Содержание к диссертации
-
ВВЕДЕНИЕ 7
-
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 14
2.1. СТРУКТУРА И СВОЙСТВА Na+, К+-АТФазы 14
2.2. ВЛИЯНИЕ ИНФРАКРАСНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА
БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОБЪЕКТЫ 19
2.3. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О НТФ II ИХ
ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ РОЛИ В РАЗВИВАЮЩЕЙСЯ II ЗРЕЛОЙ
НЕРВНОЙ СИСТЕМЕ 22
-
Концепция действия нейротрофнчесюїх факторов 22
-
Семейство нейротрофинов 24
2.4. ИНГИБИТОРЫ СЕРИНОВЫХ ПРОТЕАЗ (СЕРППНЫ) 38
2.5. КОМПОНЕНТЫ СЕКРЕТА СЛЮННЫХ ЖЕЛЕЗ
МЕДИЦИНСКОЙ ПИЯВКИ 42
3. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 62
3.1. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ НЕРВНОЙ ТКАНИ ПРИ
ИССЛЕДОВАНИИ НЕЙРОТРОФИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ 62
3.1.1. Органотнпическая культура сшшальных ганглиев как
тест-система для исследования нейротрофических свойств
биологически активных веществ и воздействий 63
3.2. ПОДГОТОВИТЕЛЬНЫЕ ЭТАПЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
НЕРВНОЙ ТКАНИ 67
-
Состав и приготовление питательной среды 67
-
Получение коллагена и коллагеновой подложки 67
3.3. ВЫДЕЛЕНИЕ ТКАНЕЙ И МЕТОДЫ
КУЛЬТИВИРОВАНИЯ 69
3.3.1. Органотипическая культура спинальных ганглиев
куриных эмбрионов 70
-
МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ II МОРФОМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ РАЗВИТИЯ ЭКСПЛАНТАТОВ НЕРВНОЙ ТКАНИ , 71
-
МЕТОД БИЛЫНОВСКОГО-ГРОС 75
-
Приготовление аммиачного раствора 75
-
Метод окраски 75
-
ГЕНЕРАТОР ИК ИЗЛУЧЕНИЯ 77
-
ВЫДЕЛЕНИЕ ДЕСТАБИЛАЗЫ 78
-
ВЫДЕЛЕНИЕ ЭГЛИНА С 79
-
Получение культуры 79
-
Выделение эглина С 79
4. РЕЗУЛЬТАТЫ 82
4.1. РАЗВИТИЕ ЭКСПЛАНТАТОВ СПИНАЛЬНЫХ ГАНГЛИЕВ
10-12-ДНЕВНЫХ КУРИНЫХ ЭМБРИОНОВ В
ОРГАНОТИПИЧЕСКРЙ КУЛЬТУРЕ ТКАНИ 82
4.2. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ СЕЛЕКТИВНОГО
ИНГИБИТОРА Na\ К+АТФазы ОУАБАИНА НА РОСТ
НЕЙРИТОВ СЕНСОРНЫХ НЕЙРОНОВ СПИНАЛЬНЫХ
ГАНГЛИЕВ 10-12-ДНЕВНЫХ КУРИНЫХ ЭМБРИОНОВ 85
4.3. ОЦЕНКА ДЕЙСТВИЯ ИК ИЗЛУЧЕНИЯ НА РОСТ
НЕЙРИТОВ В ОРГАНОТИПИЧЕСКОЙ КУЛЬТУРЕ
СПИНАЛЬНЫХ ГАНГЛИЕВ 91
4.4. ИССЛЕДОВАНИЕ НЕИРОТРОФИЧЕСКОИ АКТИВНОСТИ
ДЕСТАБИЛАЗЫ В ОРГАНОТИПИЧЕСКОЙ КУЛЬТУРЕ
СПИНАЛЬНЫХ ГАНГЛИЕВ 93
4.5. ИЗУЧЕНИЕ НЕЙРОТРОФИЧЕСКИХ СВОЙСТВ
ИНГИБИТОРОВ СЕРИНОВЫХ ПРОТЕАЗ: ДБЕЛЛАСТАЗИНА,
ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНОГО БДЕЛШША В и ЭГЛИНА С В
КУЛЬТУРЕ СПИНАЛЬНЫХ ГАНГЛИЕВ КУРИНЫХ
ЭМБРИОНОВ 100
4.6. ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ
ДЕСТАБИЛАЗЫ II ИНГИБИТОРА СЕРИНОВЫХ ПРОТЕАЗ
ДБЕЛЛАСТАЗИНА НА РОСТ НЕЙРИТОВ 106
4.7. ОЦЕНКА ВОЗМОЖНОЙ РОЛИ Na+, К+-АТФазы КАК
ТРАНСДУКТОРА СИГНАЛА В КУЛЬТУРЕ СЕНСОРНЫХ
НЕЙРОНОВ 10-12-ДНЕВНЫХ КУРИНЫХ ЭМБРИОНОВ 114
-
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 118
-
ВЫВОДЫ 130
-
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 132
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АХ - ацетилхолин
БПА - белок предшественник амилоида
ИК излучение - инфракрасное излучение
ИП - индекс площади
МРНК - матричная рибонуклеиновая кислота
НТ-3, -4 - нейротрофин-3, -4
НТФ - нейротрофический фактор
ПМНТФ - производный из мозга нейротрофический фактор
ФРН -фактор роста нервов
ФРФ - фактор роста фибробластов
ФРЭ - фактор роста эритроцитов
ЦНС - центральная нервная система
ЦНТФ - цилиарный нейротрофический фактор
о^М - а2-макроглобулин
GAP-43 - белок связанный с ростом - 43
gpl30 - гликопротеин-130
НМВ - High Molecular Weight Bdellin
LDTI - Leech-Derived Tryptase Inhibitor
pl40 (PMO*1^) - высокоаффинный рецептор к ФРН
р75, (p75LNGFR) - низкоаффинный рецептор к ФРН
PAR - рецептор, активируемый протеиназой
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Одним из ключевых вопросов физиологии является изучение тонких механизмов регуляции роста, развития и жизнедеятельности нервных клеток. Особый интерес вызывает исследование Na+, К+-АТФазы как мембранной структуры, которая может выполнять не только свою непосредственную функцию по поддержанию градиентов концентраций ионов натрия и калия, но может играть роль трансдуктора сигнала (Хіе, 2001). Недавно было показано, что в сенсорных нейронах млекопитаюпщх эта молекулярная структура участвует в мембранной сигнализации при передаче сигналов от опиоидных рецепторов к медленным натриевым каналам (Крылов и др., 1999). В настоящее время известно, что Na+, К+-АТФаза является важным фактором в механизмах, препятствующих развитию гипоксии и утомления (Clausen, Nielsen, 1994; Лопатина и др., 2000). Активность Na+, К+-АТФазы подвержена медиаторному контролю. Ацетилхолин (АХ), катехоламины и инсулин стимулируют активность фермента (Голиков и др., 1985; Clausen, Nielsen, 1994; Mobasheri et al, 2000).
На регуляцию процессов жизнедеятельности нервных клеток могут также оказывать влияние такие факторы, как инфракрасное (РІК) излучение и вещества с нейротрофическим действием. Однако, механизм действия ИК излучения до сих пор не изучен, хотя высказан ряд предположений о том, что ИК излучение неспецифически может участвовать в регуляции трофических функций различных тканей. Электрофизиологические данные, полученные на мембране сенсорных нейронов холоднокровных (Павленко и др., 1975) и теплокровных (Плахова и др., 2003), свидетельствуют о том, что возможной мишенью ИК излучения может быть натриевый насос.
К нейротрофическим факторам (нейротрофинам), участвующим в регуляции морфофункциональных свойств нервных клеток, относится группа низкомолекулярных белков, выделяющихся из тканей-мишеней. В последнее время накопилось много данных о том, что нейротрофическим действием могут обладать не только вещества относящиеся к семейству нейротрофинов, но также протеазы и их ингибиторы (Krystosek, Verall, Seedes, 1988; Shea, Beermann, Nixon, 1992; Gill et al., 1998; Fumagalli et al., 1999). В секрете слюнных желез медицинской пиявки содержится более 80 физиологически активных веществ, среди которых имеются протеазы и ингибиторы протеаз (Khallil, Bagy, 1991; Zavalova et al., 1997; Баскова, Завадова, 2001). Влияние ферментов секрета слюнных желез на процессы регенерации нервной ткани до настоящего времени не изучено, несмотря на то, что лечение медицинскими пиявками приводит к частичному или полному восстановлению функций, утраченных вследствие органического поражения нервной ткани (Исаханян, 1991; Крашенюк и др., 1997). По-видимому, секрет слюнных желез медицинской пиявки может обладать не только тромболитическими свойствами.
Для исследования факторов регулирующих рост и развитие нервных клеток используют органотипическую культуру спинальных ганглиев млекопитающих и птиц (Levi-Montalchini, 1968; Чалисова и др., 1999). Применение метода культуры нервной ткани позволяет исследовать эффекты ИК излучения и действия биологически активных веществ в «чистом» виде.
ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью данной работы являлось исследование механизма регуляции роста нейритов в органотшшческой культуре спинальных ганглиев. Были поставлены следующие задачи:
Исследовать влияние селективного ингибитора Na+, К+-АТФазы оуабаина на рост нейритов сенсорных нейронов спинальных ганглиев 10-12-дневных куриных эмбрионов.
Оценить действие ИК излучения на рост нейритов в органотипической культуре спинальных ганглиев.
3. Исследовать нейротрофическую активность дестабилазы - компонента секрета слюнных желез медицинской пиявки - в органотипической культуре спинальных ганглиев.
4. Изучить нейротрофические свойства ингибиторов сериновых протеаз: бделластазина, высокомолекулярного бделлина В и эглина С в культуре спинальных ганглиев куриных эмбрионов.
Исследовать механизм действия дестабилазы и ингибитора сериновых протеаз бделластазина на рост нейритов.
Оценить возможную роль Na+, К+-АТФазы как трансдуктора сигнала в культуре сенсорных нейронов 10-12-дневных куриных эмбрионов.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА.
В работе впервые исследовано воздействие ИК излучения низкой интенсивности на сенсорные нейроны спинальных ганглиев 10-12-дневных куриных эмбрионов. Впервые показано, что возможной мишенью действия ИК излучения, ингибирующего рост нейритов в соме сенсорных нейронов, является Na+, К+-АТФаза. Полученные результаты свидетельствуют о том, что аЗ-изоформа в мембране сенсорных нейронов в эмбриональный период играет такую же важную роль, как и al-изоформа во взрослом организме.
Обнаружены неспецифические нейротрофические свойства компонентов секрета слюнных желез медицинской пиявки (дестабилазы, бделластазина, высокомолекулярного бделлина В и эглина С), наличие которых позволяет объяснить механизм положительного действия гирудотерапии при лечении заболеваний, связанных с патологиями нервной ткани.
Основные положения, выносимые на защиту: аЗ-изоформа Na+, К+-АТФазы в мембране сенсорных нейронов в эмбриогенезе (10-12 дней) играет такую же важную роль, как и аі-изоформа взрослого организма.
ИК излучение низкой интенсивности полностью блокирует рост нейритов в органотипической культуре сенсорных нейронов 10-12-дневных куриных эмбрионов.
Неспецифическое нейротрофическое действие компонентов секрета слюнных желез медицинской пиявки (дестабилазы, бделластазина, высокомолекуляного бделлина В, эглина С) лежит в основе положительного эффекта гирудотерапии при лечении нейродегенеративных заболеваний и опосредуется через активацию высокоаффинных рецепторов фактора роста нервов. Na+, К+-АТФаза принимает участие в регуляции роста нейритов сенсорных нейронов спинальных ганглиев и внутриклеточной сигнализации.
НАУЧНО-ОТАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.
Полученные экспериментальные данные вносят вклад в понимание роли, которую играет Na , К -АТФаза в регуляции процессов роста, развития и дифференцировки нервных клеток. Полученные результаты впервые объясняют механизм положительного эффекта трудотерапии при лечении заболеваний, обусловленных нарушениями проведения сигналов в нервной системе. Применение ИК излучения низкой интенсивности, может быть рекомендовано при лечении некоторых воспалительных процессов различной этиологии. Результаты исследований могут быть использованы при создании лекарственных препаратов нового поколения и при разработке медицинских приборов (лазеров) для низкоинтенсивной лазерной терапии.
Материалы диссертации могут быть использованы в курсах лекций в медицинских и биологических ВУЗах. АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные положения диссертации доложены на VII научно-практической конференции ассоциации гирудологов, Москва, 2001; на 10 международной конференции «СПИД, рак и родственные проблемы», Санкт-Петербург, 2002; на заседании Санкт-Петербургского общества физиологов, Санкт-Петербург, 2002; на IV международной конференции по функциональной нейроморфологии, Санкт-Петербург, 2002; на межлабораторном заседании отдела сенсорных систем Института физиологии им. И.П. Павлова РАН 23 января 2003 г.
Содержание диссертации изложено в 8 печатных работах. СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов исследований, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 165 страницах машинописного текста, содержит 20 рисунков и 1 таблицу. Библиографический указатель состоит из 212 источников.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
