Содержание к диссертации
Введение 6-14
Глава 1. Генетическая структура и механизмы изменчивости 15-18
популяций узко- и широкоспециализированных возбудителей «гельминтоспориозных» пятнистостей злаков
1.1. Биолого-генетические особенности возбудителей
«гельминтоспориозных» пятнистостей злаков
(* 1.1.1. Pyrenophora teres 18-20
-
Pyrenophora tritici-repentis 1&-TI
-
Pyrenophora avenae 22-23
-
Cochliobolus sativus 23-25
1.2. Использование ДНК маркеров в решении проблем
таксономии и филогении фитопатогенных грибов
1.2.1. Полиморфизмы длин рестриктных фрагментов - 26-27
ПДРФ (RFLP)
1.2.2. Полиморфизм грибов по повторяющейся ДНК: ДНК- 27-30
фипгерпринтииг
-
Полиморфизм грибов порибДНК 30-33
-
Идентификагіия грибов с помощью видоспегщфичных 33-36 ДНК-проб. Видоспег\ифичиая ДНК у грибов.
# 1.2.5. Идентификация грибов на уровне вида с помощью 35-37
ПЦР
1,2.6. Различение «истинных» рас, «квазирас» и 37-45
внутривидовых групп грибов
1.3. Генетическая структура популяций фитопатогенных 45-47
грибов
1.31. Структура популяций грибов, не имеющих полового 47-49
процесса
1.3.2. Структура популяций грибов, имеющих половую 49-53
стадию, но преимугцественно размноо/сающихся
* бесполым путем
1.3.3. Структура популяций фитопатогенных грибов, 53-55
имеющих регулярный половой процесс
1.4. Генетика вирулентности и патогенности 55-61
фитопатогенных грибов: проблемы и перспективы
1.5 Механизмы расообразования у фитопатогенных 61
грибов
1.5.1 Молекулярные механизмы расообразования у 62
фитопатогенных грибов
1.5.1.1. Пластичность генома грибов. 62-72
Роль транспозонных элементов в пластичности генома
грибов
Ф Полиморфизм по длине и числу хромосом или
изменчивость кариотипов грибов
к*
Роль повторяющейся ДНК в изменчивости фитопатогенных грибов и отбор растением-хозяином,
-
Межвидовая гибридизация 72-73
-
Горизонтальный перенос генов 73-74
-
Роль репродуктивной изоляции в специализации грибов 74
1.5.2. Грибы рода Cochliobolus как модель для изучения 75-78
эволюции гемибиотрофных фитопатогенных грибов Глава 2. Материалы и методы
2.1. Материалы и стандартные методы исследований
-
Патогены и растения-хозяева 79-90
-
Методы анализа популяций гемибиотрофных 90-97 фитопатогенных грибов по ДНК маркерам
-
Методы анализа популяций грибов по типам 97-99 спаривания
-
Статистическая обработка результатов 99-100
-
Методы изучения половой рекомбинации у 100-102 гемибиотрофных патогенов злаков
-
Техники рекомбинантпых ДНК, 103
-
Получение мутантов С. sativus действием у-лучей. 103
2.2. Методы, разработанные для выполнения 105
диссертационной темы
-
Модели генетического контроля вирулентности 103
-
Выявление генетического разнообразия устойчивости 104-109 при анализе мейотического потомства гриба
-
Создание клонотеки видоспеїіифичньїх повторов ДНК 110-111 С. sativus
-
Анализ клонированных ДНК и отбор повторяющихся 111 видоспецифичных ДНК клонов.
Глава 3, Изучение таксономии и филогении фитопатогенных
грибов с помощью молекулярно-генетических методов
3.1. Полиморфизм рибДНК и повторяющейся ДНК 112-121
возбудителей листовой пятнистости ячменя и пшеницы Pyrenophora teres, P. graminea и P. tritici-repentis
Ъ2. Идентификация видов грибов с использованием 121-125
видоспецифичных ДНК фрагментов (на примере Cochliobolus sativus)
-
Идентификация видов фитопатогенных грибов 126-132 методом УП-ПЦР
-
Идентификация и анализ филогенетических 133-138 отношений различных форм P. teres (Ї. sp. teres, f. sp. graminea, f. sp. maculatd),
-
Филогенетические отношения между видами рода 138-142
t>
3.6. Глава 4.
4.1,
Cochliobolus, специализированных к разным видам
злаков
Заключение.
Влияние растения-хозяина на молекулярно-
генетическую структуру популяций возбудителей
пятнистостей злаков
Влияние генотипа сорта на структуру популяций
возбудителя сетчатой пятнистости ячменя Pyrenophora
teres f. sp. teres по анонимным ДНК локусам
>
Структура популяций P. teres/, sp. teres по типам спаривания.
-
Внутривидовая изменчивость Pyrenophora tritici- 153-160 repentis ~ возбудителя желтой пятнистости пшеницы. Структура популяций по анонимным ДНК локусам
-
Влияние генотипа сорта на структуру популяций 161-166 возбудителя красно-бурой пятнистости овса
Pyrenophora avenae по анонимным ДНК локусам
4.4. Влияние вида растения-хозяина на структуру 167-178
популяций возбудителя темно-бурой пятнистости
злаковых Cochliobolus sativus по анонимным ДНК локусам . Структура популяций С. sativus по распространению 178-184 аллелей типов спаривания
4.5. Обсуждение 184
-
Сравнительный анализ популягщй гемибиотрофных 184-186 патогенов по вирулентности и ДИК локусам
-
Характеристика структуры популяций 186-188 гемибиотрофных патогенов злаков - возбудителей «гельминтоспориозпых» пятнистостей листьев
-
Влияние географического фактора па структуру 188-190 популяций
-
Влияние генотипа растения-хозяина на структуру 190-192 популяций
-
Распределение аллелей типов спаривания в популяциях 192-194
-
Выводы 194-195
Глава 5 Изучение генетического потенциала изменчивости признака вирулентности, выявляемого у
фитопатогенных грибов при половой рекомбинации 196
5.1. Наследование вирулентности Pyrenophora teres f. sp. 197
teres к ячменю
5.1.1. Особенности полового процесса P. teres f.sp teres в 197-208
лабораторных условиях
5.1.2. Генетический анализ вирулентности к устойчивым 208-224
сортам ячменя возбудителя сетчатой пятнистости
P. teres f.sp. teres
5.1.3. Выявление идентичных генов аеирулентности у 224-231
изолятов возбудителя сетчатой пятнистости Р.
teres f.sp. teres к сортам ячменя
5.1.4. Комплементарность генов устойчивости и 232-234
вирулентности в патосистеме Hordeum vulgare-
Pyrenophora teres
5.2. Наследование вирулентности Cochliobolus sativus к 235
ячменю и пшенице
-
Особенности полового процесса С. sativus в 235-240 лабораторных условиях
-
Генетический анализ вирулентности С. sativus к 240-244 сортам ячменя
-
Выявление идентичных генов аеирулентности у 244-249 изолятов С. sativus к различным сортам ячменя
-
Генетический анализ вирулентности С. sativus к 250-252 сортам пшеницы
-
Выявление идентичных генов аеирулентности у 252-259 изолятов С. sativus к различным сортам пшеницы
5.3. Обсуждение 260-271
Глава 6 Физиологическая и молекулярно-генетическая
специализация фитопатогенных грибов на примере Cochliobolus sativus
-
Физиологическая специализация С. sativus к 272-276 различным видам злаков
-
Анализ фертильности и мейотической сегрегации 276-286 ДНК маркеров в межпопуляционных гибридах С.
sativus
-
Видоспецифичные ДНК повторы С. sativus и их связь 286-295 с патогенностью
-
Молекулярно-генетическая специализация популяций 295-297 С. sativus к различным злакам
6.5. Обсуждение 298-302
Заключение 302-305
Выводы 306-308
Список цитируемой литературы 310-337
Приложение 338-354
Введение к работе
Актуальность темы.
Фундаментальные знания о механизмах взаимоотношений паразита и хозяина и о направлениях микроэволюционных процессов у фитопато генных грибов могут служить теоретической базой для создания сортов с длительной устойчивостью. Изучение механизмов специализации представляет особый интерес для прогнозирования появления новых форм и видов фитопатогенных грибов.
К числу наиболее вредоносных заболеваний ряда злаковых культур относятся «гельминтоспориозные» пятнистости листьев, вызываемые гемибиотрофными грибами родов Pyrenophora и Cochliobolus, анаморфы которых (Drechslera и Bipolaris) ранее относили к роду Helminthosporium. В последние годы наблюдается тенденция в усилении вредоносности и распространения гемибиотрофных патогенов на зерновых культурах. В ряде регионов РФ потери урожая ячменя от сетчатой пятнистости, вызываемой грибом P. teres Drechs., могут достигать 20- 60%, от темно-бурой пятнистости, вызываемой С. sativus (Ito & Kuribayashi) Drechs. ex Dastur, недобор урожая достигает 30-40% при значительном снижении качества зерна (Кашемирова, 1995). Темно-бурая пятнистость пшеницы широко распространена в Приморском крае и на Дальнем Востоке. В Казахстане потери урожая пшеницы от С. sativus доходили до 43.8% (Здражевская, Шугуров, 1991), в странах Азии, Африки и Южной Америки - до 87 % (Hetzler et al., 1991). В настоящее время отмечается нарастающее распространение и вредоносность желтой пятнистости пшеницы, вызываемой грибом P. tritici-repentis (Died.) Shoemaker. Потери зерна от этого заболевания в условиях эпифитотии достигают 65% (Hirrell et al., 1990). Также наблюдается тенденция в усилении вредоносности красно-бурой пятнистости овса, вызываемой P. avenae Ito et Kuribay., которая может выражаться в потере урожая до 50 % и ухудшении качества зерна (Obst, Huber, 1988).
7 Род Helminthosporium исторически включал различные роды грибов, объединенные по формальным признакам - морфологии конидиального аппарата и симптомам заболеваний. На протяжении ряда лет происходило уточнение и изменение таксономического статуса видов, входящих в этот род грибов (Drechsler, 1923; Ito, 1930; Хохряков, 1953; Shoemaker, 1959; Sivanesan, 1987). Однако морфологический подход не мог обеспечить решения многих проблем идентификации и филогении видов грибов в связи с их изменчивостью, обусловленной как нестабильностью генома, так и биологическими особенностями, связанными с типами размножения и адаптацией к новым растениям-хозяевам. Специализация является одним из путей симпатрического видообразования грибов (Хохряков, 1953; Дьяков, 1981). Механизмы специализации гемибиотрофных паразитов и, в частности, возбудителей «гельминтоспориозных» пятнистостей злаков остаются практически не изученными. Одна из причин такого положения, видимо, связана с таксономическими проблемами, возникающими в результате внутривидовой изменчивости и освоения паразитами новых видов растений-хозяев. Поэтому существует объективная необходимость в разработке новых методов идентификации видов грибов, основанных на использовании молекулярных критериев видового разнообразия - структурных особенностей ДНК, что могло бы служить инструментом, позволяющим определять видовой или внутривидовой (форма, раса) статус паразита, освоившего новый вид растения, и его филогенетическое положение по отношению к предполагаемой предковой форме.
Виды паразитов, имеющие широкий спектр растений-хозяев (например, С. sativus, поражающий все виды злаков), обладают потенциальной возможностью эволюционировать в направлении специализации к виду растения-хозяина.
Виды паразитов, поражающие преимущественно конкретные виды растений хозяев {Pyrenophora teres -ячмень, P. tritici-repentis ~ пшеницу, Р. avenae - овес), по-видимому, уже прошли в своем эволюционном развитии
8 этап специализации. Однако внутривидовая дивергенция этих видов продолжается. Особый интерес представляет уникальный пример внутривидовой дивергенции P. teres, связанной со специализацией паразита по симптомам заболевания (f. sp. teres вызывает сетчатую, f. sp. metadata - округлую и f. sp. graminea - полосатую пятнистости).
Скорость и направленность микроэволюционных процессов, ведущих к специализации фитопатогенных грибов, определяются их эволюционным потенциалом, который может быть вскрыт путем изучения структуры популяций и генетической детерминации признаков патогенности и вирулентности у паразитов.
Анализ структуры популяций паразитов по комплексу признаков позволяет выявить роль генотипа сорта и вида растения-хозяина в формировании их генофонда. Наиболее изучена популяционная изменчивость по вирулентности у грибов P. teres и С. sativus, однако исследования генетической структуры популяций и генетики вирулентности этих паразитов находятся на начальной стадии. Совершенно отсутствуют сведения о генетической структуре популяций возбудителей P. tritici-repentis и P. avenae.
Изучение механизмов расообразования и адаптации патогенов к новым видам растений-хозяев особенно актуально в современных условиях загрязнения окружающей среды и глобального изменения климата, которые могут индуцировать генетические изменения микроорганизмов.
Цель работы — выявить молекулярно-генетические механизмы специализации к видам и сортам растений-хозяев возбудителей «гельминтоспориозных» пятнистостей злаков.
Для достижения поставленной цели было необходимо решить ряд задач;
1. Разработать экспресс-метод молекулярной идентификации видов и внутривидовых форм грибов.
9 2.Сравнить внутривидовое разнообразие узко- и широкоспециализированных гемибиотрофных паразитов.
3. Определить влияние генотипа растения-хозяина на генетическую структуру популяций узко- и широкоспециализированных видов фитоп ато генных грибов (P. teres, P. tritici-repent'ts, P. avenae в сравнении с С, sativus) по локусам, выявляемым методами молекулярного ДНК фингерпринтинга.
4. Изучить особенности полового процесса внутривидовых форм P. teres - f. sp. teres и f. sp. maculata и филогенетические отношения между ними.
5. Изучить особенности полового процесса С. sativus и изучить филогенетические отношения между С. sativus и рядом узкоспециализированных видов рода Cochliobolus,
Изучить наследование признака вирулентности P. teres к ячменю и С. sativus к ячменю и пшенице
Выявить генетические факторы, влияющие на процесс адаптации С. sativus к различным видам растений-хозяев.
Научная новизна работы.
Предложен оригинальный метод молекулярной идентификации видов и внтривидовых форм грибов, который заключается в сравнении спектров ДНК-маркеров, выявляемых методом полимеразной цепной реакции с универсальными праймерами (УП-ПЦР) и установлении гомологии продуктов УП-ПЦР с помощью блот-гибридизации. Использование этого метода расширило возможности идентификации видов и внутривидовых форм гемибиотрофных паразитов, адаптирующихся к новым растениям-хозяевам.
Впервые проведено сравнительное изучение структуры популяций 4-х видов гемибиотрофных патогенов злаков {Pyrenophora teres, P. tritici-repentis, P. avenae и Cochliobolus sativus), различающихся по уровню специализации к растениям-хозяевам, с использованием ДНК-маркеров и выявлены различия
10 между ними по доле клональной фракции и уровню среднего генного разнообразия на локус.
Популяции узкоспециализированных паразитов P. teres f. sp. teres, P. tritici-repentis и P. avenae характеризуются меньшей клональной фракцией (0-60 %) и большим значением среднего генного разнообразия на локус (Н = 0.11-0.30), чем популяции широко специализированного вида С sativus (клональная фракция составляет 75-90 % и Н = 0.061-0.192).
Выявлена специализация популяций С. sativus к пшенице, культурному и дикорастущему ячменю, которая на данном этапе микроэволюции проявляется в виде повышенной агрессивности к "своим" хозяевам, различиях в генетической структуре популяций, а именно в преобладании клонов с определенными генотипами, а также в нарушениях мейоза у «межпопуляционных» гибридов.
Снижение фертильности гибридов между разными формами P. teres (f. sp. teres и f.sp. maculata), и снижение жизнеспособности их мейотического потомства является следствием внутривидовой дивергенции в результате специализации форм гриба. На основании изучения внутривидовой изменчивости грибов P. teres на уровне ДНК выведены филогенетические отношения между формами — f. sp. teres, f. sp. maculata и f. sp. graminea, и доказана их дивергенция на уровне геномов.
На основании выведенных филогенетических отношений между С sativus и близкородственными узкоспециализированными видами грибов р. Cochliobolus показана роль С. sativus в качестве предкового вида в эволюции грибов рода Cochliobolus.
Впервые изучено распределение типов спаривания в популяциях P. teres и С. sativus, обитающих на разных видах злаков. В популяциях обоих видов выявлено соотношение типов спаривания 1:1, что свидетельствует о прохождении половой стадии этих грибов в природе.
Впервые изучено наследование вирулентности у P. teres к 9 генотипам ячменя и С. sativus к 11 генотипам ячменя и 8 генотипам пшеницы. Показано, что взаимодействие генов авирулентности и устойчивости в патосистеме Н. vuigare — P. teres f. sp. teres осуществляется по типу ген-на-ген, согласно теории Флора (Fior, 1947). Кроме того, у P. teres f. sp. teres выявлены как специфические, так и неспецифические гены-супрессоры по отношению к генам авирулентности. Показан более высокий полиморфизм генов устойчивости и генов авирулентности в патосистеме Н. vuigare - P. teres f. sp. teres по сравнению с патосистемами Н. vuigare - С. sativus и Т. aestivum — С. sativus.
Практическая значимость результатов исследований
Разработан экспресс-метод молекулярной идентификации видов и внутривидовых форм грибов, основанный на сравнении спектров ДНК-маркеров, выявляемых методом УП-ПЦР, и установлении гомологии продуктов УП-ПЦР с помощью блот-гибридизации.
Созданы коллекции аскоспоровых изолятов P. teres и С. sativus, которые могут быть использованы для оценки разнообразия генов устойчивости у доноров устойчивости ячменя к обоим патогенам и пшеницы к С. sativus и создания конвергентных сортов с большим числом генов устойчивости.
На основании результатов генетического анализа вирулентности созданы пулы ДНК изолятов P. teres, различающихся по вирулентности к сортам с различными генами устойчивости для проведения молекулярной идентификации и картирования генов авирулентности.
Разработан метод анализа генов устойчивости с использованием пар генетически охарактеризованных штаммов патогена и их мейотического потомства для патосистем Н. vuigare - P. teres f. sp. teres, H. vuigare - С. sativus и Т. aestivum - С. sativus.
12 Апробация работы и публикации результатов исследования.
Результаты работы докладывались и обсуждались на Всесоюзных конференциях "Мицелиальные грибы (физиология, биохимия, биотехнология)" (1983, Пущино); "Молекулярные и генетические механизмы взаимодействия микроорганизмов с растениями" (1989, Пущино); VII Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (1990, Пущино); 12-ой Международной конференции по микологии и лихенологии (1993, Вильнюс); VI Совещании "Вид и его продуктивность в ареале" (1993, С-Петербург); 2-м рабочем совещании по филогенетической систематике (1994, Аарус, Дания); 13-м совещании общества Willi Hennig (1994, Копенгаген, Дания); I Всероссийском съезде по защите растений (1995, С-Петербург); XIY Съезде Эукарпия "Адаптация в селекции" (1995, Jyvaskyla, Финляндия); Международном симпозиуме «Современные проблемы в устойчивости злаков к болезням» (2002, С-Петербург); Первом съезде микологов России (Москва, 2002); 11-ом Международном съезде по взаимоотношениям растений и микроорганизмов (2003, С-Петербург); 9-ом Международном симпозиуме по генетике ячменя (2004, Брно, Чехия); Международной научно-практической конференции (Краснодар 2004); III съезде ВОГИС (2004, Москва).
Работа была поддержана грантом ГНТП «Перспективные направления генетики» 1995-1997 гг., грантом RSS (Group Research Support Scheme Grant) 1367/1997, а также программой фундаментальных и приоритетных прикладных исследований ВИЗР «Фитосанитарная устойчивость агроэкосистем», международным проектом «Фитосанитарная стабилизация» министерства науки и образования РФ, грантами РФФИ № 00-04-49406 и № 03-04-49082, Федеральным Министерством защиты прав потребителей, продовольствия и сельского хозяйства Федеративной Республики Германии.
13 Публикации. По материалам исследований опубликовано 114 работ, в том числе по теме диссертации - 86, из них 42 — в рецензируемых печатных изданиях, 2 методических указаний, 1 патент и 1 авторское свидетельство.
Объем и структура диссертации
Работа состоит из введения, шести глав, заключения, выводов, списка литературы и приложения; содержит 350 страниц машинописного текста, 93 таблиц (из них 20 даны в Приложении) и 61 рисунка. Список использованной литературы включает 419 источников, из них 61 на русском языке.
Положения,, выносимые на защиту.
Молекулярно-генетические механизмы процесса специализации широкоспециализированного вида С. sativus заключаются в дивергенции геномов изолятов, адаптированных к виду растения-хозяина, ведущей к образованию хозяин-специфичной молекулярно-генетической структуры популяции патогена. Процесс специализации обусловлен наличием в популяциях паразита набора специфических аллелей генов вирулентности к разным видам растений-хозяев, а также нарушениями мейоза в скрещиваниях межу изолятами различного происхождения по растению-хозяину.
Молекулярно-генетические механизмы специализации P. teres заключаются в дивергенции геномов изолятов, вызывающих различные симптомы, которая сохраняется благодаря наличию репродуктивной изоляции. Возникновение новых вирулентных рас у P. teres при скрещивании авирулентных изолятов происходит в результате рекомбинационных процессов, затрагивающих как сами гены авирулентности, так и гены-супрессоры, влияющие на их экспрессию.
3. Патосистемы, включающие широкоспециализированный патоген характеризуются меньшим разнообразием генотипов устойчивости и
14 вирулентности по сравнению с патосистемами, включающими узкоспециализированные патогены 4. Метод молекулярной идентификации видов и внутривидовых форм грибов, основанный на сравнении спектров ДНК-маркеров, выявляемых в УП-ПЦР, и установлении гомологии продуктов УП-ПЦР с помощью блот-гибридизации.
Исследования проводились в 1978-2005 гг. во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты растений по программам ГНТП и программе фундаментальных и приоритетных прикладных исследований РАСХН, а также по договорам о сотрудничестве с ПИЯФ РАН, институтом фитопатологии (Ашерслебеп, Германия), Центром сельскохозяйственных исследований (Йокиойнен, Финляндия).
Некоторые разделы работы были выполнены совместно с сотрудниками лаборатории иммунитета растений к болезням (ВИЗР) Афанасенко О.С. , Михайловой Л.А., Тимофеевой Е.Н., Гоголевой С.Г., Сердюк А.А., Филатовой О.А., Петровой А. С, а также Булатом С.А. (ПИЯФ, РАН), О. Маннинен и М. Серениус (МТТ, Финляндия), Д. Копаньке и И. Крамер (ИФ, Германия) и Б. Стеффснсоном (США).
