений затруднено, т. к. они находятся в состоянии органического покоя. Это свойство имеет приспособительное значение, способствуя переживанию видами периодов, неблагоприятных для дальнейшего развития проростков. Причины, вызывающие покой, разнообразны, и, в связи с этим, семена, находящиеся в состоянии покоя, имеют специфический характер прорастания. На основании изучения причин и способов преодоления торможения прорастания М.Г. Николаевой (1967) была разработана классификация типов органического покоя семян, которая, по мере пополнения сведений о семенах, постепенно изменялась и совершенствовалась (Николаева, 1979, 1982; Николаева и др., 1985). Определение типа покоя и применение соответствующего способа предпосевной подготовки облегчает проращивание семян. Затрудненное прорастание семян может быть связано со свойствами кожуры. Многие виды сем. Fabaceae флоры Приморского края имеют семена с твердой водонепроницаемой кожурой, что обуславливает экзогенный физический покой - Аф (Николаева и др., 1985), который нередко обозначается термином «твердосемянность». По мнению А.В. Попцова (1976), твердосемянность характеризуется полной остановкой ростовых процессов. Физический покой вызывается особенностями строения семенной кожуры: наличием кутикулы и сильно развитой палисадной эпидермы. После нарушения целостности семенных покровов твердые семена приобретают способность к набуханию (поглощению воды) и быстро прорастают при благоприятных условиях. М.В Ракова (1974), работая с бобовыми, обнаружила, что семена видов этого семейства обладают разнокачественостью по характеру покоя, или различной степенью твердосемянности. Такая разнокачественность обусловлена длительным периодом цветения и плодоношения, а, значит, при заготовке семян большое значение будет иметь календарная дата их сбора. Глубина физического покоя зависит не только от вида и степени зрелости семян, но также от района сбора, погодных условий периода созревания и последующего хранения (Попцов, 1976; Rolston, 1978; Тихонова и др., 1984; Ellis etal., 1987).
Преодолеть физический покой можно посредством различных обработок семян: ошпаривание кипятком, перетирание с песком, замачивание в концентрированной серной кислоте (Seed of woody ..., 1974; Попцов, 1976). Проращивая семена 13 видов дикорастущих бобовых флоры Приморского края без обработки, мы обнаружили, что у некоторых видов (Astragalus membranaceus, A. uliginosus, Glycyrrhiza pallidiflora, Trifolium lupinaster) доля твердых семян в образце может превышать 90 %, и лишь 2-3 % прорастают за 1,5-2 месяца. Семена отдельных видов (Hedysarum ussuriense) при более длительном периоде проращивания постепенно выходят из состояния покоя, и свыше 90 % прорастают через 5 месяцев. После обработки концентрированной серной кислотой семена Astragalus membranaceus, видов Lespedeza, Oxytropis chancaensis и других бобовых в лабораторных условиях начинали активно прорастать уже через 1-2 дня, и в течение 3-4 дней проросло от 50 % до 100 % семян. Через 3-4 дня после обработки прорастали семена Glycyrrhiza pallidiflora. Однако процесс прорастания протекал менее активно, и через 40-45 дней всхожесть составила 49-67 %. Наши исследования показали, что в некоторых случаях для устранения физического покоя недостаточно однократной обработки концентрированной серной кислотой, и у ряда видов (Glycyrrhiza pallidiflora, Astragalus uliginosus) более 60-80 % семян могут оставаться твердыми. Дополнительная обработка позволяет у одних видов снизить долю твердых семян (Glycyrrhiza pallidiflora), у других - полностью устранить твердосемянность (Oxytropis chancaensis, Lespedeza davurica) (рис. 2). После двукратной обработки полностью устраняется физический покой семян редких видов леспедец - Lespedeza cyrtobotrya, L. tomentosa (Холина и др., 1996; Нестерова и др., 1998). Все семена Glycyrrhiza pallidiflora выходят из состояния покоя после трехкратной обработки серной кислотой, но при этих же условиях около 20 % семян Astragalus uliginosus еще остаются твердыми (рис. 2). Прерывание покоя и активность прорастания семян у отдельных видов Fabaceae связаны не только с устранением водонепроницаемости кожуры. Среди изученных нами видов бобовых для Thermopsis lupinoides была отмечена стимуляция прорастания обработанных кислотой семян после воздействия переменных температур: при смене температуры проращивания с +(8-10) на +22C через 40 дней опыта все набухшие, но не проросшие семена прорастали полностью в течение 2 дней (Нестерова и др., 1996). В литературе (Мельникова, 1975, 1977) приводятся результаты положительного влияния переменных температур на прорастание семян Th. lanceolata R. Br. и Th. altemiflora Regel et Schmalh. Учитывая необходимость применения переменных температур для успешного проращивания семян Th. lupinoides, мы исследовали влияние смены температурного режима на прорастание семян с неповрежденной кожурой и семян, обработанных серной кислотой, а также определили минимальный период охлаждения, после которого в тепле (+22С) всхожесть семян была наибольшей. Исследования показали, что всхожесть необработанных семян во всех вариантах опыта не превышала 5 % через 90 дней проращивания (табл. 3). Семена, обработанные кислотой, после пятидневного охлаждения в тепле проросли более чем на 90 % через неделю, а после 10- и 15-дневного охлаждения свыше 90 % семян в тепле проросли через сутки. Следовательно, при наличии неповрежденных (водонепроницаемых) покровов смена температуры не выводит семена Th. lupinoides из состояния физического покоя, но после устранения твердосемянности охлаждение приводит к массовому прорастанию семян в тепле. Судя по результатам опыта, семена Th. lupinoides, вероятно, имеют комбинированный покой - экзогенный и эндогенный, т.е. наряду с физическим покоем действует и иной механизм, тормозящий прорастание семян. А.В. Попцов (1976) приводит примеры комбинированного покоя, когда к явлениям твердосемянности присоединяется более или менее глубокий физиологический покой. Так, четырем видам Cercis L. требуется двухэтапная подготовка семян к прорастанию: обработка серной кислотой в течение 30 мин и последующая стратификация при +(3-4)С в течение 1,5-2 месяцев.
В наших опытах семенам Th. lupinoides потребовалось 10-15 дней стратификации при пониженной температуре +(8-10)С, что соответствует характеристике неглубокого физиологического покоя, «нарушение которого происходит под влиянием кратковременного охлаждения (в течение часов, суток, недель) набухших семян» (Николаева и др., 1985: 21). Таким образом, семена 77г. lupinoides характеризуются комбинированным типом покоя Аф-Bj, для преодоления которого следует сочетать обработку семян серной кислотой (для устранения экзогенного покоя) с последующей стратификацией при +(8-10)С в течение 10-15 дней (для снятия физиологического покоя). После обработки семена этого вида успешно прорастают при температуре +22С. Задержка прорастания семян может быть связана со свойствами зародыша - его морфологической недоразвитостью или особым физиологическим состоянием, что обуславливает эндогенный органический покой - морфологический, физиологический, морфофизиологический (Николаева и др., 1985). Зрелые семена многих видов флоры не прорастают, т.к. имеют зародыш, дифференциация которого не завершена к моменту опадания семян с материнского растения и он остается маленьким в сравнении с массивным эндоспермом (Попцов и др., 1981). В семенах такого типа рост и окончательная дифференциация зародыша на осевую часть и семядоли происходит после диссеминации, в/на почве, в течение определенного периода времени, продолжительность которого видоспецифична. В хвойно-широколиственных лесах Дальнего Востока, по мнению И.В. Грушвицкого (1961), число видов, образующих семена с недифференцированным зародышем, составляет 18-22 %. Наши исследования внутреннего строения зрелых семян лесных травянистых многолетников, а именно, стадии развития зародыша, и наблюдения за прорастанием позволили установить время необходимое для завершения постэмбрионального развития недифференцированных зародышей - период доразвития и определить тип эндогенного покоя семян (табл. 2). У всех исследованных видов, несмотря на различную продолжительность периода доразвития от 40-50 (Asarum sieboldii) до 115-120 дней (Epimedium macrosepalum), дифференциация зародышей происходит в течение летне-осеннего периода вегетации.
Хранение при низкой положительной температуре
Результаты исследований свидетельствуют о том, что период хранения семян можно продлить, ограничивая воздействие факторов внешней среды, главным образом, температуры и влажности воздуха (Крокер, Бартон, 1955; Barton, 1961; Илли, 1982). Подбирая условия хранения, можно значительно увеличить время сохранения жизнеспособности семян. Основные требования длительного хранения - это снижение влажности семян, низкая температура хранения, изоляция семян от внешней среды (герметизация). Герметизация семян позволяет поддерживать их влажность на определенном уровне. В большинстве случаев содержание воды в семенах не должно быть выше 5-9 % (Николаева и др., 1999). Чем ниже влажность и температура при хранении, тем слабее протекают процессы обмена веществ в семенах, и тем дольше они хранятся. В условиях низких положительных (около 0С) и отрицательных температур длительное сохранение жизнеспособности возможно лишь при низком содержании влаги в семенах (Barton, 1961). Результаты наших исследований всхожести семян с равновесной влажностью 5-10 % (в зависимости от вида), хранившихся при +5С в герметичной упаковке, показывают, что после 11 лет остались всхожими от 88 до 95 % семян Lilium buschianum, L. cernuum, L. pumilum (табл. 6), тогда как при хранении в лабораторных условия спустя 2 года оставалось только 20-30 % жизнеспособных семян. За 10,5-11 лет всхожесть Bergenia pacifica, Rhododendron mucronulatum, Rh. mucronulatum subsp sichotense, Deutzia amurensis снизилась на 10-14 %, а при хранении в лаборатории семена этих видов теряли жизнеспособность через 4 года. Спустя 10,5-11 лет лишь на 3-7 % изменилась всхожесть семян Dioscorea nipponica, Hypericum attenuatum, Weigela praecox, на 12 % - Pinus densiflora. Семена, хранившиеся 6,5-7,5 лет, потеряли не более 10 % всхожести (Filifolium sibiricum и др.). Практически не изменилась за 5 лет всхожесть семян Deutzia glabrata, но за этот период на 15-23 % снизилась всхожесть Celastrus orbiculata и Parthenocisus tricuspidata (табл. 6). Таким образом, сроки хранения семян ортодоксального типа с равновесной влажностью (5-Ю %) в условиях лаборатории ограничиваются в среднем 3-4 годами {Bergenia pacifica, Lilium buschianum и др.), у отдельных видов всхожесть сохраняется до 7 лет {Pinus densiflora, Filifolium sibiricum). Герметизация и хранение при +5С позволяют увеличить период жизнеспособности семян максимально до 10,5-11 лет. Хранение в лаборатории в течение 2-5 месяцев после сбора семян рекальцитрантного типа, характеризующихся высокой влажностью (50-70 %) в момент созревания, приводит к полной потере всхожести.
Семена такого типа во влажном состоянии можно хранить 7-8 месяцев при +5С {Quercus dentata). По мнению Е Ross, одного из авторов Национальной программы сохранения растительной зародышевой плазмы в США, низкие положительные температуры обеспечивают хранение семян в течение 5-10 лет, при неглубоком замораживании всхожесть сохраняется 10-20 лет. Замораживание в жидком азоте (-196С), или криоконсервация, новый метод, который дает потенциал для значительного продления жизнеспособности семян (Roos, 1989). Известно, что температура -196С обладает уникальными консервирующими свойствами и гарантирует практически неограниченную продолжительность анабиоза биологических систем, т.к. при глубоком замораживании прекращается всякая биологическая деятельность и химическая активность (Федосенко, 1978). О способности семян выдерживать температуры -200С и ниже было известно в конце XIX века. Эксперименты показали, что воздушно-сухие семена (влажность 10-12 %) ряда высших растений сохраняли всхожесть после замораживания в течение ПО часов при температуре жидкого воздуха (-189Сдо -193С), а некоторые семена в течение 1-6 часов выдерживали температуру жидкого водорода (-250С) (цит. по Lipman, Lewis, 1934). Позднее сообщалось об успешном проращивании семян после 30-ти и 60-ти дней замораживания в жидком воздухе, и даже экспозиция при 1-4К в течение 44 часов не оказала влияния на способность семян давать нормальные всходы (Lipman, Levis, 1934; Lipman, 1936). В техническом отношении наиболее удобно хранить семена в жидком азоте или в парах над ним (от -Т50С до -160С) (Стенвуд, Бэсс, 1983). Криоконсервация семян первоначально развивалась для сохранения генетических ресурсов культивируемых видов. К настоящему времени у многих экономически важных растений изучена всхожесть семян после замораживания, режимы замораживания/отогревания, возможные повреждения тканей семян (Stanwood, Bass, 1981; Stanwood, 1985; Молодкин, 1987). Ведутся активные работы по исследованию влияния глубокого замораживания на рост, развитие и продуктивность сельскохозяйственных растений (Стрибуль, Лесив, 1990; Стрибуль, Тымчук, 1992). Так как утрата естественной среды обитания угрожает многим видам мировой флоры, интерес к криоконсервации зародышевой плазмы дикорастущих растений усиливается. В разных странах исследуется возможность использования жидкого азота для хранения семян редких, исчезающих и полезных растений аборигенной флоры. В Цинциннати (США, штат Огайо) проведено изучение влияния криоконсервации на всхожесть семян 237 видов флоры штата и сделан вывод, что 25 % видов, приведенных для Огайо, могли бы легко приспособиться к криохранению (Репсе, 1991). В Западной Австралии семена 90 видов редких и исчезающих растений хранили в жидком азоте, и не было отмечено отклонений в способности видов выдерживать криоконсервацию. Исследования показали, что успех криоконсервации зависит от сочетания физических и химических свойств семян (Touchell, Dixon, 1993, 1994). В Китае изучается возможность криоконсервации генетической плазмы деревянистых видов и декоративных травянистых растений. Полученные результаты позволили рекомендовать широко использовать глубокое замораживание для хранения семян (Wang Junhui, Huang Chunnong, 1998; Chen Liguang, Zheng Yushan, 2000; Liu Yan, Zhou Hui, Fang Biao, 2001). Ведется активная работа по криохранению семян в Польше (Chmielarz, 1998), Испании (Gonzalez-Benito et al., 1998 b, с; Iriondo et al., 1992; Pita et al., 1997, 1998), Канаде (Styles et al., 1982). Исследования по выяснению возможностей хранения семян дикорастущих растений при сверхнизких температурах в нашей стране начались относительно недавно.
Первые опыты по криоконсервации семян видов флоры европейской части России были начаты в 1984 году во ВНИИ охраны природы и заповедного дела совместно с Институтом биологической физики АН СССР и Институтом почвоведения и фотосинтеза АН СССР (Тихонова, 1988; Банник, Яшина, 1990). В Главном ботаническом саду РАН с 1986 г. в режиме глубокого замораживания хранятся семена 160-ти дикорастущих видов: охраняемых, лекарственных, декоративных и других (криобанк создан на технической базе ИФР РАН) (Тихонова, 2001). В настоящее время изучено влияние глубокого замораживания на жизнеспособность и особенности прорастания семян (Тихонова и др., 1989 а, 1990, 1997 б, в; Далецкая и др., 1990; Викторов, Тихонова, 1994; Лянгузова, Мазная, 1998; Тихонова, 1999 а, б; Тихонова, Баранова, 2000); на семенах ряда видов исследована активность гиббереллиноподобных веществ, а также активность и ферментный состав кислой фосфатазы (Далецкая, Полякова, 1994); изучено влияние криоконсервации на частоту хромосомных аббераций (Тихонова и др., 1996; Баранова, 2001). Имеются данные о всхожести семян после замораживания в жидком азоте некоторых редких и древесно-кустарниковых видов украинской флоры (Комир и др., 1987; Мануильский, 1992) В последнее десятилетие появились работы, посвященные исследованию влияния криоконсервации на всхожесть семян дикорастущих растений Дальнего Востока России - представителей флоры Приморского края, Магаданской и Камчатской областей, Курильских островов (Нестерова, Яшина, 1994; Нестерова, Хоменко, 1995; Нестерова, 1998 а, б; Андриянова, Беркутенко, 1999; Воронкова и др., 2000, 2003; Нестерова, Яшина, 2000; Холина, Воронкова, 2001; Нестерова и др., 2002). Однако подобных работ немного и количество изученных видов невелико. В данной главе обобщены полученные нами экспериментальные материалы по исследованию криоустойчивости семян 38 представителей флоры Приморского края (54 образца), относящихся к 23 родам, 14 семействам - это 3 вида деревьев, 13 - кустарников, 6 - лиан, 16 - травянистых растений. Из них 22 вида внесено в региональный список редких растений (Харкевич, Качура, 1981), 13 - в Красную книгу РСФСР (1988). При сборе генофонда вида для последующего хранения необходимо охватить его морфологическое, функциональное, адаптационное разнообразие (Тихонова, 1985), поэтому информация, содержащаяся в семенах, собранных в конкретных природных ценопопуляциях, имеет очень важное значение.
Хранение семян в жидком азоте в течение 30 дней
После замораживания и хранения в течение 30 дней при температуре -196С исследовали лабораторную всхожесть семян 8 видов флоры Приморского края, принадлежащих к 5 семействам. Метрические величины, характеризующие исследованные образцы семян, значительно отличались в зависимости от вида (табл. 12). Минимальная масса 1000 семян отмечена у Rhododendron schlippenbachii (менее 1 г), максимальная - у Princepia sinensis (более 250 г). Наибольшая разница значений равновесной влажности семян не превышала 4,3 %. После 30 дней хранения в азоте глубокое замораживание оказало влияние только на семена Celastrus orbiculata (табл. 13). У этого вида наблюдалось достоверное снижение всхожести размороженных семян по сравнению с контролем. Всхожесть семян других 7 видов осталась на уровне контроля (изменение не подтвердилось после статистической обработки результатов), следовательно, хранение в жидком азоте в течение 30 дней не повлияло на их всхожесть. Мы полагаем, что всхожесть семян Celastrus orbiculata снизилась из-за их низкого качества. Размеры, масса 1000 штук (табл. 12), всхожесть в контроле (табл. 13) у испытанного образца были значительно ниже по сравнению с таковыми показателями образца семян, замороженного на 24 часа (табл. 7 и 8). Семена, замороженные на 30 дней, были мельче и легче на 2,8 г и имели низкую начальную всхожесть. Это, по-видимому, отрицательно отразилось на их всхожести после хранения в жидком азоте. Подобные результаты были получены при замораживании семян Leucanthemum vulgare Lam. (Тихонова и др., 1990). Семена многих дикорастущих травянистых видов флоры европейской части России переносят замораживание в течение одного месяца, не изменяя всхожести. У некоторых видов (Campanula justiniana Wit, С. rotundifolia L., Polemonium caeruleum L., Potentilla tanaitica N. Zing., Saponaria officinalia L., Tanacetum vulgare L. и др.) всхожесть увеличивается, кроме того, есть виды (Anthericum ramosum L., Convallaria majalis L., Coronaria flos-cuculi (L.) A. Br., Parnassiapalustris L., Rhaponticum carthamoides (Willd.) Iljin и др.), семена которых частично гибнут после криоконсервации и, в связи с этим, наблюдается снижение всхожести (Тихонова и др., 1990, 1992, 1996, 1997 б в; Викторов, Тихонова, 1994; Халипова, 1999). Семена деревьев и кустарников также по-разному реагируют на глубокое замораживание и хранение в течение 30 дней. Так, из 13 изученных видов семейства Caprifoliaceae у 11 видов не изменялась лабораторная всхожесть семян, и только у двух наблюдалась их частичная гибель (Тихонова, 1999 б). Семена Pinus nigra Arnold ssp. salzmanni (Dunal) Franco и Pinus sylvestris L. var. iberica Svor. не имели существенной разницы всхожести до и после криоконсервации, только на жизнеспособность семян Pinus pinea L. замораживание оказало негативное влияние (Pita et al., 1997, 1998).
После хранения в азоте не изменилась всхожесть семян Betula celtiberica (Iriondo et al., 1992). В то же время, есть сведения, что семена одного и того же вида, собранные в разных природных популяциях или с одних и тех же растений в разные годы, могут неоднозначно реагировать на криоконсервацию (Тихонова и др., 1991, 1996). Поэтому при организации банков долговременного хранения семян генофонд вида должен быть представлен генетически разнородным материалом из различных природных местообитаний. Семена 10 видов флоры Приморского края, замороженные с разной скоростью, хранили в азоте три года, причем, долговременное хранение было продолжением эксперимента по замораживанию и хранению семян в течение 24 часов. Поэтому при исследовании всхожести после длительной криоконсервации для сравнения использовали данные, полученные при изучении прорастания семян после кратковременного хранения в азоте, т. к. эксперименты по замораживанию "24 часа" и "3 года" проводили на одних и тех же образцах семян. Долговременное хранение привело к снижению всхожести размороженных семян Aristolochia manshuriensis более чем на 50 %, но не вызвало изменения всхожести семян Dioscorea nipponica (образцы хранились 3 года) (табл. 14). У Filifolium sibiricum в варианте быстрого замораживания после трех лет хранения наблюдалось дальнейшее достоверное снижение всхожести семян еще на 19 %, а в варианте медленного замораживания отмеченное снижение статистически не подтвердилось. Всхожесть семян Lilium pensylvanicum после трех лет хранения достоверно не изменилась по сравнению с кратковременным хранением. Однако в варианте быстрого замораживания она была ниже на 21 % по сравнению с первоначальным значением. У Lilium pumilum отмечено существенное снижение всхожести после 24 часов хранения в жидком азоте только в варианте быстрого замораживания, а после 3 лет всхожесть достоверно снизилась в обоих вариантах опыта. В итоге у выше перечисленных 4 видов наблюдалась значительная разница между всхожестью до замораживания и после трех лет хранения в жидком азоте. Анализ всхожести семян, изученных представителей родов Bergenia, Philadelphiis, Platycodon, Weigela, после криоконсервации разной продолжительности показал, что ее некоторые изменения в зависимости от скорости охлаждения семян статистически не подтвердились, следовательно, их всхожесть после трех лет хранения осталась на уровне первоначального значения. Несмотря на отмеченное выше снижение всхожести, семена изученных 10 видов перенесли замораживание и долговременное хранение в жидком азоте и сохранили жизнеспособность. Ранее полученные результаты исследования всхожести и жизнеспособности семян травянистых дикорастущих растений европейской части России после различной экспозиции в жидком азоте (наибольший срок хранения до 6 лет) показали, что срок замораживания, в основном, не влияет на изменение жизнеспособности семян большинства видов (Тихонова и др., 1990; Тихонова, 1992). Однако у некоторых видов {Campanula rapunculoides L., Valeriana officinalis L., Rhaponticum carthamoides (Willd.) Iljin) было обнаружено снижение всхожести, тогда как у других {Campanula cervicaria L., Campanula glomerata L.) наблюдали повышение всхожести семян с увеличением периода хранения (Тихонова и др., 1991; Тихонова и др., 1997 б).
После криоконсервации в течение 6-9 лет на исходном уровне сохранилась жизнеспособность семян-микробиотиков {Anemone sylvestris L., Pulsatilla patens (L.) Miller, Tussilago farfara L.), причем скорость замораживания не влияла на всхожесть (Тихонова и др., 1997 а). Результаты, полученные после проращивания семян Picea abies (L.) Karst, хранившихся в жидком азоте один час, шесть месяцев, двенадцать месяцев и два года, не показали существенного различия между вариантами - около 90 % семян остались всхожими (Chmielarz, 1998). Результаты наших экспериментов показывают, что криоконсервация семян может применяться для многих видов флоры Приморского края. Низкая влажность, которую приобретают семена при хранении в условиях лаборатории через 1-3 месяца, исключает применение специальных методов предварительного подсушивания (Воронкова и др., 1999). Равновесная влажность воздушно-сухих семян, использованных в экспериментах по глубокому замораживанию, колебалась от 5,4 % до 10,4 % (табл. 7, 9 и 12), и они остались жизнеспособными после 24 часов, 30 дней и 3 лет хранения в азоте. Наши результаты подтверждают данные, которые были получены ранее, после изучения влияния криоконсервации на жизнеспособность семян других видов растений (Тихонова и др., 1991, 1996, 1997 в; Iriondo et al., 1992; Chaudhury, Chandel, 1995; Gonzalez-Benito et al., 1998 c). Таким образом, криоконсервация семян дикорастущих растений Приморского края (38 видов) с равновесной влажностью от 5,4 % до 10,4 % в течение 24 часов, 30 дней и 3 лет не вызывает полной потери всхожести. Криоустойчивость семян исследованных видов неоднозначна: у ряда видов независимо от скорости охлаждения лабораторная всхожесть размороженных семян либо повышается (например, Celastrus flagellaris, Astragalus uluginosus), либо снижается (например, Filifolium sibiricum), при этом может изменяться динамика прорастания. Выявлена группа видов {Bergenia pacifica, Deutzia amurensis, Lespedeza tomentosa и др.), у которых всхожесть семян и динамика прорастания остаются без изменений (на уровне контроля). Семена некоторых видов (Parthenocissus tricuspidata, Oxytropis chancaensis и др.) реагируют только на определенную скорость замораживания. Замораживание в жидком азоте не оказывает влияния на период холодной стратификации семян представителей флоры Приморского края характеризующихся физиологическим {Ampelopsis japonica и др.) или комбинированным (Cerasus sargentii и др.) типом покоя. В зависимости от вида и скорости охлаждения твердосемянность бобовых после однократного замораживания снижается от 2 % до 100 %. Для семян некоторых видов семейства Fabaceae испытанные скорости замораживания являются стрессовой ситуацией, в результате чего развивается от 1 % до 79 % аномальных проростков с повреждениями семядолей, зародышевого корешка и гипокотиля, причем медленное замораживание приводит как к снижению, так и к увеличению доли поврежденных проростков.
Кустарники
Microcerasus humilis. Стратифицированные семена прорастали одновременно и в контроле, и после замораживания в жидком азоте. Прорастание подземное, на поверхность почвы выходит побег, растение развивается быстро. В конце первого вегетационного сезона сеянцы достигали высоты в опыте 16,4 см, в контроле - 17,3 см (разница недостоверна, т.к. t=l,18 при n=20, Р=95 %) и имели 1-2 боковых побега. В течение двух последующих лет в контроле и опыте увеличивались высота растений, размеры листьев, число боковых побегов. Прегенеративный период длился 3-4 года: через 3 года зацветали и плодоносили 35 % особей в контроле и 30 % - в эксперименте, через 4 года и в контроле, и в опыте цвели и плодоносили 100 % особей. Результаты биометрических исследований генеративных особей показали, что различия между растениями, выращенными из размороженных и контрольных семян, оказались недостоверными по всем параметрам (табл. 19). Также не отмечено значительного изменения коэффициентов вариации показателей высоты и размеров ассимилирующих и репродуктивных органов. Вариабельность всех размерных характеристик оценивалась 2 баллами, масса семян - 1 баллом. Таким образом, криообработка семян не оказала влияния на рост, развитие, морфологическую изменчивость вегетативных и репродуктивных органов генеративных особей Microcerasus humilis. Philadelphus tenuifolius. Семена прорастали через 5-6 дней после посева, как в контроле, так и в эксперименте независимо от скорости замораживания. Проростки очень мелкие, в возрасте 10-12 дней имеют две овальные семядоли 2,5 мм длиной и 1,2 мм шириной, на коротких черешках; гипокотиль 5-6 мм длиной, переходящий в корешок. Чуть позднее появляются 2 первых настоящих супротивных листа. Прегенеративный период длится 3-4 года. По нашим наблюдениям, 20 % особей в контроле и 24-28 % - выращенных из семян, прошедших криообработку, зацветали на четвертом году жизни, на пятом -цвели 96 % и 100 % соответственно. Наблюдения, проводимые за ростом сеянцев Philadelphus tenuifolius в течение нескольких лет (рис. 20), показали, что в возрасте двух лет высота сеянцев в варианте быстрого замораживания - 24,9 см была достоверно меньше таковой у контрольных растений - 33,6 см (t=3,48, что на 95 % доверительном уровне превышает табличное t=2,01, п=25). Через год сеянцы достигли высоты 59,6 см и 65,5 см соответственно, различие опыта с контролем сгладилось (t=l,70) и в дальнейшем не выявлялось.
Медленное замораживание семян не Анализ биометрических показателей развития зрелых генеративных особей, выращенных в обоих вариантах замораживания семян, не подтвердил достоверности отличий с контрольными экземплярами (табл. 20). Экспериментальные растения по всем характеристикам оказались идентичны контрольным (рис. 21). Независимо от варианта опыта, вариабельность всех метрических характеристик генеративных особей можно оценить 1-2 баллами. Всхожесть семян, собранных с растений, выращенных в обоих вариантах эксперимента, достоверно не отличалась от всхожести в контроле. Следовательно, криоконсервация семян Ph. tenuifolius не оказало влияния на рост и развитие растений, изменчивость вегетативных и репродуктивных органов генеративных особей, качество продуцируемых семян. Rhododendron mucronulatum. Семена в контроле и каждом варианте эксперимента прорастали через 7-8 дней после посева. Проростки мелкие, в возрасте 18-20 дней имеют две овальные семядоли 2,0-2,5 мм длиной и 1,3-1,7 мм шириной, на черешках 0,5 мм длиной; гипокотиль 6-8 мм длиной. Первый настоящий лист продолговатый, в основании суженный, опушенный; появляется через 25-30 дней. Однолетние особи достигали высоты от 3,5 до 8,3 см и не отличались по внешнему виду в контроле и эксперименте (рис. 22). Через 4-5 лет и в контроле, и в опыте прегенеративныи этап развития заканчивался, и растения начинали цвести Наблюдения за ростом в высоту, морфометрическое изучение вегетативных и репродуктивных органов растений и последующий анализ полученных результатов показали, что в первый год плодоношения особи, выращенные из семян, подвергнутых криообработке в варианте быстрого замораживания, были близки к контрольным экземплярам по всем изученных параметрам, а растения, выращиваемые в варианте медленного замораживания, от контрольных достоверно отличались по ширине листа и длине семян (табл. 21). Степень варьирования высоты растений, размеров вегетативных и репродуктивных органов, а также качества семян в обоих вариантах опыта оценивалась 1-2 баллами. Несмотря на то, что семена, полученные в варианте медленного замораживания, были длиннее, их всхожесть не отличалась от контрольных, также как и всхожесть семян в варианте быстрого замораживания (табл. 21). Отмеченные выше достоверные отличия в варианте медленного замораживания (ширина листа, длина семян) с увеличением возраста генеративных особей исчезли (t=l,69 и t=l,51 соответственно, Р=95 %). Итак, независимо от скорости замораживания криообработка семян Rh. mucronulatum не оказала влияния на рост и развитие растений, а также на изменчивость вегетативных и репродуктивных органов генеративных особей и качество полученных семян. Rhododendron schlippenbachii.
Генеративные особи, выращенные из размороженных семян, не отличались от контрольных. У этого вида прегенеративныи этап развития закончился через 6-7 лет. Наблюдения за ростом и развитием растений, морфологическими особенностями вегетативных и репродуктивных органов, и анализ полученных данных не показали достоверных отличий зрелых генеративных особей в каждом варианте опыта от контрольных экземпляров. Независимо от скорости замораживания семян степень варьирования параметров высоты и размеров вегетативных и генеративных органов не превысила 2 балла. Глубокое замораживание не оказало влияния на размеры и качество полученных семян. Как в контроле, так и в опыте, при массе 1000 шт. равной 0,43-0,45 г прорастало около 90 % семян. Weigela praecox. Семена начинали прорастать через 6-7 дней после посева, как в контроле, так и в обоих вариантах замораживания. Проростки в возрасте 15 дней имели две яйцевидные семядоли до 3,0 мм длиной и 2,2 мм шириной, на черешках до 1 мм длиной; гипокотиль 7-8 мм длиной. Однолетние сеянцы достигали высоты в среднем 9,3 см в контроле, 10,9 см - в варианте быстрого и 9,8 см - в варианте медленного замораживания семян (п=25), при этом разница контроля с опытом была недостоверна (t=l,5 после быстрого и г=0,5 после медленного замораживания, Р=95 %). Многолетние наблюдения за ростом показали, что растения, выращиваемые из семян в обоих вариантах опыта, по высоте были близки растениям в контроле (рис. 23). Как в контроле, так и в каждом варианте скорости замораживания семян продолжительность прегенеративного периода развития составила 3-4 года, в пятилетнем возрасте цвели и плодоносили 100 % особей. Анализ показателей высоты генеративных особей и метрических характеристик их ассимилирующих и репродуктивных органов не выявил достоверных различий между растениями, выращенными из семян, подвергнутых замораживанию и контрольными экземплярами (табл. 22). Коэффициенты вариации всех показателей в опыте изменились не более чем на 5 % по сравнению с контролем. Вариабельность растений в обоих вариантах эксперимента оценивалась 1-2 баллами. Всхожесть семян, собранных с генеративных особей как в варианте быстрого, так и медленного замораживания, не отличалась от всхожести семян, полученных в контроле. Наши наблюдения показали идентичность темпов роста в высоту и развития особей W. ргаесох, выращенных из контрольных и размороженных семян (рис. 24). Криообработка семян не оказала влияния на морфологические особенности вегетативных и генеративных органов, репродуктивную способность выращенных растений и качество их семян.
